Ellenanyag reagensek előállítása II 2019.03.04. Sándor Noémi noemi.sandor@ttk.elte.hu
Ellenanyagok módosítása 1. Kémiai módosítás Részleges redukció láncok közötti diszulfid hidak megszűnnek, szabad SH csoportok jönnek létre Limitált proteolízis papain, pepszin Konjugálás (JELÖLÉS) Az ellenanyagot vagy a létrehozott fragmentumokat összekapcsoljuk más molekulákkal 2. Molekuláris biológiai módosítás jövő óra... http://www.genovis.com/ms-analysis-of-mabs
Ellenanyagok jelölése (=konjugálása) + Ellenanyag Jelölő anyag toxin/gyógyszer/ festék/enzim, stb... Jelölt ellenanyag
Ellenanyagok jelölése (=konjugálása) Mivel jelöljük az ellenanyagot Példa Mit detektálunk Milyen módszerben használjuk Enzim HRPO, AP Enzimreakciót (szubsztrát elhasítva világít/színt vált) ELISA, Western blot, immunhisztokémia Fluoreszcens festék FITC, PE, Alexa fetsékek, stb... Fluoreszcenciát (fényt) FACS, fluoreszcens mikroszkópia Fémkolloid arany, vas A fém tulajdonságait MACS, elektronmikroszkóp Radioaktív izotóp pl. 125 I Radioaktiv sugárzást RIA
Ellenanyagok jelölése (=konjugálása) +1 sokoldalú jelölés: biotin (B7 vitamin) b b avidin b b HRPO/ fluo festék/ fémkolloid/ izotóp Avidin (Streptavidin, Extravidin, Neutravidin) glikoprotein, hüllők, kétéltűek, madarak tojásfehérjéjében
Ellenanyagok felhasználási területei antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló módszerek (pl. ELISA, Western blot, immunhisztokémia) minőségi/mennyiségi meghatározások (pl. veszélyes anyagok kimutatása, finom különbségek kimutatása anyagok között) sejtpopulációk kimutatása/szeparálása/aktiválása/aktiváció vizsgálata anyagok tisztítása diagnosztika terápia Immunrendszer vizsgálata Antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló mérések Neutrofil granulociták fagocitáló képességének vizsgálata fluoreszcens baktériumok segítségével CD4+ Tsejtek arányának meghatározása FACS-al Hormonok mennyiségének meghatározása ELISA technikával
Miért jó ellenanyagokat használni ezekre a funkciókra? hagyományos és affinitás kromatográfián alapuló fehérje tisztítási módszerekkel kinyerhető specifikus felismerő képessége kis molekuláris különbségek meghatározására alkalmas mindenféle kémiai természetű anyag ellen termeltethető a specifitásának megfelelő antigénhez megfelelő erősséggel, de nem kovalens módon kötődik (megfelelő körülmények között szétválasztható az antigén-ellenanyag komplex) festékeket, izotópokat, enzimeket, drogokat, stb., lehet egyszerű módszerekkel hozzákonjugálni multivalens formában keresztkötni képes effektor rendszerek aktiválására in vivo és in vitro képes
Ellenanyagok felhasználása Antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek 1. Antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló technikák Az ellenanyag tulajdonságai (valencia, flexibilitás, affinitás) határozzák meg a másodlagos reakciót, ami pl. kicsapódás, agglutináció (térhálóképzés), stb... 2. Jelöléses technikák Közvetlenül az ellenanyagnak az antigénhez való kapcsolódását mutatjuk ki azáltal, hogy valamilyen módon detektálni tudjuk magát az ellenanyagot
A jelöléses mérési technikák elve + minta benne a kimutatandó anyag = antigén az antigénre specifikus jelölt ellenanyag mindig feleslegben adva, hogy minden antigént biztosan megjelöljünk antigén-ellenanyag kapcsolódás + marad szabad ellenanyag (és a nem felismert azaz nem jelölt elemek) Így nem tudom megmondani hogy mennyi jelölt ellenanyag kötött antigént, hiszen mindkettőben ugyanannyi van, maga az ellenanyag kötődés nem okoz látható változást ( másodlagos reakción alapuló technikák)
A jelöléses mérési technikák elve Megoldás: szilárd felszínhez kötöm a reakciót így a szabad és kötött jelölt ellenanyag komponensek elválaszthatóak Szilárd felszín lehet pl.: Műanyag felszín (ELISA) Sejt (FACS) Szövet metszet (immunhisztokémia) Mágneses gyöngyök (MACS) Nitrocellulóz membrán (western blot) Jelölések lehetnek.: Enzimatikus Fluoreszcens Mágneses Izotópos Arany
Jelöléses mérési technikák elve Direkt jelölés Indirekt jelölés Avidin-biotin jelölés direkt www.thermofisher.com
Ellenanyagok módosítása rekombináns technikákkal miért? Poliklonális ellenanyagok hátrányai: Variábilis (minden oltáskor kicsit más) Pontos specificitás nem ismert Diagnosztikai és terápiás célokra alkalmatlan Monoklonális ellenanyagok hátrányai: HAMA válasz (human anti-mouse antibodies) Más vagy jobb effektor funckióra lenne szükség (ADCC, CDC) Terápiás célokra alkalmatlan Megoldás: Adott specificitású humán monoklonális ellenanyagok kellenek Ez hibridóma technikával nem előállítható
Humán monoklonális ellenanyagok előállítása Lehetőségek: Egér monoklonális ellenanyagok módosítása rekombináns technológiával (kiméra és humanizált) Humán monoklonális ellenanyagok létrehozása Humanizált és kiméra ellenanyagok Pucca, 2011, BrazilianJournal of Pharmaceutical Sciences
Kiméra és humanizált monoklonális ellenanyagok előállítása Humanizált és kiméra ellenanyagok előállítása A megfelelő specifictású egér monoklonális ellenanyag VH és VL szekvenciájára van szükségünk Könnyű és nehéz lánc mrns átírása reverz transzkripcióval (RT-PCR) A cdns-ből a variábilis rész felszaporítása PCR-rel A variábilis rész összekapcsolása megfelelő humán Ig váz szekvenciájával A kész szekvencia bevitele rekombináns fehérje termelésre alkalmas sejtvonalba, pl. CHO (chinese hamster ovary, glikoziláció!)
Kiméra monoklonális ellenanyagok előállítása -XIMAB pl. Rituximab, Infliximab https://absoluteantibody.com/antibody -resources/antibodyengineering/humanisation/ www.pharmacodia.com
Humanizált monoklonális ellenanyagok előállítása -ZUMAB pl. Trastuzumab, Bevacizumab https://www.bocsci.com/ https://www.avastin-hcp.com/about-avastin/proposed-moa.html
Humán monoklonális ellenanyagok előállítása Pucca, 2011, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Hibridóma technológiával: pl. Tumoros vagy vírussal fertőzött egyén B-sejtjeinek in vitro immortalizálása pl. EBV-vel (Epstein-Barr vírus) Nehéz immortalizálni valóban Nem befolyásolható az izotípus (nincs oltás) Rossz ellenanyag hozam Humán ellenanyag könyvtár: scfv fragmentumok (random), bakteriofágokon kifejezve, adott antigénen szelektálják a jó fágokat affinitás kormatográfiával Sharma, 2007, Clinical Cancer Research
Humán monoklonális ellenanyagok előállítása Humanizált egér: Transzgén egér, amely az egér Ig lókuszok helyett humán Ig lókuszokat hordoz Hibridóma technikával előállíttt monoklonális ellenanyag humán lesz. Adalimumab Ipilimumab
Humán monoklonális ellenanyagok előállítása Konstans részek hozzáépítése: A kívánt effektor funkció határozza meg pl. IgG1 ADCC, CDC IgG4 neutralizálás Lehetnek fúziós fehérjék is https://absoluteantibody.com Különféle VEGF gátlók Platania, 2015, Front Pharmacol
Humán monoklonális ellenanyagok előállítása - expresszió E. coli: scfv, Fab Pichia pastoris: scfv, Fab Rovarsejtek (pl. Sf9): scfv, Fab Emlős sejtek (pl. CHO): Ig http://www.mimabs.org
Humán monoklonális ellenanyagok előállítása - tisztítás Fehérjekeverék (pl. CHO sejt felülúszó) Elúciós oldat ami megbontja az ellenanyag és a Protein G közti másodlagos kötőerőket (általában ph változtatással) Protein G Sepharose gyöngyökön (IgG hozzákötődik) Minden átfolyik ami nem képes Portein G- hez kapcsolódni (azaz nem IgG)
Köszönöm a figyelmet!