Antigén szervezetbe bejutó mindazon corpuscularis vagy solubilis idegen struktúra, amely immunreakciót vált ki Antitest az antigénekkel szemben az immunválasz során termelődött fehérjék (immunglobulinok) Humorális immunválasz antigénekkel szemben immunglobulinok képződnek
Cél: a kórokozó (testidegen mikroorganizmus) eltávolítása Immunválasz a felismert antigén eliminálására (semlegesítésére és/vagy lebontására) szerveződik
A kórokozók felismerése Az immunválasz kialakításában részt vevő komponensek mozgósítása Tényleges eltávolítás folyamata
Az antigénre nem specifikus sejtes elemek: - különböző típusú fagocitáló sejtek - természetes ölő (NK) sejtek Az antigénre nem specifikus humorális faktorok: - citokinek - komplement rendszer
Az antigénre specifikus sejtes elem a lymphocyta, mely a felszínén az antigén felismerésére alkalmas receptorkészletet hordoz Az antigénre specifikus humorális faktorok az immunglobolinok
Antigén kötőhely Könnyűlánc Nehézlánc
ASPECIFIKUS (VELESZÜLETETT) IMMUNITÁS SPECIFIKUS (SZERZETT) IMMUNITÁS Antigén-independens Antigén-dependens Azonnali válasz Késleltett válasz NINCS immunológiai memória VAN immunológiai memória
Primer immunválasz Az immunrendszer első találkozása az adott antigénnel Lassabban alakul ki Alacsonyabb Immunglobulin-szint jön létre Hamarabb lecseng Domináns immunglobulin: IgM
Szekunder immunválasz Második (sokadik) találkozás ugyanazzal az antigénnel Gyorsabban alakul ki (memóriasejtek!) Magasabb Immunglobulin-szint jön létre Tovább perzisztál Domináns immunglobulin: IgG
Szérum ellenanyag mennyisége Reinfekció Hetek
antigén - antitest specifikus kapcsolódása képződő immunkomplex detektálása egyik komponens a betegből származik, a másikat mi adjuk a reakcióközeghez: antigén kimutatás antitest kimutatás
IgG és IgM elkülönítése A friss fertőzés (IgM) vagy lezajlott fertőzés (IgG) kimutatása Védőoltás hatékonyságának ellenőrzése Beküldött minta: teljes vér
IgM és IgG Az egyén még nem találkozott a patogénnel Nincs védettség az egyén fogékony IgM + és IgG Akut, friss, az adott patogénnel először fertőződik Kezelés szükséges lehet Teratogén kórokozók és terhességi szűrővizsgálatok! (TORCH) IgM és IgG + Régi fertőzés (vagy találkozás a patogénnel), az egyén védett (immunis) Vakcina révén kialakított védettség IgM + és IgG + Friss fertőzés átfedő szakasza Korábbi fertőzés (vagy találkozás) utáni újabb fertőzés (reinfekció)
Immunkromatográfiás eljárás Agglutináció (flokkuláció) ELISA technikai megoldások: Hagyományos (indirekt) Capture Capture one step Reverz (kompetitív) (hepatitis szerológiában mind fellelhető)
Immunkromatográfiás eljárás www.webshop.vitani.hu A FAST-STEP DUO ROTA-ADENO TESZTLAP egy síkáramlású, gyors immunkromatográfiás teszt a Rotavírus és az Adenovírus kvalitatív kimutatására humán székletből. Pozitív Negatív www.vetnetinfo.com Invalid
Definíció: agglutináció alatt a korpuszkuláris antigének ellenanyagokkal történő kapcsolódásakor létrejövő összecsapódást értjük. antigén kimutatás (Streptococcus tipizálás) ellenanyag kimutatás (RPR)
Szubsztrát (pl.: hepatitis C ellenanyag kimutatás)
1. Szilárd fázis inkubációja, ha a minta tartalmaz Szilárd fázishoz kötött Ag-re sepcifikus antitesteket azok az Ag-hez kötődnek 2. Mosási lépés: a minta egyéb komponenseinek eltávolítása 3. Második inkubáció a kikötődött antigén specifikus ellenanyag, enzimmel (tormaperoxidáz) konjugált anti-humán antitesttel való kötődése 4. Szubsztrát hozzáadása után reakcióba lép az enzimmel és látható jelet ad, mely arányos a mintában jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok mennyiségével Szubsztrát Primer antitest Enzimmel konjugált szekunder antitest www.piercenet.com
Enzimmel konjugált monoklonális ellenanyaggal kapcsolt rekombináns HBcAg Szubsztrát Mintában levő specifikus IgM anti-humán IgM Capture antitest Capture =rögzítő www.activemotif.com
Minta Enzimmel konjugált ellenanyag Szubsztrát Színes végtermék 120 perc Inkubáció 37⁰C anti-hbs ellenanyag Mosás www.piercenet.com 1. Specifikus anti-hbs monoklonális ellenanyag szilárd fázishoz kötve 2. A minta az enzimmel (torma-peroxidáz) konjugált monoklonális ellenanyaggal együtt mérjük fel (a két monoklonális ellenanyag két különböző vírusepitóphoz kötődik) specifikus immunkomplex 3. Egylépéses inkubáció 4. Mosási lépés során a nem kötődött szérumfehérjék eltávolítása 5. A bekötődött HBsAg immunkomplex jelenléte a szubsztrát hozzáadása által színes végtermékké alakul 6. Enzimatikus reakció leállítása termék optikai denzitásának mérése (szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg mennyiségével)
Neutralizáló ellenanyag Minta Enzimmel konjugált ellenanyag Szubsztrát Színes végtermék 120 perc Inkubáció 37⁰C anti-hbs ellenanyag Mosás www.piercenet.com 1. Specifikus anti-hbs monoklonális ellenanyag szilárd fázishoz kötve 2. A minta az enzimmel (torma-peroxidáz) konjugált monoklonális ellenanyaggal együtt mérjük fel (a két monoklonális ellenanyag két különböző vírus-epitóphoz kötődik) specifikus immunkomplex 3. Egylépéses inkubáció 4. Mosási lépés során a nem kötődött szérumfehérjék eltávolítása 5. A bekötődött HBsAg immunkomplex jelenléte a szubsztrát hozzáadása által színes végtermékké alakul 6. Enzimatikus reakció leállítása termék optikai denzitásának mérése (szín intenzitása arányos a mintában levő HBsAg mennyiségével)
HbcAb kompetitív ELISA Ellenanyag pozitív szérum minta Y E-jelölt kompetitív ellenanyag Y Y Y Y Y * YYY Ellenanyag negatív szérum minta Y E-jelölt kompetitív ellenanyag * Y * * * YY Y * * * YYY
Gesztációs CMV diagnosztika anyai oldal Anti-CMV IgG: + + Anti-CMV IgM: + + nincs teendő látens fert. IgG aviditás teszt 2 független assay! ismétlés sz.e. 3 hét magas aviditás alacsony aviditás nem jellemezhető látens/rekurrens fert. anyai oldalon nincs teendő primer fertőzés primer fertőzés nem zárható ki magzati/neonatális vizsgálatok
Gesztációs CMV diagnosztika anyai oldal Anti-CMV IgG: + + Anti-CMV IgM: + + nincs teendő látens fert. IgG aviditás teszt 2 független assay! ismétlés sz.e. 3 hét magas aviditás alacsony aviditás nem jellemezhető Ellenanyagok affinitás érése - ~ 4 hónap alatt megy végbe alacsony aviditású ellenanyagok 6-8 M ureával lemoshatók
Előnye: egy vizsgálati eljárás során egy reakció közegben adott kórokozó több antigénjével szembeni ellenanyag válasz detektálható, csökkentve ezzel az aspecifikus reakciók zavaró hatását a szerológiai eredmények interpretálásában!
1. Nagy tisztaságú, rekombináns Ag-ek a nitrocellulóz membránhoz kötve 2. A vizsgálandó mintában levő, adott Ag-re specifikus antitestek kötődése 3. Mosási lépések célja a nem kötődött komponensek eltávolítása 4. Torma-peroxidáz enzimmel konjugált anti-human IgG/IgM ellenanyag kötődése 5. Szubsztrát oldhatatlan színes csapadékot képez 6. Megjelent sávok értékelése www.mikrogen.de
Definíciója: antigén-antitest komplex kialakulását fluoreszkáló anyagok FITC (fluoreszcein-izotiocianát) által tesszük láthatóvá. Direkt IF-vizsgálat során a fluoreszcens jelet adó ellenanyagok közvetlenül a keresett molekulához (kórokozó antigénje) kötődnek. Indirekt IF-vizsgálat esetében a fluorokrómmal jelzett ellenanyagok egy másik a keresett molekulára specifikus ellenanyag molekulához kötődnek.
Módszer: indirekt antigén (CMV pp65 mátrix proteinje) kimutatása CMV fertőzött leukocitákban Minta: heparinnal alvadásgátolt teljes vér Immunszupprimált betegek esetében súlyos CMV fertőzés esetében is késik az ellenanyagválasz! PCR: költségesebb és időigényesebb
1. Leukociták kivonása a teljes vérből vörösvértestek lízise által 2. Kenetkészítés citocentrifuga 3. Fixálás formalin tartalmú oldattal 4. Permeabilizálás CMV pp65 antigén hozzáférhetővé tétele a specifikus ellenanyag számára 5. Festés anti-cmv pp65 monoklonális ellenanyag kötődése, majd a FITC-al konjugált ellenanyag kötődése Antitestek Mosás Mosás Értékelés Antigének FITC konjugált antitest
Értékelés Fluoreszcens mikroszkóp UV-fény gerjesztő hatása által a FITCmolekula zöldesen fluoreszkáló látható fényt bocsát ki pozitív eredmény esetében (vizsgálati mintában jelen van a keresett antigén) A konjugátumhoz EVANS BLUE sejtek fehérjéinek jelölésére alkalmas festéket adunk, így a citoplazma fehérjéinek vörös fluoreszkálása háttérként, nagy mértékben segíti az értékelést! www.leicabiosystems.com
www.biomerieux-industry.com www.ebay.com - teljesen automatizált rendszer Eredmények: Vizsgálati minta és a hitelesítő (standard) minta fluoreszcencia értékeinek összehasonlítása --> RFV=Relative Fluorescence Value Összehasonlítás a küszöbértékkel: > v. = küszöbérték: + < küszöbérték: -
A pipettahegy (SPR) felülete specifikus monoklonális antitesttel bevont, s egyben pipettázó funkciót is ellát. www.biomerieux-diagnostics.com www.biomerieux-industry.com Meghatározandó mikroorganizmus Egyéb immunkompetens molekulák
Mosási lépések az SPR csak függőleges irányban mozog a mérőtálca mozgása biztosítja a megfelelő reagensek elérhetőségét monoklonális antitesttel bevont pipettahegyek felületén megkötődnek az antigének www.biomerieux-industry.com
www.biomerieux-industry.com Több mosási folyamat után a 2. poliklonális antitest hozzákötődik az előzőleg megkötött antigénekhez Az 5. Cellában van az enzimmel jelzett konjugátum
Alkalikus-foszfatázzal konjugált antitest Egy szendvics komplex alakul ki, amely az enzim kromogén szubsztrátjával fluoreszkáló vegyületet alkot, és ennek a fluoreszcenciáját méri a készülék 450 nm-en www.biomerieux-industry.com Kötött antitest Befogott antigén Kromogén szubsztrátum (4-metilumbelliferilfoszfát))
Streptavidin + Phycoerythrin (PE) Biotinált másodlagos antitest Antigen Az antigénre specifikus immobilizált antitestek a bead felszínén BEAD www.illumina.com
www. scinecedirect.com
www.evans.amedd.army.mil