(11) Lajstromszám: E 008 370 (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000008370T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 370 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 750224 (22) A bejelentés napja: 2006. 04. 14. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060750224 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1881845 A2 2006. 11. 02. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1881845 B1 2010. 03. 24. (51) (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06115843 PCT/US 06/014134 (30) Elsõbbségi adatok: 674583 P 2005. 04. 25. US (72) Feltaláló: AUDONNET, Jean, Christophe, Francis, F-69006 Lyon (FR) (73) Jogosult: Merial Ltd., Duluth, GA 30096 (US) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Nipah-vírus oltóanyagok HU 008 370 T2 A leírás terjedelme 56 oldal (ezen belül 38 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.

1 HU 008 370 T2 2 A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezik Nipah-vírus elleni rekombináns oltóanyagok és az ilyen oltóanyagok beadása. A találmány háttere A Nipah-vírus a Paramyxoviridae családba tartozik és rokonságban áll a Hendra-vírussal (korábbi nevén morbillivirus). A Nipah-vírust a Malajziában és Szingapúrban élõ felnõtt férfiak körében kitört agyvelõgyulladásos és légúti megbetegedéses járvány során vett minták vizsgálatát követõen elõször 1999-ben izolálták [lásd például Chua és munkatársai, Lancet 354(9186), 1257 9 (1999. okt. 9.), és Paton és munkatársai: Lancet 354(9186), 1253 6 (1999. okt. 9.)]. A Nipah-vírus gazdája jelenleg sem ismert, de feltételezik, hogy repülõkutyák (a Pteropus nemzetségbe tartozó denevérek) a természetes gazdák. Az ökológiai feltételek változása miatt a repülõkutyák egyre inkább érintkezésbe kerülnek az emberekkel és a háziasított állatokkal. Elképzelhetõ tehát, hogy a repülõkutyákban élõ vírusok megfertõzhetik a háziasított állatokat és az embereket, ami virulensebb, vagy esetlegesen halálos betegséget eredményezhet. A Nipah-vírus viszonylag enyhe megbetegedéseket váltott ki a Malajziában és Szingapúrban élõ sertésekben, és a vírus átkerült a fertõzött sertésekkel szoros érintkezésben álló emberekbe, macskákba és kutyákba. A Nipah-vírusos fertõzést embereknél lázzal és álmossággal járó agyvelõgyulladás és súlyosabb központi idegrendszeri betegségek, így például kóma, rohamok és légzésfenntartási képtelenség kísérte [lásd például Lee és munkatársai, Ann. Neurol. 46(3), 428 32 (1999. szept.)]. A Nipah-vírusos megbetegedés 3 14 napos lázzal és fejfájással kezdõdik, majd ezt követõen álmosság és mentális zavartsággal járó dezorientáltság jelentkezik. E jelek és tünetek 24 48 órán belül kómáig progresszálhatnak. Egyes betegeknél a fertõzés korai szakaszában légúti megbetegedés jelentkezett. A Nipah-vírusos agyvelõgyulladásnál elõforduló súlyos idegrendszeri betegséget bizonyos utóbajok, így például tartós rángógörcsök és személyiségbeli változások jellemezték. A Nipah-vírus járvány idején, 1998 1999-ben, a kórházba kerülõ súlyos idegrendszeri betegségben szenvedõk körülbelül 40%¹a elhalálozott [lásd például Lam és Chua, Clin. Infect. Dis. 34(Suppl 2), S48 51 (2002. május 1.)]. Ennek megfelelõen az állategészségügynek az a célja, hogy a betegségek állatok és/vagy emberek közötti átadásának megelõzésével javítsa az emberi egészséget. A Nipah-vírusos fertõzést úgy elõzhetjük meg, ha elkerüljük azokat az állatokat, amelyekrõl ismert, hogy fertõzöttek, illetve ha érintkezésbe kell lépni potenciálisan fertõzött állatokkal, akkor megfelelõ személyi védõfelszerelések és eszközök alkalmazásával. Kimutatták, hogy a ribavarin nevû gyógyszer in vitro hatásos a Nipah-vírus ellen, kontrollos gyógyszervizsgálatokra azonban még nem került sor és bizonytalan a klinikai alkalmazhatóság. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ha ki akarunk fejleszteni egy hatékony programot a Nipah-vírusos fertõzés megelõzésére és kezelésére, ahhoz meg kell határozni, hogy mely vírusantigének fontosak a védekezõ reakciók kiváltásában, és ki kell alakítani potenciális immunprofilaktikus kezeléseket. Vírusantigénként a Nipah-vírus kapcsolódási (G) és fúziós (F) glikoproteinje merült fel [lásd például Bossart és munkatársai, J. Virol 76(22), 11186 98 (2002. nov.) és Guillaume és munkatársai, J. Virol 78(2), 834 40 (2004. jan.)]. Rekombináns vakcíniavírus vektorokban expresszáltatva a Nipah-vírus glikoproteinek (G és F) immunválaszt váltottak ki hörcsögben, ami védelmet nyújtott a Nipah-vírussal történõ letális immunizálással szemben [lásd például Guillaume és munkatársai, J. Virol 78(2), 834 40 (2004. jan.)]. Megfigyelték azonban, hogy aktív és passzív immunizáláskor is erõsen stimulálódott a Nipah-vírusra adott antitestes válasz, ami arra enged következtetni, hogy az immunizálás hatásossága a vektor replikálódási képességével áll összefüggésben. Ennek megfelelõen szükség van a technikában olyan hatásos és megbízható Nipah-vírus oltóanyagokra, amelyekben korlátozott replikálódás vagy a produktív replikálódás hiánya mellett heterológ fehérjék expresszálódnak. A leírásban szereplõ bármely iratra való hivatkozás vagy utalás nem jelenti annak elismerését, hogy az adott irat a találmány vonatkozásában a technika állásához tartozó irat lenne. A találmány összefoglalása A találmány részben azon alapszik, hogy kifejlesztettünk egy olyan hatásos rekombináns oltóanyagot, ami egy Nipah-vírus glikoproteint kódoló, legyengített kanárihimlõ vektorral immunizálja a sertéseket oly módon, hogy a heterológ fehérjék korlátozott replikálódás vagy a produktív replikálódás hiánya mellett expresszálódnak. A találmány tárgyát képezi kanárihimlõ expressziós vektor, amely egy Nipah-vírus glikoproteint foglal magában. A találmány egy megvalósítási módjában a Nipah-vírus glikoprotein a kapcsolódási (G) fehérje lehet. A polinukleotid elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû nukleotidbázis-szekvencia 8943 10751. nukleotidjait vagy a SEQ ID NO: 8 jelû peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazhatja. A találmány egy másik megvalósítási módjában a Nipah-vírus glikoprotein a fúziós (F) fehérje lehet. A polinukleotid elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû nukleotidbázis-szekvencia 6654 8294. nukleotidjait vagy a SEQ ID NO: 7 jelû peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazhatja. A találmány egy további megvalósítási módjában a Nipah-vírus glikoprotein a kapcsolódási (G) fehérje és a fúziós (F) fehérje lehet. A polinukleotid elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû nukleotidbázis-szekvencia 6654 8294. nukleotidjait vagy a SEQ ID NO: 1 jelû 8943 10 751. nukleotidjait, vagy a SEQ ID NO: 7 és SEQ ID NO: 8 jelû peptidet kódoló polinukleotidot tartalmazhatja. Az expressziós vektor kanárihimlõ vektor. A kanárihimlõ vektor elõnyösen az ALVAC lehet. 2

1 HU 008 370 T2 2 A találmány tárgyát képezi formula valamely Nipahvírus glikoprotein bejuttatásra és expresszáltatására, amely formula tartalmazhatja a fent ismertetett vektorok bármelyikét és egy gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozót, vehikulumot vagy excipienst. A találmány egy megvalósítási módjában a hordozó, vehikulum vagy excipiens elõsegítheti a fertõzést és/vagy tartósabbá teheti a vektort. A találmány tárgyát képezi eljárás a Nipah-vírus glikoprotein állatokba történõ bejuttatására, amelynek során valamely fenti formulát adunk be az állatoknak. Az állat elõnyösen sertés. A leírásban feltárunk eljárást immunválasz kiváltására egy állatban, amelynek során beadhatunk egy olyan készítményt, ami immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazza a fenti vektorok valamelyikét. A leírásban feltárunk továbbá eljárást immunválasz kiváltására egy állatban, amelynek során beadhatunk egy olyan készítményt, ami tartalmaz egy sejtet, amely sejt immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazhatja a fenti vektorok valamelyikét. Az állat elõnyösen sertés. A leírásban feltárunk eljárást immunológiai vagy védekezõ válasz kiváltására egy állatban, amelynek során beadhatunk egy olyan készítményt, ami immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazhatja a fenti vektorok valamelyikét. A találmány tárgyát képezi eljárás immunológiai vagy védekezõ válasz kiváltására egy állatban, amelynek során beadhatunk egy olyan készítményt, ami tartalmaz egy sejtet, amely sejt immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazhatja a fenti vektorok valamelyikét. Az állat elõnyösen sertés. A találmány tárgyát képezi reagenskészlet a fent ismertetett eljárások bármelyikének elvégzéséhez, amely tartalmazza a fent ismertetett készítmények bármelyikét, és adott esetben utasításokat is tartalmaz az eljárás elvégzéséhez. Megjegyezzük, hogy a leírásban és különösen a szabadalmi igénypontokban és/vagy bekezdésekben az olyan kifejezések, mint a tartalmaz, tartalmazott, tartalmazó vagy hasonlók azt jelentik, hogy magában foglal, magában foglalt, magában foglaló vagy hasonló; az olyan kifejezések pedig, mint a lényegében abból álló : lényegében abból áll kifejezetten nem említett elemeket is megengednek. Az ábrák rövid ismertetése Az alábbi részletes ismertetés amelyet példaként közlünk, de nem szándékunk a találmány oltalmi körét kizárólag az ismertetett megvalósítási módokra korlátozni a leíráshoz csatolt ábrákkal együttesen értelmezhetõ a legjobban, különösen amennyiben az ábrák a találmány szabadalmi igénypontokban meghatározott tárgyához tartoznak: Az 1. ábrán a Nipah-vírus nukleotid- (1A. ábra) és aminosavszekvenciája (1B. ábra) látható. Lásd például NC 002728 GenBankhozzáférési szám; Chua és munkatársai, Science 288(5470), 1432 5 (2000. máj. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 26.); Harcourt és munkatársai, Virology. 287(1), 192 201 (2001. aug. 15.); Chan és munkatársai, J. Gen. Virol. 82(Pt 9), 2151 5 (2001. szept) és Chua és munkatársai, Microbes Infect4(2), 145 51 (2002. febr.), amelyek teljes egészükben a kitanítás részét képezik. A 2. ábra a psl 6802 1 4 jelû plazmid összeállítását szemlélteti. A 2A. ábra a Nipah-vírus kódoló régióinak térképe. A 2B. ábra a Nipah-vírus G¹génjének amplifikálására szolgáló PCR-oligonukleotidokat szemlélteti. A 2C. ábra a psl 6802 1 4 összeállítását szemlélteti. A 2D. ábra bemutatja a bal és jobb kar nukleotidszekvenciáját, valamint a Nipah-vírus G¹génjének transzlációját irányító expressziós kazetta nukleotidszekvenciáját, A 3. ábra a psl 6802 2 5 jelû plazmid összeállítását szemlélteti. A 3A. ábra a Nipah-vírus G¹génjének amplifikálására szolgáló PCR-oligonukleotidokat szemlélteti. A 3B. ábra a psl 6802 2 5 összeállítását szemlélteti. A 3C. ábra bemutatja a bal és jobb kar nukleotidszekvenciáját, valamint a Nipah-vírus G¹génjének transzlációját irányító expressziós kazetta nukleotidszekvenciáját. A 4. ábra a psl 6839 1 jelû plazmid összeállítását szemlélteti. A 4A. ábra a Nipah-vírus és az oltóanyag-antigén térképe. A 4B. ábra a Nipah-vírus F¹génjének amplifikálására szolgáló PCR-oligonukleotidokat szemlélteti. A 4C. ábra a psl 6839 1 összeállítását szemlélteti. A 4D. ábra bemutatja a bal és jobb kar nukleotidszekvenciáját, valamint a Nipah-vírus F¹génjének transzlációját irányító expressziós kazetta nukleotidszekvenciáját. Az 5. ábra a psl 6851 29 jelû plazmid összeállítását szemlélteti. Az 5A. ábra a Nipah-vírus F¹génjének amplifikálására szolgáló PCR-oligonukleotidokat szemlélteti. Az 5B. ábra a psl 6851 29 jelû plazmid diagramja. Az 5C. ábra bemutatja a bal és jobb kar nukleotidszekvenciáját, valamint a Nipah-vírus F¹génjének transzlációját irányító expressziós kazetta nukleotidszekvenciáját A 6. ábra a Nipah¹G Western-blottolását szemlélteti. A sávok a következõk voltak: 1. sáv: ALVAC felülúszó, 2. sáv: vcp2199 felülúszó (ALVAC Nipah¹G), 3. sáv: vcp2199 felülúszó (ALVAC Nipah¹G), 4. sáv: baromfihimlõ felülúszó, 5. sáv vfp2200 felülúszó (baromfihimlõ Nipah¹G), 6. sáv: vfp2200 felülúszó (baromfihimlõ Nipah¹G), 7. sáv: markerek (177,6, 113,9, 81,2, 60,7, 47,4, 36,1, 3

1 HU 008 370 T2 2 25,3, 19,0, 14,7, 6,1 kda), 8. sáv: AL- VAC pellet, 9. sáv: vcp2199 pellet, 10. sáv: vcp2199 pellet, 11. sáv: baromfihimlõ pellet, 12. sáv: vfp2200 pellet, 13. sáv: vfp2200 pellet. A 7. ábra a Nipah¹F immunblottolását szemlélteti. A 7A. ábrán tengerimalacból származó antiszérummal történt a blottolás. A 7B. ábrán sertésbõl származó antiszérummal történt a blottolás. Az 1. számú gél jelentette a Nipah¹F rekombinánsokat (csak pellet). A sávok a következõ voltak: 1. sáv: üres, 2. sáv: baromfihimlõ, 3. sáv: vfp2207, 4. sáv. vfp2207, 5. sáv. üres, 6. sáv: ALVAC, 7. sáv: cvcp2208, 8. sáv: marker (170, 130, 100, 72, 55, 40, 33 és 24 kda), 9. és 10. sáv: üres. A 2. számú gél jelentette a Nipah¹F rekombinánsokat (csak felülúszó). A sávok a következõ voltak: 1. sáv: üres, 2. sáv: baromfihimlõ, 3. sáv: vfp2207, 4. sáv: vfp2207, 5. sáv: marker (170 130, 130, 100, 72, 55, 40, 33 és 24 kda), 6. sáv: üres, 7. sáv: ALVAC, 8. sáv: üres, 9. sáv: vcp2208, 10. sáv: üres. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A találmány részletes ismertetése A találmány részben azon alapszik, hogy kifejlesztettünk egy hatásos rekombináns oltóanyagot a Nipahvírus ellen. A találmány tárgyát képezi Nipah-vírus elleni oltóanyag. A Nipah-vírus gént kódolásra alkalmas formában egy expressziós vektorba juttatjuk be, a Nipah-vírus gén egy glikoproteint kódol. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a Nipah-vírus gén a kapcsolódási (G) glikoproteint kódolja. A találmány egy másik különösen elõnyös megvalósítási módjában a Nipah-vírus gén a fúziós (F) glikoproteint kódolja. Az expressziós vektor kanárihimlõ vektor. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a vektor egy legyengített kanárihimlõ-vektor. A legyengített kanárihimlõ-vektor elõnyösen az ALVAC. Az expressziós vektor által kódolt, Nipah-vírus fehérje egy glikoprotein. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a Nipah-vírus fehérje a kapcsolódási (G) glikoprotein, elõnyösen a SEQ ID NO: 8 jelû szekvenciával. A találmány egy másik különösen elõnyös megvalósítási módjában a Nipah-vírus fehérje a fúziós (F) glikoprotein, elõnyösen a SEQ ID NO: 7 jelû szekvenciával. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a rekombináns konstrukciók a Nipah-G¹t expresszáló, vcp2199 megjelölésû ALVAC konstrukció és a Nipah-F¹et expresszáló, vcp2208 megjelölésû ALVAC konstrukció. A Nipah-vírus fehérjék általában nukleokapszid fehérjét (elõnyösen a SEQ ID NO: 2), foszfoproteint (elõnyösen SEQ ID NO: 3), V¹fehérjét (elõnyösen SEQ ID NO: 4), C¹fehérjét (elõnyösen SEQ ID NO: 5), mátrixfehérjét (elõnyösen SEQ ID NO: 6) vagy polimerázt (elõnyösen SEQ ID NO: 9) jelentenek. A leírásban a fehérje, peptid, polipeptid és polipeptidfragmens kifejezések mind aminosavpolimereket jelentenek, bármely hosszúsággal. A polimer lehet egyenes láncú vagy elágazó láncú, tartalmazhat módosított aminosavakat vagy aminosavanalógokat, és aminosavaktól eltérõ csoportok is beleékelõdhetnek. A fenti kifejezések olyan aminosavpolimert is jelenthetnek, ami természetes úton vagy beavatkozás révén módosított; például diszulfidkötés kialakításával, glikozilálással, lipidezéssel, acetilezéssel, foszforilálással vagy bármely más manipulációval vagy módosítással, így például egy jelölõ vagy bioaktív komponenssel történõ konjugálással. A találmányban alkalmazott Nipah-vírus gén egy glikoproteint kódol. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a Nipah-vírus gén a kapcsolódási (G) glikoproteint, elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 8943 10 751. nukleotidjait kódolja. 1. A találmány egy másik különösen elõnyös megvalósítási módjában a Nipah-vírusból származó gén a fúziós (F) glikoproteint, elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 6654 8294. nukleotidjait kódolja. A Nipah-vírus gének általában magukban foglalnak nukleokapszidfehérje-gént (elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 113 1711. nukleotidjait), foszfoprotein-gént (elõnyösen SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 2406 4535. nukleotidjait), V¹fehérje-gént (elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 2406 3775. nukleotidjait), C¹fehérje-gént (elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 2428 2928. nukleotidjait), mátrixfehérjegént (elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 5108 6166. nukleotidjait) vagy polimerázgént (elõnyösen a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 11259 18213. nukleotidjait) jelentenek. A polinukleotid bármilyen hosszúságú nukleotidpolimert jelent, amely dezoxiribonukleotidokat, ribonukleotidokat és analógokat tartalmaz, bármilyen kombinációban. A polinukleotidok rendelkezhetnek háromdimenziós szerkezettel és bármilyen ismert vagy ismeretlen funkciót elláthatnak. A polinukleotid kifejezés kétszálú, egyszálú és tripla hélix molekulákat is jelent. Egyébirányú jelzés vagy szükség hiányában a találmány itt ismertetett összes olyan megvalósítási módja, amely polinukleotid, magában foglalja a kétszálú formát is, és azt a két komplementer formát is, ami a DNS-molekula, RNS-molekula vagy hibrid molekula két szálát ismerten vagy az elõrejelzések szerint alkotja. Az alábbiak polinukleotidokra adott, az oltalmi kört nem korlátozó példák: egy gén vagy génfragmens, exonok, intronok, mrns, trns, rrns, ribozimek, cdns, rekombináns polinukleotidok, elágazó láncú polinukleotidok, plazmidok, vektorok, bármilyen szekvenciájú izolált DNS, bármilyen szekvenciájú izolált RNS, nukleinsavpróbák és láncindítók. A polinukleotid tartalmazhat módosított nukleotidokat, így például metilezett nukleotidokat és nukleotidanalógokat, uracilt, egyéb cukrokat és kapcsolódási csoportokat, így például fluorribózt és tiolátot és nukleotidelágazásokat. A nuk- 4

1 HU 008 370 T2 2 leotidok szekvenciája a polimerizációt követõen tovább is módosítható, így például egy jelölõkomponenssel történõ konjugálás révén. Az e meghatározás alá tartozó további módosítások a sapkák, egy vagy több természetes elõfordulású nukleotid valamely analóggal történõ helyettesítése, valamint olyan eszközök bevitele, amelyek révén a polinukleotid fehérjékhez, fémionokhoz, jelölõ komponensekhez, egyéb polinukleotidokhoz vagy szilárd hordozóhoz kapcsolható. Az izolált polinukleotid vagy polipeptid olyan, ami lényegében mentes azoktól az anyagoktól, amelyekkel a természetes környezetében együtt fordul elõ. A lényegében mentes azt jelenti, hogy legalább 50%-ban, elõnyösen legalább 70%-ban, még elõnyösebben legalább 80%-ban és még ennél is elõnyösebben 90%- ban mentes az ilyen anyagoktól. A találmány tárgyát képezi továbbá egy Nipah-vírus glikoprotein polinukleotidjának komplementer szála. A komplementer szál lehet polimer, és bármilyen hosszúságú lehet, és dezoxiribonukleotidokat, ribonukleotidokat és analógokat tartalmazhat, bármilyen kombinációban. A hibridizáltatás eltérõ sztringenciájú körülmények között történik. A hibridizáltatás sztringenciájának növelésére szolgáló körülmények jól ismertek. Lásd például: Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( Molekuláris klónozás: Laboratórium kézikönyv ), második kiadás (Sambrook és munkatársai, 1989). A releváns körülményekre példák a következõk (egyre növekvõ sztringenciával): 25 C¹os, 37 C¹os, 50 C¹os és 68 C¹os inkubálási hõmérséklet; 10 SSC, 6 SSC, 1 SSC, 0,1 SSC pufferkoncentrációk (ahol az SSC jelentése 0,15 M NaCl és 15 mm citrátpuffer) és ezek ekvivalensei más pufferrendszerek alkalmazásával; 0%¹os, 25%¹os, 50%¹os és 75%¹os formamidkoncentráció; 5 perctõl 24 óráig terjedõ inkubálási idõ; 1, 2 vagy több mosási lépés; 1, 2 vagy 15 perces mosási inkubálási idõ; és mosóoldatként 6 SSC, 1 SSC, 0,1 SSC vagy ionmentes víz. A találmány tárgyát képezik továbbá polinukleotidok, amelyek Nipah-vírus glikoproteinek funkcionálisan egyenértékû változatait vagy származékait, vagy ezek funkcionálisan egyenértékû fragmenseit kódolják, amelyek növelhetik, csökkenthetik vagy jelentõsebben nem befolyásolják az általuk kódolt polipeptidek tulajdonságait. E funkcionálisan egyenértékû változatok, származékok és fragmensek képesek megõrizni egy Nipah-vírus glikoproteinaktivitását. Például a DNS-szekvencia olyan változásai, amelyek nem változtatják meg a kódolt aminosavszekvenciát, valamint azok, amelyek az aminosavak konzervatív helyettesítéseit, egy vagy néhány aminosav delécióját vagy addícióját, és aminosavak aminosavanalógokkal történõ helyettesítését eredményezik, nem olyanok, amelyek szignifikáns mértékben befolyásolják a kódolt polipeptidek tulajdonságait. A konzervatív aminosavhelyettesítések a következõk: glicin/alanin; valin/izoleucin/leucin; aszparagin/glutamin; aszparaginsav/glutaminsav; szerin/treonin/metionin; lizin/arginin; és fenil-alanin/tirozin/triptofán. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A találmány céljára a szekvenciaazonosság vagy ¹homológia meghatározása úgy történik, hogy összehasonlítjuk az egymáshoz oly módon illesztett szekvenciákat, hogy maximális legyen az átfedés és az azonosság és minimális legyen a szekvenciahézag. A szekvenciaazonosság közelebbrõl sokféle matematikai algoritmus bármelyikének alkalmazásával meghatározható. Két szekvencia összehasonlítására alkalmazható matematikai algoritmusokra egy, az oltalmi kört nem korlátozó példa a Karlin és Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264 2268 (1990)] által ismertetett, és ugyancsak Karlin és Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873 5877 (1993)] szerint módosított algoritmus. A szekvencia-összehasonlításra alkalmazható matematikai algoritmusokra egy további példa a Myers és Miller [CABIOS 4, 11 17 (1988)] által ismertetett algoritmus. Egy ilyen algoritmus van beépítve az ALIGN programba (2.0 verzió), amely a CGC szekvenciaillesztõ szoftvercsomag részét képezi. Ha az ALIGN programot aminosavszekvenciák illesztésére alkalmazzuk, egy PAM120 súlyozott aminosavmaradék táblázat, 12¹es hézaghosszúsági büntetés és 4¹es hézagbüntetés alkalmazható. A lokális szekvenciahasonlóságot mutató régiók azonosítására és illesztésére alkalmas további algoritmus a FASTA algoritmus, ahogy azt Pearson és Lipman [Proc. Natl. Acad. Sci. USA S5, 2444 2448 (1988)] ismerteti. A találmány szerinti alkalmazáshoz elõnyös a WU¹BLAST (Washingtoni Egyetem, BLAST) szoftver 2.0 verziója. A WU¹BLAST 2.0 verziós végrehajtható programok sokféle UNIX platformhoz letölthetõk a következõ oldalról: ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Ez a program a WU¹BLAST 1.4 verzióján alapszik, amely viszont a nyilvánosan hozzáférhetõ NCBI- BLAST 1.4 verzióján alapszik [Altschul és Gish, Local alignment statistics ( Lokális illesztési statisztikák ), szerk.: Doolittle, Methods in Enzymology 266, 460 480 (1996); Altschul és munkatársai, Journal of Molecular Biology 215, 403 410 (1990); Gish és States, Nature Genetics 3, 266 272 (1993); Karlin és Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873 5877 (1993); amelyek mindegyike a kitanítás részét képezi]. Az aminosavszekvenciák összehasonlítása általánosságban úgy történik, hogy egy ismert szerkezetû polipeptid aminosavszekvenciájához illesztjük egy ismeretlen szerkezetû polipeptid aminosavszekvenciáját. A szekvenciában lévõ aminosavakat ezután összehasonlítjuk, és egy csoportba soroljuk a homológ aminosavak csoportjait. Ez az eljárás detektálja a polipeptidek konzerválódott régióit és elszámol az aminosavinszerciókkal és aminosavdeléciókkal. Az aminosavszekvenciák közötti homológia meghatározható kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ algoritmusokkal (lásd a homológiáról szóló fenti ismertetést is). A leírásban máshol említetteken kívül megemlítjük a következõ programokat is: BLAST, gapped ( hézagos ) BLAST, BLASTN, BLASTP és PSI-BLAST, amelyeket a National Center for Biotechnology Information ( Országos Biotechnológiai Információs Központ ) biztosít. 5

1 HU 008 370 T2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ezeket a programokat széles körben alkalmazzák a technikában erre a célra, és össze lehet illeszteni velük két aminosavszekvencia homológ régióit. Az arra alkalmas készletben lévõ minden keresõprogramban a hézagos illesztési rutinok szerves részét képezik magának az adatbázis-keresésnek. Ha kívánatos, a hézagolás ki is kapcsolható. Egy egyes hosszúságú hézagra az alapértelmezett büntetés (Q) értéke fehérjék esetében a BLASTP-ben 9, a BLASNben 10, de bármely egész szám szerepelhet helyettük. Egy hézag kiterjesztése esetén az alapértelmezett aminosavankénti büntetés (R) értéke fehérjék esetében a BLASTP-ben 2, a BLASN-ben 10, de bármely egész szám szerepelhet helyettük. A Q¹ és R¹értékek bármely kombinációja alkalmazható szekvenciák az oly módon történõ illesztésére, hogy maximális legyen az átfedés és az azonosság, és minimális legyen a szekvenciahézag. Az alapértelmezett aminosav-összehasonlító mátrix a BLOSUM62, de más aminosav-összehasonlító mátrixok, így például a PAM is alkalmazható. Alternatív módon vagy ezenkívül a homológia vagy azonosság kifejezések például egy nukleotidvagy aminosavszekvencia vonatkozásában a két szekvencia közötti homológia egy kvantitatív mérõszámát is jelenthetik. A százalékos szekvenciahomológia a következõképpen számítható: (N ref N dif )*1000/N ref, ahol N dif jelentése a két szekvenciában az illesztéskor kapott nem azonos aminosavak/nukleotidok összes száma, N ref jelentése pedig az egyik szekvenciában lévõ aminosavak/nukleotidok száma. Az AGTCAGTC DNS-szekvencia tehát 75%¹os szekvenciaazonosságot mutat az AATCAATC szekvenciával (N ref =8; N dif =2). Alternatív módon vagy ezenkívül a homológia vagy azonosság kifejezések két szekvencia vonatkozásában jelenthetik azoknak a pozícióknak a számát is, ahol azonos nukleotid vagy aminosav van, osztva a két szekvencia közül a rövidebbikben lévõ nukleotidok vagy aminosavak számával, ahol a két szekvencia illesztése a Wilbur- és Lipman-féle algoritmussal [Wilbur és Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726 (1983), amely a kitanítás részét képezi] határozható meg, például oly módon, hogy 20 nukleotidos ablakméretet, 4 nukleotidos szóhosszúságot, és 4¹es hézagbüntetést alkalmazunk, és a szekvenciaadatok és ezen belül az illesztés számítógépes elemzése és értelmezése kényelmesen elvégezhetõ kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ programokkal (például Intelligenetics Suite, Intelligenetics Inc., CA, USA). Ha RNS-szekvenciáról mondjuk, hogy hasonlóságot, vagy bizonyos mértékû szekvenciaazonosságot vagy homológiát mutat DNS-szekvenciákkal, a DNS-szekvenciában lévõ timidint (T) az RNS-szekvenciában lévõ uracillal (U) egyenértékûnek tekintjük. Tehát a találmány oltalmi körébe tartoznak RNS-szekvenciák is, és DNS-szekvenciákból származtathatók oly módon, hogy a DNS-szekvenciában lévõ timidint (T) az RNS-szekvenciában lévõ uracillal (U) egyenértékûnek tekintjük. Technikában jártas szakember indokolatlan kísérletezés nélkül sok más programot vagy hivatkozást is felhasználhat a százalékos homológia meghatározásához. A találmány tárgyát képezi továbbá egy Nipah-vírus glikoprotein, amely a találmány szerinti vektormolekulába vagy expressziós vektorba van beépítve és szükség esetén mûködõképesen kapcsolódik egy enhanszer- és/vagy promoterelemhez. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a promoter egy citomegalovírus (CMV) promoter. A találmány egy másik megvalósítási módjában az enhanszerek és/vagy promoterek sokféle sejt- vagy szövetspecifikus promotert, sokféle virális promotert és enhanszert és sokféle Nipah-vírus DNS-szekvenciát jelenthetnek, amelyek izogénikusan specifikusak az egyes állatfajokra. A vektor jelentése olyan rekombináns DNS- vagy RNS-plazmid vagy ¹vírus, amely egy célsejtbe in vitro vagy in vivo bejuttatandó heterológ polinukleotidot tartalmaz. A heterológ polinukleotid tartalmazhat egy terápiás szempontból érdekes szekvenciát, és adott esetben expressziós kazetta formájában lehet jelen. A vektornak nem kell képesnek lennie a replikációra a végsõ célsejtben vagy alanyban. A kifejezés valamely polinukleotid kódolószekvenciájának transzlálására szolgáló klónozó vektorokat is magában foglal. Magában foglal továbbá virális vektorokat is. A rekombináns kifejezés olyan genomiális cdns, félszintetikus vagy szintetikus eredetû polinukleotidot jelent, amely vagy nem fordul elõ a természetben vagy olyan elrendezésben kapcsolódik egy másik polinukleotidhoz, ami a természetben nem található meg. A heterológ azt jelenti, hogy egy genetikailag távoli entitásból származik annak az entitásnak a többi részéhez képest, amellyel összehasonlítjuk. Egy polinukleotid genetikai manipulációs technológiákkal például behelyezhetõ egy más forrásból származó plazmidba vagy vektorba, és így heterológ polinukleotidnak minõsül. A natív kódolószekvenciából eltávolított és egy, a natív szekvenciától eltérõ kódolószekvenciához mûködõképesen hozzákapcsolt promoter heterológ promoternek minõsül. A találmány szerinti polinukleotidok további szekvenciákat is tartalmazhatnak, így például további kódolószekvenciákat ugyanazon transzkripciós egységen belül, irányítóelemeket, így például promotereket, enhanszereket, ribozimkötõ helyeket, transzkripcióterminátorokat, további transzkripciós egységeket ugyanazon vagy eltérõ promoter irányítása alatt, olyan szekvenciákat, amelyek lehetõvé teszik a klónozást, az expressziót, a homológ rekombinációt és egy gazdasejt transzformációját, és bármely ilyen konstrukciót, amely a találmány megvalósítási módjaihoz kívánatos lehet. A Nipah-vírus glikoprotein expresszáltatására szolgáló elemek elõnyösen egy találmány szerinti vektorban vannak jelen. Ez minimálisan egy iniciáló kodont (ATG), egy stopkodont és egy promotert, és adott esetben bizonyos vektorok, így például plazmidok és egyes virális vektorok, például a himlõvírusoktól eltérõ virális vektorok esetében egy poliadenilezõszekvenciát, és himlõvírusok esetében egy transzkripció terminátort is tartalmaz, lényegében ezekbõl áll vagy ezekbõl áll. Ha 6

1 HU 008 370 T2 2 a polinukleotid egy poliproteinfragmentst, például egy Nipah-vírus fehérjét kódol, a vektorban az ATG elõnyösen a leolvasási keret 5 ¹végén, a stopkodon pedig a 3 ¹végén helyezkedik el. Egyéb, az expressziót irányítóelemek, így például enhanszerszekvenciák, stabilizálószekvenciák és a fehérje szekrécióját lehetõvé tevõ szignálszekvenciák is jelen lehetnek. A találmány szerinti gének géntermékeinek in vivo vagy in vitro expresszáltatására szolgáló valamely vektor vagy rekombináns vagy plazmid elõállítására és/vagy beadására szolgáló eljárás bármely kívánatos eljárás lehet, például egy olyan eljárás, ami az alábbi iratok vagy az azokban hivatkozott iratok szerinti vagy azokkal analóg: Az alábbi számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak: 4 603 112; 4 769 330; 4 394 448; 4 722 848; 4 745 051; 4 769 331; 4 945 050; 5 494 807; 5 514 375; 5 744 140; 5 744 141; 5 756 103; 5 762 938; 5 766 599; 5 990 091; 5 174 993; 5 505 941; 5 338 683; 5 494 807; 5 591 639; 5 589 466; 5 677 178; 5 591 439; 5 552 143; 5 580 859; 6 130 066; 6 004 777; 6 130 066; 6 497 883; 6 464 984; 6 451 770; 6 391 314; 6 387 376; 6 376 473; 6 368 603; 6 348 196; 6 306 400; 6 228 846; 6 221 362; 6 217 883; 6 207 166; 6 207 165; 6 159 477; 6 153 199; 6 090 393; 6 074 649; 6 045 803; 6 033 670; 6 485 729; 6 103 526; 6 224 882; 6 312 682; 6 348 450 és 6 312 683; a 920 197 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (a bejelentés idõpontja: 1986. október 16.); az alábbi számú iratok: WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11 313 11 318 (1996); Ballay és munkatársai, EMBO J. 4, 3861 65 (1993); Feigner és munkatársai, J. Biol. Chem. 269, 2550 2561 (1994); Frolov és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11 371 11 377 (1996); Graham, Tibtech 8, 85 87 (1990); Grunhaus és munkatársai, Sem. Virol. 3, 237 52 (1992); Ju és munkatársai, Diabetologia 41, 736 739 (1998); Kitson és munkatársai, J. Virol. 65, 3068 3075 (1991); McClements és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11 414 11 420 (1996); Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11 341 11 348 (1996); Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11349 11353 (1996); Pennock és munkatársai, Mol. Cell. Biol. 4, 399 406 (1984); Richardson (szerk.), Methods in Molecular Biology 39, Baculovirus Expression Protocols ( Bakulovírusos expresszáltatási protokollok ), Humana Press Inc. (1995); Smith és munkatársai, Mol. Cell. Biol. 3, 2156 2165 (1983); Robertson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11 334 11 340 (1996); Robinson és munkatársai, Sem. Immunol. 9, 271 (1997); és Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11 307 11 312 (1996). A találmány szerinti vektor kanárihimlõvírus-vektor. A nem Nipah-vírusból származó fehérjék vagy fragmenseik, citokinek stb. expresszáltathatók vektorral vagy vektorokkal, amelyek a találmány szerinti készítmény részét képezik azok tartalmazzák. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Az immunogén készítményben vagy oltóanyag-készítményben a citokin vagy citokinek lehetnek fehérje formájában, vagy az immunogénnel vagy immunogénekkel vagy azok epitópjával/epitópjaival koexpresszáltathatók a gazdában. Elõnyösebb a citokin vagy citokinek koexpresszáltatása, akár ugyanazon vektorral történik, mint ami az immunogént vagy immunogéneket vagy azok epitópját/epitópjait expresszálja, vagy akár egy másik e célra szolgáló vektorral. A citokin(ek) választhatók az alábbiak közül: interleukin 18 (IL 18), interleukin 12 (IL 12), interleukin 15 (IL 15), MlP 1 [1 típusú makrofágeredetû gyulladásos fehérje; Marshall és munkatársai, Br. J. Cancer 75(12). 1715 1720 (1997)], és GM¹CSF (granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor). Elõnyösen a beoltandó faj citokinjeit alkalmazzuk; azaz elõnyösen a citokint megfeleltetjük a cél- vagy gazdafajnak és felhívjuk a figyelmet például a sertéseredetû GM¹CSF¹re [S. Inumaru és munkatársai, Immunol. Cell Biol. 73(5), 474 476 (1995)] a kutyaeredetû GM¹CSF¹re (a WO00/77043 számú irat8. példája) és a macskaeredetû GM¹CSF¹re (a WO00/77043 számú irat 9. példája). A lóeredetû GM¹CSF-nek megfelelõ nukleotidszekvenciát és aminosavszekvenciát, a GM¹CSF in vitro termelését és a lóeredetû GM¹CSF in vivo expresszáltatását lehetõvé tevõ vektorok (például plazmidok és virális vektorok) összeállítását a WO00/77210 számú irat ismerteti. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti vektorok készítményei. A készítmények egy vagy több olyan vektort, például expressziós vektorokat, így például in vivo expressziós vektorokat tartalmazhatnak, lényegében azokból állhatnak vagy azokból állhatnak, amelyek egy vagy több Nipah-vírus polinukleotidot tartalmazhatnak, lényegében azokból állhatnak vagy azokból állhatnak, és elõnyösen a vektor tartalmaz és expresszál egy olyan polinukleotidot, ami egy Nipah-vírus fehérjét, elõnyösen egy Nipah-vírus glikoproteint kódoló kódolórégiót tartalmaz, lényegében abból áll vagy abból áll, egy gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozóban, excipiensben vagy vehikulumban. A találmány egyik megvalósítási módja szerint tehát a készítményben lévõ másik vektor vagy vektorok egy olyan polinukleotidot tartalmaznak, lényegében abból állnak vagy abból állnak, amely egy Nipah-vírus glikoprotein egy vagy több egyéb fehérjéjét vagy annak egy fragmensét kódolja, és megfelelõ körülmények között a vektor expresszálja az(oka)t. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a készítményben lévõ vektor vagy vektorok olyan polinukleotido(ka)t tartalmaznak, lényegében abból állnak vagy abból állnak, amely egy Nipah-vírusfehérjének, elõnyösen egy Nipah-vírus-glikoprotein egy vagy több egyéb fehérjéjét vagy annak egy fragmensét kódolja, és megfelelõ körülmények között a vektor expresszálja az(oka)t. A találmány szerinti készítmény elõnyösen legalább két olyan vektort tartalmaz, lényegében abból áll vagy abból áll, amelyek különbözõ Nipah-vírus izolátumokból származó, ugyanazon fehérjéket és/vagy 7

1 HU 008 370 T2 2 eltérõ fehérjéket, de elõnyösen ugyanazon fehérjéket kódoló polinukleotidokat tartalmaz, lényegében abból áll vagy abból áll, és elõnyösen expresszálja is ezeket, mégpedig elõnyösen in vivo megfelelõ körülmények vagy alkalmas körülmények között, vagy egy megfelelõ gazdasejtben. Egy Nipah-vírus fehérjét, elõnyösen egy Nipah-vírus glikoproteint vagy annak egy epitópját tartalmazó, lényegében abból álló vagy abból álló, és elõnyösen azt expresszáló, mégpedig elõnyösen in vivo expresszáló egy vagy több vektort tartalmazó készítmények tekintetében elõnyös, ha az expressziós termékek két, három vagy négy különbözõ Nipah-vírus izolátumból, elõnyösen törzsbõl származnak. A találmány tárgyát képezik továbbá vektorkeverékek, amelyek különféle Nipah-vírus fehérjéket tartalmaznak, lényegében azokból állnak vagy azokból állnak, azokat kódolják és azokat expresszálják. A találmány szerinti vektor madárhimlõvektor, amely egy Nipah-vírus glikoprotein génjét tartalmazza, és a madárhimlõvektor kanárihimlõ-vektor, elõnyösen legyengített kanárihimlõ-vektor, így például ALVAC. Legyengített kanárihimlõ-vírusokat ismertet az 5,756,103 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (ALVAC) és a WO01/05934 számú irat. A találmány szerint a himlõvírusvektor kanárihimlõvírus-vektor, elõnyösen legyengített kanárihimlõvírusvektor. Ebben a tekintetben megemlítjük a VR 111 ATCC-hozzáférési szám alatt elérhetõ kanárihimlõvírust. Legyengített kanárihimlõvírusokat ismertet az 5,756,103 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (ALVAC) és a WO01/05934 számú irat. A fentiek rekombinánsainak elõállítására szolgáló eljárásokra és beadásának módjára vonatkozó információkat technikában jártas szakember többek között a WO90/12882 számú iratban és az 5,756,103 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban találhatja meg. A kanárihimlõ esetében az inszerciós hely vagy helyek elõnyösen a C3, C5 és/vagy C6 leolvasási keretek; lásd még a leírásban hivatkozott iratokat, különösen azokat, amelyek a kanárihimlõ-vírusra vonatkoznak. Az expresszálandó polinukleotid elõnyösen egy specifikus himlõvírus-promoter irányítása alá kerül beillesztésre; többek között ilyenek lehetnek a 7,5 kda¹os vakcíniapromoter [Cochran és munkatársai, J. Virology 54, 30 35 (1985)], az I3L vakcíniapromoter [Riviere és munkatársai, J. Virology 66, 3424 3434 (1992)], a HA vakcíniapromoter [Shida, Virology 150, 451 457 (1986)], az ATI tehénhimlõ-promoter [Funahashi és munkatársai, J. Gen. Virol. 69, 35 47 (1988)], és a H6 vakcíniapromoter [Taylor és munkatársai: Vaccine 6, 504 508 (1988); Guo P. és munkatársai, J. Virol. 63, 4189 4198 (1989); Perkus M. és munkatársai, J. Virol. 63, 3829 3836 (1989)]. Emlõsök vakcinázásához az expressziós vektor kanárihimlõ-vektor. Ily módon korlátozott replikálódás vagy a produktív replikálódás hiánya mellett expresszáltathatók a heterológ fehérjék. Még általánosabban a promoter vagy vírusos, vagy sejtes eredetû. A találmány gyakorlatában haszonnal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 alkalmazható, a CMV IE-tõl eltérõ, egyéb erõs virális promoter az SV40-vírus korai/késõi promotere vagy a Rous-szarkóma vírus LTR-promotere. A találmány gyakorlatában haszonnal alkalmazható, erõs sejtes promoter egy citoszkeletális gén, így például a dezminpromotere [Kwissa és munkatársai, Vaccine 18, 2337 2344 (2000)], vagy az aktinpromotere [Miyazaki J. és munkatársai, Gene 79, 269 277(1989)]. A találmány gyakorlatában e promoterek funkcióképes szubfragmensei, vagyis a promoterek megfelelõ promoteraktivitást fenntartó részletei, például a WO98/00166 számú PCT-bejelentés vagy a 6,156,567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom szerinti csonkolt CMV IE promoterek is alkalmazhatók. A találmány gyakorlatában alkalmazott promoter következésképp egy teljes hosszúságú promoter olyan származékait vagy szubfragmenseit tartalmazza, amelyek megfelelõ promoteraktivitást tartanak fenn és ily módon promoterként mûködnek elõnyösen lényegében hasonló promoteraktivitást, mint az a tényleges vagy teljes hosszúságú promoter, amelybõl a származék vagy a szubfragmens származik, például analóg módon azzal, ahogy a 6,156,567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom szerinti csonkolt CMV IE promoterek aktivitása rokonságot mutat a teljes hosszúságú CMV IE promoterek aktivitásával. A találmány gyakorlatba vétele során alkalmazott CMV IE promoter tehát a teljes hosszúságú promoter promoterrészletét és/vagy a teljes hosszúságú promoter enhanszerrészletét, valamint származékaikat és szubfragmenseiket tartalmazhatja, vagy lényegében azokból állhat vagy azokból állhat. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint az expressziós vektorok a fehérjék megfelelõ sejtes rendszerekben történõ, in vitro expresszáltatására alkalmazott expressziós vektorok. A fehérje termeltetése történhet emlõssejtek replikáció révén történõ transzfekciójával, vagy virális vektorok produktív replikáció nélküli expressziójával emlõs- vagy madársejtekben, vagy Bakulovirusos replikációval [lásd például 4,745,051 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; Vialard J. és munkatársai, J. Virol., 64(1). 37 50 (1990); Verne A., Virology, 167, 56 71 (1988)], például Autographa californica Nukleáris Polihedrózis Vírus (AcNPV), rovarsejtekben (például Sf9 Spodoptera frugiperda-sejtekben, ATCC CRL 1711; lásd még 6,228,846 és 6,103,526 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak). Elõnyösen alkalmazható emlõssejtek a hörcsögsejtek (például CHO vagy BHK 21) vagy a majomsejtek (például COS vagy VERO). Az expresszált fehérjék a tenyészet felülúszójában vagy felülúszójából arathatók le a szekréció után, vagy nem a szekréció után (ha nincs szekréció, tipikusan sejtlízis történik vagy kerül elvégzésre), adott esetben töményítõ eljárásokkal, így például ultraszûréssel töményíthetõk és/vagy tisztítási eljárásokkal, így például affinitás¹, ioncsere- vagy gélfiltrálás-típusú kromatográfiás eljárásokkal tisztíthatók. Technikában jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a gazdasejtek tenyésztési körülményei az 8

1 HU 008 370 T2 2 adott géntõl függõen változnak, és idõnként a gazdasejttõl függõen rutinszerû kísérletezés szükséges egy Nipah-vírus glikoprotein tenyésztés útján történõ elõállításához optimális körülmények meghatározásához A gazdasejt olyan prokarióta vagy eukarióta sejtet jelent, amely genetikailag módosított vagy amely képes arra, hogy genetikailag módosuljon exogén polinukleotid, így például egy rekombináns vektor beadása révén. Ahol a leírásban genetikailag módosított sejteket említünk, a kifejezés az eredetileg módosított sejtet és annak utódait is jelenti. A kívánt szekvenciát tartalmazó polinukleotidokat megfelelõ klónozó vagy expressziós vektorba illeszthetjük be, amely vektort azután a replikálódás és amplifikálódás érdekében megfelelõ gazdasejtbe juttathatjuk. A polinukleotidok általánosságban a technikában ismert bármely módon bejuttathatók a gazdasejtekbe. Az érdekes polinukleotidokat tartalmazó vektorok sokféle megfelelõ mód közül bármely módon bejuttathatók gazdasejtekbe, ezen belül direkt felvétellel, endocitózissal, transzfekcióval, f¹párosodással, elektroporézissel, kalcium-klorid, rubídium-klorid, kalcium-foszfát, DEAE-dextrán vagy egyéb anyagok felhasználásával végzett transzfekcióval; mikrolövedékes bombázással; lipofekcióval; és fertõzéssel (ha a vírus fertõzõ, például retrovírusvektor). A bejuttatóvektorok vagy polinukleotidok kiválasztása gyakran a gazdasejt jellemzõitõl függ. A Nipah-vírus glikoprotein célsejtbe juttatása és expresszáltatása érdekében be kell adni egy célsejtbe egy találmány szerinti formula terápiásan hatásos mennyiségét. Technikában jártas szakember számára a terápiásan hatásos mennyiség meghatározása rutinszerû kísérletezést jelent. A formula tartalmaz egy expressziós vektort, amely tartalmaz egy Nipah-vírus glikoprotein expresszáló polinukleotidot és egy gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozót, vehikulumot vagy excipienst. A gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozó, vehikulum vagy excipiens minden elõnyös megvalósítási módban elõsegíti a transzfekciót és/vagy tartósabbá teszi a vektort. Technikában jártas szakember számára jól ismertek a gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozók, vehikulumok vagy excipiensek. A gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozó vagy vehikulum vagy excipiens lehet például egy 0,9%¹os NaCl-oldat (azaz sóoldat) vagy valamely foszfátpuffer. Egyéb gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozó vagy vehikulum vagy excipiens, amely a találmány szerinti eljárásokban alkalmazható, többek között a poli-(l¹glutamát) vagy a poli(vinil-pirrolidon). A gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozó, vehikulum vagy excipiens bármilyen vegyület vagy vegyületkombináció lehet, amely elõsegíti a vektor (vagy egy találmány szerinti vektorral in vitro expresszáltatott fehérje) beadását; elõnyösen a hordozó, vehikulum vagy excipiens elõsegítheti a transzfekciót és/vagy tartósabbá teheti a vektort (vagy fehérjét). A dózisokat és dózistérfogatokat a leírásban általánosságban tárgyaljuk, és technikában 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 jártas szakember a technika szerinti tudással összefüggésben elolvasott leírás alapján indokolatlan kísérletezés nélkül meg tudja határozni azokat. A plazmidokban történõ alkalmazásra elõnyösen, de nem kizárólagosan megfelelõ, kvaterner ammóniumsót tartalmazó kationos lipidek elõnyösen az alábbi képletûek: amelyben R 1 jelentése telített vagy telítetlen, egyenes láncú, 12 18 szénatomos alifás gyök, R 2 jelentése egyéb, 2¹3 szénatomos alifás gyök, X jelentése pedig amin- vagy hirdoxicsoport, például DMRIE. A találmány egy másik megvalósítási módjában a kationos lipid egy természetes lipiddel, például DOPE-vel lehet asszociált. E lipidek közül elõnyös a DMRIE [N¹(2¹hidroxietil)¹N,N-dimetil-2,3-bisz(tetradecil-oxi)-1-propán-ammónium; WO96/34109], elõnyösen egy természetes lipiddel, a DMRIE-DOPE kialakítása érdekében elõnyösen DOPE-vel [dietil-oxi-foszfatidil-etanol-amin; Behr P. és munkatársai, Bioconjugate Chemistry 5, 382 389 (1994)] asszociált formában. Amennyiben jelen van DOPE, a DMRIE és a DOPE mólaránya elõnyösen a körülbelül 95 a körülbelül 5¹höz és a körülbelül 5 a körülbelül 95¹höz között van, elõnyösen körülbelül 1 a körülbelül 1¹hez, például 1:1. A DMRIE vagy DMRIE-DOPE adjuváns és a plazmid tömegaránya a körülbelül 50 a körülbelül 1¹hez és a körülbelül 1 a körülbelül 10¹hez között lehet, így például a körülbelül 10 a körülbelül 1¹hez és a körülbelül 1 a körülbelül 5¹höz között van, és elõnyösen a körülbelül 1 a körülbelül 1¹hez és a körülbelül 1 a körülbelül 2¹höz között van, például 1:1 vagy 1:2. A gyógyászati készítmények beadhatók közvetlenül in vivo, és a kódolt termék a vektorral expresszáltatható a gazdában. A Nipah-vírus glikoproteint kódoló vektor in vivo bejuttatására szolgáló eljárások [lásd például: 6,423,693 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; EP 102286 és EP 1205551 számú szabadalmi iratok; 20040057941 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, WO 9905300 számú irat és Draghia-Akli és munkatársai, Mol. Ther. 6(6), 830 61 (2002. dec.)] a találmány szerinti Nipah-vírus bejuttatásához módosíthatók. Technikában jártas szakember el tudja végezni egy Nipah-vírus glikoproteint kódoló vektornak a leírásban ismertetett in vivo bejuttatását. A találmány szerinti gyógyászati és/vagy terápiás készítmények és/vagy formulák elõnyösen a találmány szerinti egy vagy több expressziós vektor olyan hatásos mennyiségét tartalmazzák, lényegében abból állnak vagy abból állnak, amellyel kiváltható terápiás válasz; a hatásos mennyiségek a leírás és a technika szerinti tudás alapján indokolatlan kísérletezés nélkül meghatározhatók. A találmány szerinti immunogén készítmények és oltóanyagok egy vagy több adjuvánst is tartalmazhat- 9

1 HU 008 370 T2 2 nak. A találmány gyakorlatában történõ alkalmazás szempontjából különösen megfelelõ adjuvánsok az alábbiak: (1) akril- vagy metakrilsavpolimerek, maleinsavanhidrid- és alkenilszármazék-polimerek, (2) immunostimuláló szekvenciák (ISS), így például olyan oligodezoxiribonukleotidszekvenciák, amelyek egy vagy több nem metilezett CpG-egységet tartalmaznak [Klinman D. M. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93, 2879 2883 (1996); W098/16247], (3) valamely olaj a vízben típusú emulzió, így például az SPTemulzió, amelynek ismertetése a Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach ( Oltóanyag-tervezés, az alegység és adjuváns módszer ) címû kötet [kiadó: M. Powell, M. Newman, Plenum Press (1995)] 147. oldalán található, és az MF59-emulzió, amelynek ismertetése ugyanezen munka 183. oldalán található, (4) kvaterner ammóniumsót tartalmazó kationos lipidek, (5) citokinek, (6) alumínum-hidroxid vagy alumínum-foszfát vagy (7) a leírásban hivatkozott és a kitanítás részét képezõ iratokban tárgyalt egyéb adjuvánsok, vagy (8) ezek bármely kombinációja vagy keveréke. Az olaj a vízben típusú emulzió (3), amely különösen megfelelõ a virális vektorokhoz, a következõkön alapulhat: könnyû, folyékony paraffinolaj (az Európai Gyógyszerkönyvnek megfelelõ típusú), izoprénolaj, így például szkvalán, szkvalén, alkének, például izobutén vagy decén oligomerizációjával kapott olaj, egyenes láncú alkilcsoportokat tartalmazó savak és alkoholok észterei, így például növényi olajak, etil-oleát, propilénglikol, di(kaprilát/kaprát), glicerintri(kaprilát/kaprát) és propilénglikol-dioleát, vagy elágazó láncú zsíralkoholok vagy savak észterei, különösen az izosztearinsav-észterek. Az emulzió kialakítása érdekében az olajat emulgeálószerekkel együtt alkalmazzuk. Az emulgeálószerek lehetnek nemionos felületaktív anyagok, így például: egyrészrõl szorbitán, mannid (például anhidromannitol-oleát), glicerin, poliglicerin vagy propilénglikol és másrészrõl olein¹, izosztearin¹, ricinolein- és hidroxi-sztearinsavak észterei, amely észterek adott esetben etoxilezettek, polioxi-propilén polioxi-etilén kopolimer blokkok, így például Pluronic, például L121. Az (1) típusú adjuvánspolimerek közül elõnyösek a keresztkötött, különösen cukrok vagy polialkoholok polialkenil-étereivel keresztkötött akrilsav- és metakrilsavpolimerek. Az ilyen vegyületek karbomer néven ismertek (Európai Gyógyszerkönyv, Pharmeuropa 8. kötet, 2. szám, 1996. június). Technikában jártas szakember tehát megtekintheti a 2,909,462 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat is, amely egy legalább három, elõnyösen legfeljebb 8 hidroxicsoportot tartalmazó, olyan polihidroxivegyülettel keresztkötött akrilpolimereket ismertet, amelyben a legalább három hidroxicsoport hidrogénatomjait legalább két szénatomos, telítetlen, alifás gyökök helyettesítik. Az elõnyös gyökök 2 4 szénatomot tartalmaznak, például vinilek, allilok és egyéb etilénesen telítetlen csoportok. A telítetlen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 gyökök más szubsztituenseket, így például metilt is tartalmazhatnak. Különösen megfelelõek a Carbopol néven forgalmazott termékek (BF Goodrich, Ohio, USA). Ezek allil-szacharózzal vagy allil-pentaeritritollal vannak keresztkötve. Közülük a Carbopol 974P¹re, 934P¹re és 971P¹re hivatkozunk. A maleinsavanhidrid-alkenil-származék kopolimerek tekintetében elõnyösek az EMA¹k (Monsanto), amelyek egyenes láncú vagy keresztkötött etilén-maleinsavanhidrid kopolimerek és például divinil-éterrel vannak keresztkötve. Hivatkozás: J. Fields és munkatársai, Nature 186, 778 780 (1960. június 4.). A szerkezet tekintetében az akrilsav- vagy metakrilsavpolimerek és az EMA elõnyösen az alábbi képletû alapegységekbõl épülnek fel: amelyben: R 1 és R 2, amelyek lehetnek azonosak vagy különbözõk, jelentése H vagy CH 3 x=0 vagy 1, elõnyösen x=1 y=1 vagy 2, és x+y=2. Az EMA esetében x=0 és y=2, a karbomerek esetében pedig x=y=1. Az ilyen polimerek vízben vagy fiziológiás sóoldatban (20 g/l NaCl) oldhatók, és a ph például marónátronnal (NaOH) 7,3 és 7,4 közé állítható, hogy így olyan adjuvánsoldatot állítsunk elõ, amiben az expressziós vektorok) felvehetõk. A végleges oltóanyag-készítmény polimerkoncentrációja 0,01 és 1,5 vegyes%, elõnyösen 0,05 és 1 vegyes% között mozoghat és elõnyösen 0,1 és 0,4 vegyes% közötti. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti gyógyászati és/vagy terápiás készítményeket és/vagy formulákat injekciózással adjuk be, így például többek között intramuszkuláris (IM), intradermális (ID) vagy szubkután (SC) injekcióban. A terápiás készítménnyel összefüggésben a leírás és a technika szerinti tudás alapján technikában jártas szakember indokolatlan kísérletezés nélkül meg tudja határozni a beadások számát, a beadási útvonalat és a dózisokat, amelyeket az egyes injekciózási protokolloknál alkalmazni kell. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a rekombináns oltóanyag beadható egy sertésnek vagy megfertõzhetünk vagy transzfektálhatunk vele sejteket az alábbi mennyiségekben: dózisonként például 2 ml¹es dózisonként körülbelül legalább 10 3 pfu; elõnyösebben körülbelül 10 4 pfu és körülbelül 10 10 pfu között, például körülbelül 10 5 pfu és körülbelül 10 9 pfu között, például körülbelül 10 6 pfu és körülbelül 10 8 pfu között. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a dózis dózisonként körülbelül 10 8 pfu. Az eljárás magában foglalja a találmány szerinti terápiás készítmény egy hatásos mennyiségének legalább egyszeri beadását egy állatnak. Az állat lehet 10

1 HU 008 370 T2 2 hím, nõstény, terhes nõstény és újszülött. A beadás történhet különösen intramuszkuláris (IM), intradermális (ID) vagy szubkután (SC) injekcióval, vagy intranazálisan vagy orális beadással. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti terápiás készítményt fecskendõvel vagy tûmentes rendszerrel [mint például a Pigjet, a Biojector vagy a Vitajet (Bioject, Oregon, USA)] adhatjuk be. Egy további módszer a plazmid beadására az elektroporézis alkalmazása, lásd például S. Tollefsen és munkatársai, Vaccine 20, 3370 3378 (2002); S. Tollefsen és munkatársai, Scand. J. Immunol. 57, 229 238 (2003); S. Babiuk és munkatársai, Vaccine, 20, 3399 3408 (2002); WO99/01158 számú PCT-bejelentés. A találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények állatok Nipah-vírus fertõzés elleni vakcinázásához. A találmány egy adott megvalósítási módjában a találmány szerinti Nipah-F¹et és Nipah-G¹t tartalmazó gyógyászati készítményeket állatokban a Nipah-vírusok által okozott fertõzések elleni vakcinázásra alkalmazzuk. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában az állat sertés. A találmány egy másik elõnyös megvalósítási módjában az állat macska, kutya, ló vagy ember. A találmány tárgyát képezi a Nipah-vírus egy elsõ állat és egy második állat közötti átadásának megelõzésére szolgáló eljárás, amelynek során a leírásban ismertetett bármely eljárás szerint immunizálunk vagy immunválaszt váltunk ki egy elsõ állatban annak érdekében, hogy megelõzzük a betegség átadását a második állatnak. A találmány egy adott megvalósítási módjában a találmány szerinti Nipah-F¹et és Nipah-G¹t tartalmazó gyógyászati készítményeket az elsõ állatokban a Nipah-vírusok által okozott fertõzések elleni vakcinázásra alkalmazzuk. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában az elsõ állat sertés. A második állat macska, kutya, vagy ló, elõnyösen ember. A találmány tárgyát képezi továbbá reagenskészlet a fent ismertetett eljárások bármelyikének elvégzéséhez, amely tartalmazza a találmány szerinti készítmények bármelyikét, és adott esetben utasításokat is tartalmaz az eljárás elvégzéséhez. A találmányt a továbbiakban példák segítségével ismertetjük. A valamely Nipah-vírus glikoproteint kódoló kanárihimlõvírus-vektorok vonatkozásában ezeket a találmány illusztrációjának tekinthetjük. A példák tartalmát képezõ egyéb információk csak tájékoztató jellegûek. Példák 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. példa: Konstrukciók A psl 6802 1 4 jelû plazmid összeállítása. A psl 6802 1 4 tartalmazza a C5¹lókusz szegélyezõ szekvenciáit, a H6 vakcíniapromotert és a Nipah-vírus G¹génjét a VCP2199 elõállítása céljából. A Nipah-vírust humán CSF-bõl izoláltuk. A Nipah-G-gént PCR-rel tisztítottuk és beillesztettük a ptml plazmidba, így kaptuk a ptm1 Nipah-G¹t. A cél az volt, hogy összeállítsunk egy pc5 H6p Nipah¹G donorplazmidot egy Nipah- G¹t expresszáló rekombináns ALVAC kanárihimlõ-vírus elõállítása céljából. A plazmid neve pc5 H6p Nipah¹G, psl 6802 1 4 volt. A plazmid gerincét a pcxl 148 2, a H6 vakcíniapromotert tartalmazó pc5 H6p, és a C5 inszerciós lókusznak megfelelõ bal és jobb kar képezte. A pcxl 158 2 plazmidot a pnvqh6c5lsp 18 plazmidból állítottuk elõ egyetlen bázis mutációjával (T¹bõl C) a C5 jobb karjában. A pnvqh6c5lsp 18 plazmidot S. Loosmore és munkatársai: (US2005/0031641) ismertetik. A Nipah-G-gént PCR-rel amplifikáltuk, templátként a ptm1 Nipah-G¹t, továbbá a 11470.SL és a 11471.SL láncindítókat alkalmazva (2B. ábra). A ~1,8 kb hosszúságú PCR-fragmenst pcr2.1¹be klónoztuk, így kaptuk a psl 6771 1 1 klónt (pcr2.1 H6p Nipah¹G), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (2C. ábra). A psl 6771 1-1-bõl származó 1,8 kb hosszúságú NruI XhoI H6p Nipah-G-fragmenst pcxl 148 2¹be klónoztuk (pc5 H6p), így kaptuk a psl 6802 1 4¹et (pc5 H6p Nipah¹G), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (2C. és 2D. ábra). A psl 6802 2 5 jelû plazmid összeállítása. A psl 6802 2 5 tartalmazza a F8¹lókusz szegélyezõ szekvenciáit, a H6 vakcíniapromotert és a Nipah-vírus G¹génjét a VFP2200 elõállítása céljából. A Nipah-vírust humán CSF-bõl izoláltuk. A Nipah-G-gént PCR-rel tisztítottuk és beillesztettük a ptml plazmidba, így kaptuk a ptml Nipah-G¹t. A cél az volt, hogy összeállítsunk egy pf8 H6p Nipah¹G donorplazmidot egy Nipah-G¹t expresszáló baromfihimlõ-rekombináns elõállítása céljából. A plazmid neve pf8 H6p Nipah¹G, psl 6802 2 5 volt. A plazmid gerincét a psl 6427 2 1, a H6 promotert tartalmazó pf8 H6p, és az F8 inszerciós lókusz bal és jobb karja képezte. A psl 6427 2 1 plazmidot a psl 5440 5 1 plazmidból állítottuk elõ egyetlen bázis mutációjával (C¹bõl T) az F8 bal karjában. A psl 5440 5 1 plazmidot S. Loosmore és munkatársai: (US2005/0031641) ismertetik. A Nipah-G-gént PCR-rel amplifikáltuk, templátként a ptml Nipah-G¹t, továbbá a 11470.SL és a 11471.SL láncindítókat alkalmazva (3A. ábra). A ~1,8 kb hosszúságú PCR-fragmenst pcr2.1¹be klónoztuk, így kaptuk a psl 6771 1 1 klónt (pcr2.1 H6p Nipah¹G), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (3B. ábra). A psl 6771 1-1-bõl származó ~1,8 kb hosszúságú NruI XhoI H6p Nipah-G-fragmenst psl 6427 2 1¹be klónoztuk (pf8 H6p), így kaptuk a psl 6802 2 5¹öt (pf8 H6p Nipah¹G), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (3B. és 3C. ábra). A psl 6839 1 jelû plazmid összeállítása. A psl 6839 1 tartalmazza az F8¹lókusz szegélyezõ szekvenciáit, a H6 vakcíniapromotert és a Nipah-vírus F¹génjét a VFP2207 elõállítása céljából. A Nipah-vírust humán CSF-bõl izoláltuk. A Nipah-F-gént PCR-rel tisztítottuk és beillesztettük a ptm1 plazmidba, így kaptuk a ptm1 Nipah-F¹et. A cél az volt, hogy összeállítsunk egy pf8 H6p Nipah¹F donorplazmidot egy Nipah-F¹et expresszáló baromfihimlõ- rekombináns elõállítása céljából. A plazmid neve: pf8 H6p Nipah¹F, psl 6839 1. A plazmid gerincét a psl 6427 2 1, a H6 vakcíniapromotert tartalmazó pf8 H6p, és az F8 inszerciós lókusz bal és jobb karja képezte. 11

1 HU 008 370 T2 2 Volt egy belsõ T5NT szekvencia a Nipah-F-ben, amelyet helyspecifikusan irányított mutagenezissel eltávolítottunk. Egy, a H6 promoter 3 ¹végét kódoló fragmenst és a Nipah F¹génjének 5 ¹végét a 11457.SL és a 11458.SL láncindítók segítségével PCR-rel amplifikáltuk. Az amplifikált fragmensbõl eltávolítottuk a T5NT szekvenciát és a klónozások céljára beleépítettünk egy ApaI-helyet (4B. ábra). A fragmenst pcr2.1¹be klónoztuk, így kaptuk a psl 6797 3 1¹et (pcr2.1 H6p 5 ¹Nipah¹F, T5NT nélkül), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (4C. ábra). A 3 ¹Nipah¹F fragmenst a 11456.SL és a 11459.SL láncindítók segítségével PCR-rel amplifikáltuk. Az amplifikált fragmensbõl eltávolítottuk a T5NT szekvenciát és a klónozások céljára beleépítettünk egy ApaI-helyet (4B. ábra). A fragmenst pcr2.1¹be klónoztuk, így kaptuk a psl 6797 4 1¹et (pcr2.1 3 ¹Nipah¹F, T5NT nélkül), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (4C. ábra). A psl 6797 3 1- bõl származó ~0,7 kb hosszúságú NruI-BamHI H6p 5 ¹Nipah-F-fragmenst psl 6427 2 1¹be illesztettük be (pf8 H6p), így kaptuk a psl 6830 1¹et (pf8 5 ¹Nipah¹F). A psl 6797 4 1-bõl származó ~1,0 kb hosszúságú Apal-BamHI 3 ¹Nipah-F-fragmenst a psl 6830 1 ApaI- és BamHI-helyei közé illesztettük be, így kaptuk a psl 6839 1¹et (pf8 H6p Nipah¹F), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (4C. és 4D. ábra). A psl 6851 29 jelû plazmid összeállítása. A psl 6851 29 tartalmazza az C5¹lókusz szegélyezõszekvenciáit, a H6 vakcíniapromotert és a Nipah-vírus F¹génjét a VCP2208 elõállítása céljából. A Nipah-vírust humán CSF-bõl izoláltuk. A Nipah-F-gént PCR-rel tisztítottuk és beillesztettük a ptm1 plazmidba, így kaptuk a ptm1 Nipah-F¹et. A cél az volt, hogy összeállítsunk egy pc5 H6p Nipah¹F donorplazmidot egy Nipah-F¹et expresszáló ALVAC kanárihimlõvírus-rekombináns elõállítása céljából. A plazmid neve psl 6851 29, pc5 H6p Nipah¹F volt. A plazmid gerincét a pcxl 148 2, a H6 vakcíniapromotert tartalmazó pc5 H6p, és a C5 inszerciós lókusz bal és jobb karja képezte. Volt egy belsõ T5NT szekvencia a Nipah-F-ben, amelyet helyspecifikusan irányított mutagenezissel eltávolítottunk. Egy, a H6 promoter 3 ¹végét kódoló fragmenst és a Nipah-F-gén 5 ¹végét a 11457.SL és a 11458. SL láncindítók segítségével PCR-rel amplifikáltuk. Az amplifikált fragmensbõl eltávolítottuk a T5NT szekvenciát és a klónozások céljára beleépítettünk egy ApaI-helyet (5A. ábra). A fragmenst pcr2.1¹be klónoztuk, így kaptuk a psl 6797 3 1¹et (pcr2.1 H6p 5 ¹Nipah¹F, T5NT nélkül), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (5B. ábra). A 3 ¹Nipah¹F fragmenst a 11456.SL és a 11459.SL láncindítók segítségével PCR-rel amplifikáltuk. Az amplifikált fragmensbõl eltávolítottuk a T5NT szekvenciát és a klónozások céljára beleépítettünk egy ApaI-helyet (5A. ábra). A fragmenst pcr2.1¹be klónoztuk, így kaptuk a psl 6797 4 1¹et (pcr2.1 3 ¹Nipah¹F, T5NT nélkül), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (5B. ábra). A psl 6797 3 1- bõl származó ~0,7 kb hosszúságú NruI-BamHI H6p 5 ¹Nipah-F-fragmenst psl 6427 2 1¹be illesztettük be 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (pf8 H6p), így kaptuk a psl 6830 1¹et (pf8 5 ¹Nipah¹F). A psl 6797 4 1-bõl származó ~1,0 kb hosszúságú ApaI-BamHI 3 ¹Nipah-F-fragmenst a psl 6830 1 ApaI- és BamHI-helyei közé illesztettük be, így kaptuk a psl 6839 1¹et (pf8 H6p Nipah¹F), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk. A psl 6839 1-bõl származó ~1,7 kb hosszúságú Nrul- Xmal H6p Nipah-F-fragmenst pcxl 148 2¹be illesztettük be (pc5 H6p), így kaptuk a psl 6851 29¹et (pc5 H6p Nipah¹F), amelyet szekvenciaanalízissel ellenõriztünk (5B. és 5C. ábra). A Nipah-F¹et expresszáló baromfihimlõ-rekombináns (vfp2207) összeállítása. A gén a Nipah¹F volt. A donorplazmid a psl 6839 1 volt. Az inszerciós hely a baromfihimlõ F8¹lókusza volt. A promoter a vakcíniavírus H6 promotere volt. Az in vitro rekombinációhoz alkalmazott sejtek elsõsorban csirkeembrióból származó fibroblasztsejtek (1 CEF) voltak, amelyeket 10% FBS¹t tartalmazó DMEM-ben tenyésztettünk. Az in vitro rekombinációt az 1 CEF-sejtek transzfekciójával végeztük, a psl 6839 1 nem I¹linearizált donorplazmiddal (20 g). A transzfektált sejteket ezután mentõ ( rescue ) vírusként baromfihimlõszal fertõztük, 10¹es MOI-értéknél. 48 óra után learattuk és szonikáltuk a transzfektált-fertõzött sejteket, majd a rekombináns vírusok szûrésére alkalmaztuk. A rekombináns plakkokat a plakkemelõ hibridizáltatási ( plaque lift hybridization ) eljárás alapján, egy tormaperoxidázzal megjelölt Nipah-F-specifikus próba segítségével szûrtük. Négy egymást követõ plakktisztítási kör után kaptuk a vfp2207-nek elnevezett rekombináns vektort és hibridizáltatással ellenõrizve 100%¹os pozitivitást mutatott a beillesztett szekvenciára és 100%¹os negativitást az F8 leolvasási keretére. A Nipah-G¹t expresszáló kanárihimlõ-rekombináns (VCP2199) összeállítása. A gén a Nipah¹G volt. A donorplazmid a psl 6802 1 4 volt. Az inszerciós hely a C5 volt. A promoter a H6 promoter volt. Az in vitro rekombinációhoz alkalmazott sejtek elsõsorban csirkeembrióból származó fibroblasztsejtek (1 CEF) voltak, amelyeket 10% FBS¹t tartalmazó DMEM-ben tenyésztettünk. Az in vitro rekombinációt az 1 CEF-sejtek transzfekciójával végeztük, a psl 6802 1 4 nem I¹linearizált donorplazmiddal (15 g). A transzfektált sejteket ezután mentõvírusként ALVAC-kal fertõztük, 10¹es MOInél. 24 óra után learattuk és szonikáltuk a transzfektáltfertõzött sejteket, majd a rekombináns vírusok szûrésére alkalmaztuk. A rekombináns plakkokat a plakkemelõ hibridizáltatási eljárás alapján, egy tormaperoxidázzal megjelölt Nipah-G-specifikus próba segítségével szûrtük. Öt egymást követõ plakktisztítási kör után kaptuk a vcp2199-nek elnevezett rekombinánst és hibridizáltatással ellenõrizve 100%¹os pozitivitást mutatott a beillesztett Nipah¹G szekvenciára és 100%¹os negativitást a C5 leolvasási keretére. A Nipah-G¹t expresszáló rekombináns baromfihimlõ-vektor (vfp2200) összeállítása. A gén a Nipah¹G volt. A donorplazmid a psl6802 2 5 volt. Az inszerciós hely az F8 volt. A promoter a H6 promoter volt. Az in vitro rekombinációhoz alkalmazott sejtek elsõsorban 12

1 HU 008 370 T2 2 csirkeembrióból származó fibroblasztsejtek (1 CEF) voltak, amelyeket 10% FBS¹t tartalmazó DMEM-ben tenyésztettünk. Az in vitro rekombinációt az 1 CEF-sejtek transzfekciójával végeztük, a psl6802 2 5 nem I¹linearizált donorplazmiddal (15 g). A transzfektált sejteket ezután mentõvírusként baromfihimlõszal fertõztük, 8¹as MOI-nél. 48 óra után learattuk és szonikáltuk a transzfektált-fertõzött sejteket, majd a rekombináns vírusok szûrésére alkalmaztuk. A rekombináns plakkokat a plakkemelõ hibridizáltatási eljárás alapján, egy tormaperoxidázzal megjelölt Nipah-G-specifikus próba segítségével szûrtük. Négy egymást követõ plakktisztítási kör után kaptuk a vfp2200-nak elnevezett rekombinánst. Hibridizáltatással ellenõriztük õket és 100%¹os pozitivitást mutattak a beillesztett Nipah¹G szekvenciára és 100%¹os negativitást az F8 leolvasási keretére. A Nipah-F¹et expresszáló baromfihimlõ-rekombináns (vcp2208) összeállítása. A gén a Nipah¹F volt. A donorplazmid a psl 6851.29 (pc5 H6p Nipah¹F) volt. Az inszerciós hely a C5 volt. A promoter a vakcínia H6 promotere volt. Az in vitro rekombinációhoz alkalmazott sejtek elsõsorban csirkeembrióból származó fibroblasztsejtek (1 CEF) voltak, amelyeket 10% FBS¹t tartalmazó DMEM-ben tenyésztettünk. Az in vitro rekombinációt az TCEF-sejtek transzfekciójával végeztük, a psl6851.29 nem I¹linearizált donorplazmiddal (10 g). A transzfektált sejteket ezután mentõvírusként ALVAC-kal fertõztük, 10¹es MOI-nél. 24 óra után learattuk és szonikáltuk a transzfektált-fertõzött sejteket, majd a rekombináns vírusok szûrésére alkalmaztuk. A rekombináns plakkokat a plakkemelõ hibridizáltatási eljárás alapján, egy tormaperoxidázzal megjelölt Nipah-F-specifikus próba segítségével szûrtük. Négy egymást követõ plakktisztítási kör után kaptuk a vcp2208-nak elnevezett rekombináns vektort és hibridizáltatással ellenõrizve 100%¹os pozitivitást mutatott a beillesztett Nipah¹F szekvenciára és 100%¹os negativitást a C5 leolvasási keretére. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2. példa: Expresszáltatás A baromfihimlõ Nipah¹G vfp2200 Western-blottolása (6. ábra). Primer CEF-sejteket 10¹es MOI-nél vcp2199-cel (ALVAC C5 H6p Nipah¹G) és vfp2200- szal (baromfihimlõ F8 H6p Nipah¹G) fertõztünk, és 24 óráig 37 C¹on inkubáltunk. Ezután learattuk a sejteket és a tenyészet felülúszóját. A mintában lévõ fehérjéket 10%¹os SDS-PAGE gélen választottuk el, majd Immobilon nejlonmembránra vittük át. Tengerimalacból származó antiszérumot és kemilumineszcenciás rendszert alkalmaztunk. A Nipah¹G a vcp2199-hez és vfp2200-hoz tartozó sejtpelletekben expresszálódott. A felülúszóban nem jelent meg. Az ALVAC Nipah¹F vcp2208 Western-blottolása (7A. és 7B. ábra). Primer CEF sejteket 10¹es MOI-nél vcp2208-cal (ALVAC C5 H6p Nipah¹F) fertõztünk, és 24 óráig 37 C¹on inkubáltunk. Learattuk és derítettük a felülúszót. Learattuk a sejteket és lizálás céljából vízben felszuszpendáltuk. A lizátumot és a felülúszót 10% SDS- PAGE¹n választottuk el. A fehérjét nejlonmembránra vittük át és Western-blokkolópufferrel blokkoltuk. Tengerimalacból származó antiszérum és kemilumineszcens rendszer alkalmazásával kimutattuk az F¹fehérje expresszióját a vcp2208-ból (ALVAC C5 H6p Nipah¹F). Sertésbõl származó antiszérum és tormaperoxidázos rendszer alkalmazásával is kimutattuk az F¹fehérje expresszióját a vcp2208-ból, de alacsonyabb intenzitással. Az ALVAC Nipah¹G vcp2199 Western-blottolása (6. ábra). Primer CEF sejteket 10¹es MOI-nél vcp2199-cel (ALVAC C5 H6p Nipah¹G) és vfp2200- szal (baromfihimlõ F8 H6p Nipah¹G) fertõztünk, és 24 óráig 37 C¹on inkubáltunk. Ezután learattuk a sejteket és a tenyészet felülúszóját. A mintában lévõ fehérjéket 10%¹os SDS-PAGE gélen választottuk el, majd Immobilon nejlonmembránra vittük át. Tengerimalacból származó antiszérumot és kemilumineszcenciás rendszert alkalmaztunk. A Nipah¹G a vcp2199-hez és vfp2200-hoz tartozó sejtpelletekben expresszálódott. A felülúszóban nem jelent meg. A baromfihimlõ Nipah¹F vfp2207 Western-blottolása (7A és 7B. ábra). Primer CEF-sejteket 10 MOI-nél vfp2207-tel (baromfihimlõ F8 H6p Nipah¹F) fertõztünk, és 24 óráig inkubáltunk. Learattuk és derítettük a felülúszót. Learattuk a sejteket és lizálás céljából vízben felszuszpendáltuk. A lizátumot és a felülúszót 10% SDS-PAGE¹n választottuk el. A fehérjét nejlonmembránra vittük át és Western-blokkolópufferrel blokkoltuk. Tengerimalacból származó antiszérum és kemilumineszcens elõhívó rendszer alkalmazásával kimutattuk az F¹fehérje expresszióját a vfp2207-bõl (baromfihimlõ F8 H6p Nipah¹F). Sertésbõl származó antiszérum és tormaperoxidázos rendszer alkalmazásával is kimutattuk az F¹fehérje expresszióját a vfp2207-bõl, de alacsonyabb intenzitással. 3. példa: Szerológia és védelem Tizenhat sertést random módon négy csoportra osztottunk. Az F¹csoportba tartozó állatokat 10 8 pfu/dózis mennyiséggel immunizáltuk a Nipah-vírus F¹fehérjéjét expresszáló VCP2208-cal. A G¹csoportba tartozó állatokat10 8 pfu/dózis mennyiséggel immunizáltuk a Nipah-vírus G¹fehérjéjét expresszáló VCP2199-cel. A G+F csoportba tartozó állatokat egy olyan keverékkel immunizáltuk, ami 10 8 pfu/dózis mennyiségben tartalmazta a Nipah-vírus G¹fehérjéjét expresszáló VCP2199¹et és 10 8 pfu/dózis mennyiségben a Nipah-vírus F¹fehérjéjét expresszáló VCP2208¹at. Az immunizálási csoportba tartozó állatok vakcinázatlan kontroll állatok voltak. A sertéseknek a 0. és 14. napon intramuszkuláris úton adtuk be az injekciókat. A sertéseket a 28. napon intranazális inokuláció segítségével 2,5 10 5 pfu Nipahvírussal immunizáltuk. Az immunizálás után hét nappal a vírus jelenlétét RT¹PCR-rel vagy vírusizolálással határoztuk meg különbözõ szervekben és orrkenetekben. Vérvétel az elsõ injekció utáni 0., 7., 14., 21., 28., 29., 30., 31., 32., 34. és 35. napon történik, és az antitesttitereket közvetett IgG-ELISA-val vagy szeroneutralizálási tesztvizsgálattal mérjük. A neutralizáló antitesteket a korábban már leírt mikrotitráló plakkredukciós neutralizálási tesztvizsgálattal (mprnt) [H. Weingartl és 13

1 HU 008 370 T2 2 munkatársai, Can. J. Vet. Rrs. 67, 128 132 (2003)] határoztuk meg, Vero V 76-sejtek és 1%¹os karboxi-metil-cellulóz fedõréteg alkalmazásával. A Nipah-vírus neutralizáló antitestek jelenlétére pozitívnak a 90%¹os plakkredukciót mutató lyukakat tekintettük. Az ELISA és neutralizálási titer (NT) adatok az 1. táblázatban láthatók. A kombinált Nipah-F/G váltotta ki a legnagyobb immunizálás elõtti neutralizálótitert, amit szorosan követett a G¹oltóanyag. Az F¹oltóanyag kisebb mennyiségû neutralizáló antitestet indukált. Vírusplakk tesztvizsgálat: A vírusplakk tesztvizsgálatot 12 lyukú lemezeken (Costar, Corning, NY, USA) végeztük, vagy Vero¹76 vagy PT¹K75 konfluens egyrétegekkel. A vírusinokulumot (400 l/lyuk) 1 óráig 33 C¹on, 5% CO 2 alatt inkubáltuk a sejteken, majd 2 ml 2%¹os karboxi-metil-cellulózzal (nátriumsó, közepes viszkozitás, DMEM-ben elkészítve; Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) és 2% FBS fedõréteggel helyettesítettük, és 33 C¹on, 5% CO 2 alatt inkubáltuk. A sejteket 5 nap után 4%¹os formaldehiddel fixáltuk és (80% metanol/pbs-ben elkészített) 0,5%¹os kristályibolyával festettük. A valósidejû RT¹PCR¹t csak szérum/plazma- és PBMC-mintákon végeztük V. Guillaume és munkatársai: [J. Virol. Method. 120, 229 237 (2004)] szerint, SmartCycler (Cepheid), Quantitech reagenskészlet (Qaigen), valamint az N¹génben elhelyezkedõ láncindítók és próba (Applied Biosystems International) alkalmazásával. A GCA CTT GAT GTG ATT AGA (SEQ ID NO: 29) elõre láncindító és a GGC AGT GTC GGG AGC TGT AA (SEQ ID NO: 30) vissza láncindító, amelyek az N¹génben helyezkednek el, egy 395 bp¹os amplikont eredményez. A valósidejû RT¹PCR¹t a Nipahvírus pshame2a plazmidba klónozott N¹génjének segítségével standardizáltuk, 100 l mintában, 300 másolat/reakció érzékenység mellett. A 35. ciklusra pozitívvá váló mintákat negatívnak tekintettük. A Nipah-vírust nagyon alacsony titer mellett izoláltuk a 33. számú (egy plakk), a 35. számú (egy plakk) és a 36. számú sertés trigeminális ganglionjából. A kontroll állatokban számos szövetbõl akár 10 3 pfu/ml mennyiségben tudtuk újraizolálni a Nipah-vírust: a 39. számú sertés pozitív az orrkagylókban, a légcsõben, a bulbus olfactoriusban, a trigeminális ganglionban, a bronchioláris nyirokcsomóban és az állkapocs alatti nyirokcsomókban (LN); a 40. számú sertés pozitív az orrkagylókban, a légcsõben, a bulbus olfactoriusban, az agyhártyákban, a trigeminális ganglionban, a bronchioláris LN¹ekben, az állkapocs alatti LN¹ekben és az agyban. Az RT¹PCR eredményei a 2. és 3. táblázatban láthatók. Az értékek küszöbciklusszámok. Nem mutattunk ki RNS¹t az immunizált sertések plazmájában, szérumában vagy az F/G¹oltóanyaggal immunizált sertések PBMC-jében. A fenti eredmények egyértelmûen védelmet mutatnak a Nipah-vírus vagy F¹fehérjéjét vagy G¹fehérjéjét expresszáló rekombinánssal, a Nipah-vírus F¹ és G¹fehérjéjének kombinációjával (F+G) pedig teljes védelmet. 4. példa: Keresztneutralizálás Tizennyolc sertést random módon négy csoportra osztottunk. Az F¹csoportba tartozó 4 állatot 10 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 pfu/dózis mennyiségben immunizáltuk a Nipah-vírus F¹fehérjéjét expresszáló vcp2208-cal. A G¹csoportba tartozó 4 állatok 10 8 pfu/dózis mennyiségben immunizáltuk a Nipah-vírus G¹fehérjéjét expresszáló vcp2199-cel. A G+F csoportba tartozó 4 állatot egy olyan keverékkel immunizáltuk, ami 10 8 pfu/dózis mennyiségben a tartalmazta a Nipah-vírus G¹fehérjéjét expresszáló vcp2199¹et és 10 8 pfu/dózis mennyiségben a Nipah-vírus F¹fehérjéjét expresszáló vcp2208¹at. Vakcinázatlan kontrollcsoportként 6 állatot természetes úton megfertõztünk Nipah-vírusokkal és a fertõzés után legfeljebb a 28. napig (dpi) neveltük õket. Ezt a csoportot úgy neveztük, hogy hosszú távú fertõzés. Az F¹, G¹ és G+F csoportba tartozó sertéseknek a 0. és 14. napon intramuszkuláris úton adtuk be az injekciókat. Vérvétel a vakcinázást követõ 27. napon (dpv) történik és az antitesttitereket szeroneutralizációs tesztvizsgálattal mérjük. A neutralizáló antitesteket a korábban már leírt mikrotitráló plakkredukciós neutralizálási tesztvizsgálattal (mprnt) [H. Weingartl és munkatársai, Can. J. Vet. Rrs. 67, 128 132 (2003)] határoztuk meg, Vero V 76-sejtek alkalmazásával, amelyeket 1,2 10 5 sejt/cm 2 (40 000 sejt/lyuk) mennyiségben oltottunk le 96 lyukú lemezekre, 5% CO 2 alatt, 37 C¹on inkubáltuk 10% FBS-sel kiegészített DMEMtápközeggel. Az (1/10-tõl 1/1280¹ig terjedõ) kétszeres hígításokból 100-100 l¹t 5% CO 2 alatt, 37 C¹on, 100 l (1000 pfu/100 l¹re beállított koncentrációjú) Hendravírussal vagy Nipah-vírussal inkubáltunk. Minden hígítást DMEM-ben készítettünk el. Az inkubálást követõen a fenti keverék 100 l¹ét V76-sejt egyrétegekre vittük át. Az inokulumot tartalmazó lemezt 1 óráig 5% CO 2 alatt37 C¹on inkubáltuk. 1 órás inkubálást követõen eltávolítottuk az inokulumot és 100 l (2% FBS-sel kiegészített DMEM-ben elkészített) 2%¹os karboxi-metil-cellulóz-oldattal helyettesítettük. A lemezeket 72 óráig 5% CO 2 alatt37 C¹on inkubáltuk. A Nipah-vírus visszatitrálása azt az eredményt adta, hogy a munkahígítás 500 pfu/lyuk volt, a Hendravírus esetében pedig 625 pfu/lyuk. Megjegyzés: Az F¹fehérjével vakcinázott sertések szérumait 1/50 aránytól 1/2400 arányig kétszeresen hígítottuk. A Nipah-vírus neutralizáló antitestek vagy a Hendra-vírus neutralizáló antitestek jelenlétére pozitívnak a 90%¹os plakkredukciót mutató lyukakat tekintettük. A neutralizálási titer adatok az 4. táblázatban láthatók. A kombinált Nipah-F/G szinergikus hatást váltott ki a Hendra-vírus elleni antitestek termelésében, amelyek a Nipah-vírusokkal való természetes fertõzõdés során nem termelõdnek (lásd a hosszú távú fertõzési csoport eredményeit). A G¹oltóanyag vagy az F¹oltóanyag önmagában nem indukált neutralizáló antitesteket a Hendra-vírusok ellen, vagy alacsonyabb szinten, mint az F+G oltóanyag. Nincs korreláció a Nipah-vírusok elleni antitestek és a Hendra-vírusok elleni antitestek titerszintjei között. 14

1. táblázat ELISA és NT¹adatok (dpv=a vakcinázás után eltelt napok száma, dpi=a fertõzés után eltelt napok száma) ELISA adatok N4F N4 G Immunizálás N4¹gyel N4 G+F a sertés száma: 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. A vakcinázás elõtt 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 dpv 0 0 0 0 0 0 0 0 14 dpv emlékeztetõ oltás 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0 100 21 dpv 0 0 0 0 1600 3200 3200 1600 1600 6400 1600 6400 az immunizálás elõtt 1 dpi 2 dpi 3 dpi 4 dpi 5 dpi 6 dpi 7 dpi 8 dpi NT-adatok N4F N4 G immunizálás N4¹gyel N4 G+F a sertés száma: 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. a vakcinázás elõtt <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 7 dpv <20 <20 <20 <20 x x x x 20 20 <20 <20 14 dpv emlékeztetõ oltás x x x x 40 30 40 <20 20 20 40 40 21 dpv 80 <160 80 <320 1280 <320 1280 1280 1280 1280 320 640 Pre 15

2. táblázat Valós idejû RT¹PCR szövetekben (CSF=cerebrospinális folyadék, LN=nyirokcsomó) Minta 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. RT 40. RT 41. RT 42. RT 43. 44. 45. 46. F G immunizálás F+G Hátsóagy 28 31 CSF nd 0 29,3 29,6 Bulbus olfactorius /3 2 30 25 18 19 Trigeminális ganglion 28,5 30 32 26 18 19 Orrkagyló 19 20 Légcsõ 29 31 31 18 19,7 24 24,8 24,3 24,8 23,5 23,8 25,1 25 18 27,6 30,8 19 29 28,2 30,5 28,9 nd 18,8 23,8 25,6 29 0 Tüdõ 0 Állkapocs alatti LN 23 23? nd 3. táblázat Valós idejû RT¹PCR, garatkenetvétel Minta 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. RT 40. RT 41. RT 42. RT 43. 44. 45. 46. F G immunizálás F+G Garatkenetvéte 1 dpi Garatkenetvétel2 dpi Garatkenetvétel3 dpi 28 27,5 31,3 31,8 29,4 27,7 Garatkenetvétel4 dpi Garatkenetvéte 6 dpi 25,3 27,3 28,5 28,3 16

1 HU 008 370 T2 2 4. táblázat Neutralizálási titerek Csoportok Hosszú távú fertõzés F-fel vakcinázott G-vel vakcinázott G+F-fel vakcinázott dpi 23 11 29 27 24 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 dpv 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 320 320 640 640 640 1280 200 200 200 400 640 1280 2560 1280 1280 1280 640 1280 Nipah-vírus fertõzés 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 20 0 0 80 80 80 80 Hendra-vírus titrálás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A találmányt a továbbiakban az alábbi számozott bekezdések segítségével ismertetjük: 1. Madárhimlõ expressziós vektor, amely egy Nipah-vírus glikoproteint kódoló polinukleotidot tartalmaz, amelyben a madárhimlõ expressziós vektor kanárihimlõ-vektor. 2. Az 1. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a Nipah-vírus glikoprotein a kapcsolódási (G) fehérje. 3. Az 1. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a Nipah-vírus glikoprotein a fúziós (F) fehérje. 4. Az 1. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a Nipah-vírus glikoprotein a kapcsolódási (G) fehérje és a fúziós (F) fehérje. 5. A 2. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a polinukleotid tartalmazza a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 8943 10751. nukleotidbázisait. 6. A 3. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a polinukleotid tartalmazza a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 6654 8294. nukleotidbázisait. 7. A 4. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a polinukleotid a SEQ ID NO: 8 jelû peptidet kódolja. 8. A 2. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a polinukleotid a SEQ ID NO: 7 jelû peptidet kódolja. 9. A 3. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a polinukleotid a SEQ ID NO: 7 jelû peptidet és SEQ ID NO: 8 jelû peptidet kódolja. 10. Az 5. bekezdés szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a polinukleotid tartalmazza a SEQ ID NO: 1 jelû szekvencia 6654 10751. nukleotidbázisait. 11. Az 1 10. bekezdések szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a madárhimlõ expressziós vektor legyengített madárhimlõ expressziós vektor. 12. Az 11. bekezdés szerinti kanárihimlõ vektor, amelyben a kanárihimlõ vektor ALVAC. 13. Expressziós vektor, amelyben az expressziós vektor a vcp2199. 14. Expressziós vektor, amelyben az expressziós vektor a vcp2208. 15. Formula valamely Nipah-vírus glikoprotein bejuttatásra és expresszáltatására, amely formula 1 16. bekezdések bármelyike szerinti vektort és gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozót, vehikulumot vagy excipienst tartalmaz. 16. A 15. bekezdés szerinti formula, amelyben a hordozó, vehikulum vagy excipiens elõsegíti a transzfekciót és/vagy tartósabbá teszi a vektort. 17. Egy állatban immunválasz kiváltására alkalmas készítmény, amely készítmény immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazza az 1 14. bekezdések bármelyike szerinti vektort. 18. Egy állatban immunválasz kiváltására alkalmas készítmény, amely készítmény tartalmaz egy sejtet, 17

1 HU 008 370 T2 2 amely sejt immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazza az 1 14. bekezdések bármelyike szerinti vektort. 19. Egy állatban immunológiai vagy védekezõ válasz kiváltására alkalmas készítmény, amely készítmény immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazza az 1 14. bekezdések bármelyike szerinti vektort. 20. Egy állatban immunológiai vagy védekezõ válasz kiváltására alkalmas készítmény, amely készítmény tartalmaz egy sejtet, amely sejt immunválasz kiváltásához hatásos mennyiségben tartalmazza az 1 14. bekezdések bármelyike szerinti vektort. 21. A 17 20. bekezdések bármelyike szerinti készítmény, ahol az állat sertés. 22. A Nipah-vírus egy elsõ állat és egy második állat közötti átadásának megelõzésére alkalmas készítmény, amely a 17 20. bekezdések bármelyike szerinti készítményt tartalmaz, ahol az 17 20. bekezdések bármelyike szerinti állat az elsõ állat. 23. A 22. bekezdés szerinti készítmény, ahol az elsõ állat sertés. 24. A 22. vagy 23. bekezdés szerinti készítmény, ahol a második állat ember. 25. A 22. vagy 23. bekezdés szerinti készítmény, ahol a második állat macska vagy kutya. 26. Reagenskészlet, amely 1 14. bekezdések bármelyike szerinti vektort vagy a 15. vagy 16. bekezdések bármelyike szerinti formulát tartalmaz, és utasításokat a reagenskészlet 17 25. bekezdések bármelyike szerinti alkalmazásához. 5 10 15 20 25 30 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Madárhimlõ expressziós vektor, amely egy Nipah-vírus glikoproteint kódoló polinukleotidot tartalmaz; amelyben a madárhimlõ expressziós vektor kanárihimlõ-vektor. 2. Az 1. igénypont szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a Nipah-vírus glikoprotein a kapcsolódási (G) fehérje. 3. Az 1. igénypont szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a Nipah-vírus glikoprotein a fúziós (F) fehérje. 4. Az 1. igénypont szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a Nipah-vírus glikoprotein a kapcsolódási (G) fehérje és a fúziós (F) fehérje. 5. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti madárhimlõ expressziós vektor, amelyben a madárhimlõ expressziós vektor legyengített madárhimlõ expressziós vektor. 6. Az 1 5. igénypontok bármelyike szerinti kanárihimlõ-vektor, amelyben a kanárihimlõ-vektor ALVAC. 7. Az 1. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben az expressziós vektor a vcp2199. 8. Az 1. igénypont szerinti expressziós vektor, amelyben az expressziós vektor a vcp2208. 9. Készítmény Nipah-vírus glikoprotein bejuttatására és expresszáltatására, amely készítmény 1 8. igénypontok bármelyike szerinti vektort és gyógyszerészetileg vagy állatorvosilag elfogadható hordozót, vivõanyagot vagy excipienst tartalmaz. 10. A 9. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozó, vivõanyag vagy excipiens elõsegíti a transzfekciót és/vagy fokozza a vektor védelmét. 18

19

20