!HU0000089T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 89 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 06 290284 (22) A bejelentés napja: 06. 02.. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 060290284 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1880 A1 07. 08. 22. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1880 B1 09. 02. 2. (1) Int. Cl.: C12N 1/ (06.01) A23C 9/123 (06.01) (72) Feltalálók: Degivry, Marie-Christine, 92 Plessis-Robinson (FR); Alvarez Fernandez, Christina, Cerdanyola Del Valles, 08290 Barcelona (ES); Queguiner, Claire, 92260 Fontenay aux Roses (FR); Mignot, Isabelle, 91370 Verrieres le Buisson (FR); Saint-Denis, Thierry, 940 Vincennes (FR) (73) Jogosult: Compagnie Gervais Danone, 7009 Paris (FR) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Új Lactobacillus helveticus törzsek (7) Kivonat Az I 343 Lactobacillus helveticus törzs, amelyet 0. május 2¹én letétbe helyeztek a Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes gyûjteményben, 28 rue du Docteur Roux, 7724 Párizs, Franciaország cím alatt, a Budapesti Egyezmény elõírásainak megfelelõen, továbbá annak variánsai és mutánsai újak. Független igénypontokat nyújtanak be (1) legalább egy Lactobacillus helveticus törzset tartalmazó élelmiszertermékre, közelebbrõl, fermentált élelmiszertermékre; továbbá (2) élelmiszertermék elõállítására, amely tartalmazza tejproteineket, közelebbrõl Ile-Pro-Pro és/vagy Val-Pro-Pro peptidszekvenciákat hordozó proteineket tartalmazó kiindulási anyag kiválasztását, Lactobacillus helveticus törzs kiválasztását, a nyersanyag beoltását a törzzsel, a kiindulási anyag fermentálását 12 órán át, 4 C¹on, valamint adott esetben a fermentált termék hõkezelését. HU 00 89 T2 A leírás terjedelme oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 00 89 T2 2 A találmány tárgyát képezik új Lactobacillus helveticus törzsek, valamint agrár-élelmiszer-ipari területen történõ alkalmazásuk. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezik olyan Lactobacillus helveticus törzsek, amelyek nagy kapacitást mutatnak magas vérnyomás elleni peptidek elõállítására. A magas vérnyomás a populáció jelentõs részét érinti. Az EP 0 83 074 európai szabadalmi bejelentés VPP peptid (Val Pro Pro) és VPP szekvenciát tartalmazó peptidek alkalmazását ismerteti, mint olyan ágenseket, amelyek angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) gátlása révén csökkentik az artériás nyomást. Az IPP (Ile Pro Pro) tripeptid hasonló hatását szintén ismertette a szakirodalom. Ezek a peptidek azáltal gátolják az ACE¹t, hogy blokkolják az aktív helyét és így megakadályozzák az angiotenzin aktivizálódását. Ismeretes, hogy a VPP és IPP szekvenciák jelen vannak a szarvasmarha-eredetû béta-kazeinben, és hogy a kazein (vagy általában a tej, amely azt tartalmazza) megfelelõ hidrolízise lehetõvé teszi, hogy a fenti tripeptideket elõállítsuk. Állatokon és embereken végzett számos vizsgálat kimutatta, hogy a tripeptidek néhány milligrammjának elfogyasztása naponta az artériás nyomás hatékony csökkenését váltja ki, elsõsorban magas vérnyomású alanyokban, ezáltal mérsékelve a kardiovaszkuláris rendellenességek kockázatát. A Lactobacillus helveticus által fermentált tejbõl származó peptidek in vitro ACE-gátló hatást mutattak és ezeket a peptidek kimutathatók voltak Masuda O. és munkatársai [J. Nutr. 126, 63 8 (1996)] vizsgálataiban részt vevõ patkányok aortájában. Más vizsgálatok szintén kimutatták az artériás nyomás csökkenését magas vérnyomású patkányokban Lactobacillus helveticus által fermentált tejbõl származó peptidek fogyasztását követõen [Yamamoto N. és munkatársai: Biosci. Biotech. Biochem. 8, 776 8 (1994)]. Ugyanaz a fermentált tej emberben is kiváltja a szisztolés artériás nyomás csökkenését [Hata és munkatársai: Am. J. Clin. Nutr. 64, (1996)]. Egy közelmúltbeli vizsgálat megerõsítette, hogy a Calpis cég által forgalmazott Ameal S termékben jelen levõ peptidek jelentõs mértékben csökkentik a normálisnál magasabb artériás nyomást mutató alanyok artériás nyomását [Mizuno és munkatársai: British Journal of Nutrition 94, (1) 84 91 (0)]. Egy másik, közelmúltbeli vizsgálat [Jauhiainen és munkatársai: Am. J. of Hypertension 18, 1600 160 (0)] olyan hipotézisre utal, amely szerint lehetséges, hogy a Lactobacillus helveticus által fermentált tej magas vérnyomás elleni hatásának magyarázatául szolgáló, fent ismertetett hatásmechanizmus (ACE-gátlás) emberekben nem a meghatározó hatásmechanizmus. A Lactobacillus helveticus törzsek nagy többsége képes IPP és VPP tripeptidek elõállítására tej fermentálásával, azonban az elõállított mennyiség változó lehet. Az EP 1 016 709 számú európai szabadalmi bejelentés eljárást ismertet VPP és IPP tripeptidek elõállítására tej fermentálásával, Lactobacillus helveticus fajhoz tartozó, specifikus tejsavbaktérium-törzsek alkalmazásával. 1 2 3 4 0 60 Ennek ellenére, igény mutatkozik olyan törzsekre, amelyek a lehetõ legnagyobb mennyiségû VPP és/vagy IPP tripeptidek elõállítására képesek. A találmány tárgyát képezik ilyen tulajdonságokat mutató törzsek. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezik Lactobacillus helveticus törzsek, amelyek lehetõvé teszik IPP és/vagy VPP tripetideket nagyon nagy mennyiségben tartalmazó élelmiszer-termékek elõállítását. A leírásban törzs kifejezés alatt egyetlen sejtbõl vagy izolált telepbõl származó mikroorganizmus, általában tiszta, bármilyen tenyészetét értjük. A leírásban X törzs variánsa vagy mutánsa kifejezések alatt X referenciatörzsbõl származó, bármely törzset értünk. Jelen összefüggésben a variáns kifejezés alatt elsõsorban olyan törzseket értünk, amelyeket X referenciatörzsbõl lényegében mutáció és szelekció révén kaptunk, és mutáns kifejezés alatt elsõsorban olyan törzseket értünk, amelyeket lényegében X törzsre alkalmazott véletlen vagy irányított mutagenezis eljárással (például vektorok segítségével végrehajtott genetikai transzformációval) kaptunk. A találmány szerinti törzsek mutánsai vagy variánsai szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak, amennyiben azok megtartják a találmány lényegi vonását, közelebbrõl IPP és/vagy VPP tripeptidek nagy mennyiségben történõ elõállításának a képességét. A leírásban fruktóz mínusz fenotípusú törzs kifejezés alatt bármely olyan törzset értünk, amely nem képes fruktózt metabolizálni. A leírásban tejes közeg alatt tejproteineket tartalmazó, bármely közeget értünk, például (fölözött vagy nem fölözött) tejporral vagy sûrített tejjel 4% proteinre standardizált tehéntejet. A leírásban tejtermék kifejezés alatt a tej mellett bármely, tejbõl származtatott terméket, például tejszínt, fagylaltot, vájat, sajtot, joghurtot vagy fermentált tejet; másodlagos termékeket, például laktoszérumot (tejsavót) vagy kazeint, továbbá összetevõként lényegében tejet vagy tej alkotórészeit tartalmazó, különbözõ elõállított élelmiszereket értünk. A tejtermékek között, fermentált tejtermékek közé tartoznak többek között a joghurtok, fermentált tejek, fehér sajtok, kefirek, sajtok, probiotikus tejtermékek, és általánosságban olyan tejtermékek, amelyeket legalább egy fermentációs lépésnek vetettek alá. A tej általában tehéntej, azonban származhat más emlõsállatból, például kecskébõl, birkából, kancából, tevébõl vagy bivalyból. A leírásban élelmiszertermék kifejezés alatt bármely, ember vagy állat táplálására elõállított terméket értünk. Közelebbrõl, élelmiszertermékek közé tartoznak csecsemõk, gyermekek, serdülõkorúak és felnõttek táplálására elõállított termékek. A találmány szerinti élelmiszertermékek részlegesen vagy teljes egészükben, legalább egy, a találmány szerinti fermentált tejterméket tartalmaznak. A találmány szerinti élelmiszertermékek tartalmazhatnak továbbá élelmiszeriparban szokásosan alkalmazott más összetevõket, például adalékokat, tartósítószereket, gyümölcsöt vagy gyümölcskivonatokat, aromákat, színezékeket, állagjavító ágenseket, gabonamagvakat, csokoládédarabokat és hasonlókat. 2
1 HU 00 89 T2 2 A leírásban fermentátum alatt egy adott közeget fermentálni képes, legalább egy élõ mikroorganizmus törzset tartalmazó, bármely készítményt értünk. A fermentátumok között a tejes fermentátumok olyan készítmények, amelyek egy adott tejes közeget fermentálni képes, legalább egy élõ mikroorganizmus törzset tartalmaznak. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi Lactobacillus helveticus I 343 törzs, amelyet 0. május 2¹én letétbe helyeztünk a CNCM ( Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes ) gyûjteményben, 28 rue du Docteur Roux, 7724 Párizs, Franciaország cím alatt, a Budapesti Egyezmény elõírásainak megfelelõen. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezik a Lactobacillus helveticus I 343 törzs variánsai és mutánsai, amely Lactobacillus helveticus I 343 törzset 0. május 2¹én letétbe helyeztünk a CNCM ( Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes ) gyûjteményben, 28 rue du Docteur Roux, 7724 Párizs, Franciaország cím alatt, a Budapesti Egyezmény elõírásainak megfelelõen, és amely mutánsok és variánsok képesek 2 tömegszázaléknál magasabb, vagy azzal egyenlõ, elõnyösen 2 és tömegszázalék közötti, elõnyösebben 2, és 6 tömegszázalék közötti, még elõnyösebben 4 tömegszázalékkal egyenlõ teljes proteinkoncentrációjú tejes közeg C és 4 C közötti, elõnyösen 32 C és C közötti hõmérsékleten, még elõnyösebben 37 C¹on történõ fermentálásával nagy koncentrációban IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptidet elõállítani. A tripeptidek koncentrációjának egyik egyszerû kifejezési módja, hogy azt VPP-ekvivalens (VPPeq) koncentrációban fejezzük ki. Milligramm/kg mértékegységben így fejezhetõ ki: [VPPeq]=[VPP]+(9/ [IPP]). Ennek megfelelõen, a találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti Lactobacillus helveticus törzsek fermentáció révén képesek elõnyösen legalább 6 mg, elõnyösebben legalább 70 mg, még elõnyösebben legalább 7 mg, még elõnyösebben legalább 80 mg, még elõnyösebben legalább 8 mg, és legelõnyösebben legalább 90 mg IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptideket elõállítani, a fermentált termék egy kilogrammjára vonatkoztatva. Ilyen mennyiségû VPP és/vagy IPP tripeptidet általában az esetben kapunk, ha a találmány szerinti törzs 2 tömegszázaléknál nagyobb, vagy azzal egyenlõ, elõnyösen 2 és tömegszázalék közötti, elõnyösebben 2, és 6 tömegszázalék közötti, még elõnyösebben 4 tömegszázalékkal egyenlõ teljes proteinkoncentrációjú tejes közeget C és 4 C közötti, elõnyösen 31 C és 44 C közötti, elõnyösebben 32 C és 43 C közötti, elõnyösebben 33 C és 42 C közötti, elõnyösebben 34 C és 41 C közötti, elõnyösebben 3 C és C közötti hõmérsékleten, még elõnyösebben 37 C¹on fermentál. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti Lactobacillus helveticus törzsek a fentiek mellett fruktóz mínusz fenotípusúak. Valójában 1 2 3 4 0 60 a fruktóz erõs édesítõ hatású, és élelmiszertermékek elõnyös összetevõje. Ennek megfelelõen, ha a Lactobacillus helveticus törzs nem képes bontani a fruktózt, az élelmiszertermék kiváló organoleptikus tulajdonságokat õriz meg, és elõnyösen jobban szabályozható a végsõ ph¹érték olyan esetben, amikor az élelmiszertermék gyümölcskészítményt, például gyümölcsdarabokat vagy gyümölcslevet tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi élelmiszertermék, közelebbrõl fermentált tejtermék, amely a találmány szerinti, legalább egy Lactobacillus helveticus törzset tartalmaz. Elõnyösen, a találmány egyik megvalósítási módja szerint, az élelmiszertermék legalább 6, elõnyösen legalább 7, elõnyösebben 8 CFU/ml élõ Lactobacillus helveticus baktériumot tartalmaz. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti élelmiszertermék jelentõs biomasszát tartalmaz. Más megoldás szerint, a találmány szerinti élelmiszertermék hevíthetõ, a ph stabilizálása érdekében. Az ilyen élelmiszertermék késõbb alkalmazható összetevõként egy másik élelmiszertermékben. Ezen túlmenõen, a találmány szerinti élelmiszertermék tartalmazhat gyümölcskészítményeket, például gyümölcsdarabokat és/vagy gyümölcslevet. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az élelmiszertermék legalább 2 mg, elõnyösen legalább mg, elõnyösebben legalább 3 mg, még elõnyösebben legalább mg, még elõnyösebben legalább 4 mg, még elõnyösebben legalább 0 mg, még elõnyösebben legalább mg, még elõnyösebben legalább 60 mg, még elõnyösebben legalább 6 mg, még elõnyösebben legalább 70 mg, még elõnyösebben legalább 7 mg, még elõnyösebben legalább 80 mg, még elõnyösebben legalább 8 mg, még elõnyösebben legalább 90 mg VPPeq tripeptidet, az élelmiszertermék 1 kg¹jára vonatkoztatva. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti élelmiszertermék tartalmaz továbbá gyümölcskészítményeket, például gyümölcsdarabokat és/vagy gyümölcslevet. Elõnyösen, a találmány egyik megvalósítási módja szerint, az élelmiszertermék magas vérnyomás elleni tulajdonságokat mutat. Egy további szempont szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás élelmiszertermék elõállítására. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: tej proteinjeit, közelebbrõl IPP és/vagy VPP peptidszekvenciákat hordozó proteineket tartalmazó nyersanyag kiválasztását, legalább egy, a találmány szerinti Lactobacillus helveticus törzs kiválasztását, a fenti nyersanyag beoltását a fenti törzzsel, a fenti nyersanyag 12 órán át, 4 C¹on történõ fermentálását, adott esetben a kapott fermentált termék hõkezelését. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti eljárás során a fermentálást követõen nem végzünk hõkezelést. Ez lehetõvé teszi élõ 3
1 HU 00 89 T2 2 baktériumok tartósítását az élelmiszertermékben (probiotikumok). Más megvalósítási mód szerint, a fenti eljárás tartalmazhat hõkezelési lépést. A találmányt tovább ismertetjük az alábbi példák segítségével, a korlátozás szándéka nélkül. Példák a találmány megvalósítására 1. példa: A találmány szerinti egyik törzs jellemzése A Lactobacillus helveticus I 343 törzset 0. május 2¹én letétbe helyeztük a CNCM ( Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes ) gyûjteményben, 28 rue du Docteur Roux, 7724 Párizs, Franciaország cím alatt, a Budapesti Egyezmény elõírásainak megfelelõen. 2. példa: Savasító tulajdonságok mérése A savasító tulajdonságokat az alábbiak szerint értékeltük: Kilencszázharminc ml vízben 1 g sovány tejport ( poudre de lait écrémé, PLE) tartalmazó közeget pasztõröztünk percen át, 9 C¹on. A közeget 0,% arányban beoltottuk, majd 37 C¹on fermentálásnak vetettük alá. Ezt követõen, a ph¹értéket az idõ függvényében követtük. Harminc órán át tartó fermentálást követõen, a fermentált közegbõl vett mintát alkalmaztuk IPP és VPP tripeptidek termelõdésének, valamint az ACEI aktivitás mérésére, amelynek az eredményét alább ismertetjük. Az 1. ábrán látható eredmények a találmány szerinti egyik törzs savasító tulajdonságát mutatja. 3. példa: IPP és VPP tripeptidek termelõdésének a mérése Anyagok és eljárások A 2. példában fentebb ismertetettek szerinti tejes közegbõl vett mintát ( órán át tartó fermentálás után) alkalmaztuk a méréshez. A peptidtartalom, közelebbrõl az IPP- és VPP-tartalom vizsgálatát MS/MS típusú detektorral összekapcsolt CLHP folyadékkromatográfiás eljárással végeztük, az alábbiak szerint: Komplex minták vizsgálata során jelentkezõ belsõ interferenciák miatt, a minták készítésekor deutériummal jelölt belsõ etalonok ismert és ellenõrzött mennyiségben történõ hozzáadása nyomatékosan ajánlott. A minták elkészítése úgy történt, hogy a fermentált közeget 2 ppm, deutériummal jelölt VPP (továbbiakban VPPd, képlete H¹Val[D8]-Pro- Pro¹OH, MT=319,4 g/mol, Bachem Chemicals, Franciaország) és ppm, deutériummal jelölt IPP (továbbiakban IPP, képlete H¹Ile[DN1]- Pro-Pro¹OH, MT=332,2 g/mol, NEOMPS, Groupe SNPE, 7 rue de Boulogne, 670 Strassbourg, Franciaország) belsõ etalonokat tartalmazó, víz, metanol és trifluor-ecetsav (0/0/0,1%) által alkotott elegyben hígítottuk 1:3 arányban (például egy eppendorf-csõbe pontosan bemértünk 1 2 3 4 0 60 600 mg mintát 10 mg, a belsõ etalonokat tartalmazó, víz-metanol-tfa elegybe). A hígított mintát ezt követõen 14 000 g mellett, 1 percen át centrifugáltuk. Ezt követõen, a kapott tiszta felülúszót, amely a fermentálás alatt képzõdött peptideket tartalmazza, 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó víz-metanol (0/0, térfogat/térfogat) elegyben pontosan 0¹szeresére hígítottuk. Ezt követõen, az így kapott, hígított oldatot peptidek vizsgálatára adaptált Waters Biosuit típusú oszloppal (3 mm 2,1 mm, C18PA A, WAT186002427, Waters France,, rue Jacques Monod, 78280 Guyancourt) ellátott, Agilent 10 típusú CLHP kromatográfiás rendszerben (Agilent Technologies France, 1 rue Galvani 9174 Massy cedex, Franciaország) vizsgáltuk, 0 C hõmérsékleten, 0,2 ml/perc átfolyás mellett. A peptideket szokásos módon eluáltuk B oldatnak (acetonitril+0,0% hangyasav) A oldatban (víz+0,6% hangyasav) elõállított emelkedõ gradiensével, a kívánt kromatográfiás felbontóképesség függvényében 3 perc és 2 óra közötti idõtartamok alatt. Az IPP és VPP peptidek mérésére adaptált eljárás az alábbi grádienst alkalmazza: Idõ % A oldat % B oldat 0 0 0 3 96 4 6 89 11 1 60 18 0 0 21 0 0 24 0 0 27, 0 0 3 0 0 A detektálást MS/MS típusú specifikus detektorral végeztük, például ioncsapdával felszerelt készülékkel, mint amilyen az Esquire 00+ (Bruker Daltonique, rue de l Industrie, 67166 Wissembourg Cedex), amelyet pozitív üzemmódú, elektrospray ionizációs paraméterekre állítottunk be, akár a peptidtartalom globális vizsgálatára (MS¹MS üzemmód), akár adott peptidnek jellemzõ fragmenseibõl történõ, pontos mennyiségi meghatározására (MRM üzemmód). IPP és VPP tripeptidek mérése esetében, továbbá az IPPd és VPPd belsõ etalonok esetében, a peptideket fajlagos tömegük szerint izoláltuk (egyszer töltött ionként, VPP esetében 312,2 Da; IPP esetében 326,2 Da; VPPd esetében 3,2 Da; IPPd esetében 337,3 Da) és fajlagos ionjaik intenzitása alapján kvantifikáltuk a fragmentációt követõen (fragmentumok 8 Da). Az IPP és VPP peptidek kromatográfiás csúcsainak az integrálása, valamint az ismert koncentrációjú IPPd és VPPd belsõ etalonokhoz tartozó csúcsok felületéhez történõ hasonlításuk ezt követõen lehetõvé tette a minta kiindulási IPP- és VPPtartalmának a kiszámítását (amelyet általában mg/kg 4
1 HU 00 89 T2 2 vagy ppm mértékegységben fejeztünk ki), egyszerû lineáris regresszióval. Eredmények VPPeq (mg/fermentált közeg kg) Calpis CM4 1 CNRZ 244 7 I 343 90 A 2. ábra az I 343 törzs által termelt IPP és VPP tripeptidek mennyiségét hasonlítja össze a technika korábbi állása szerint ismert két törzs termelésével. A Calpis cég CM4 törzsét az EP 1 016 709 számú európai szabadalmi bejelentés, míg a CRNZ 244 törzset a WO 04/060073 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti. Az adatokból egyértelmûen látszik, hogy az I 343 törzs (a találmány szerinti törzs) a technika korábbi állása szerinti törzsekhez képest sokkal több IPP és VPP tripeptidet állít elõ azonos körülmények mellett: 4. példa: ACEI (Angiotenzin-konvertáló enzim gátlás) aktivitás mérése Anyagok és eljárás A mérés elvégzéséhez a 2. példában ismertetett ( órán át fermentált) tejes közeg mintáját alkalmaztuk. Az eljárás alapja Cushman és Cheng eljárása [Cushman és munkatársai: Biochem. Pharmacol., 1637 (1971), amelyet úgy adaptáltunk, hogy kompatibilissé váljon fermentált tejtermék típusú minták vizsgálatával. 1. Reagensek és oldatok elõállítása 1.1 Nátrium-kloriddal (0,3 mol/l) kiegészített nátrium-borát puffer (0,1 mol/l, ph=8,3) Kimértünk 6,1843 g H 3 BO 3 reagenst (Carlo Erba, ref: 2 766). Feloldottuk körülbelül 800 ml desztillált vízben, a ph¹t NaOH-oldattal 8,3 értékre állítottuk, majd 12,0 g NaCl¹ot adtunk hozzá (0,3 mol/l végsõ koncentrációban) és desztillált vízzel 1 l¹re egészítettük ki. 1.2 HHL-szubsztrát elõállítása: mmol/l His-His- Leu oldat, 0,3 mol/l NaCl-dal kiegészített, 0,1 mol/l (ph=8,3) nátrium-borát pufferben Pontosan kimértünk 42,9 mg HHL-peptid-anhidridet (N¹hippuril-hisztidil-leucin tetrahidrát, PM: 01, g, Sigma-Aldrich, ref: 328 mg), feloldottuk körülbelül 1 ml, 0,3 mol/l NaCl borát-pufferben (0,1 mol/l, ph=8,3), majd ugyanezen pufferrel ml¹re egészítettük ki. 1.3 ACE-oldat (0,1 E/ml) elõállítása Liofilezett por formájú angiotenzin-konvertáló enzimet (eredete: nyúltüdõ, Sigma-Aldrich, ref: A6778, 0,2 egység) oldottunk 0,1 mol/l, ph=8,3 nátrium-borát pufferben, hogy 0,1 E/ml koncentrációjú oldatot kapjunk. Az így elõállított oldat 4 C¹on tárolva, maximum 2 héten át alkalmazható úgy, hogy megfelelõ enzimaktivitását megtartja. 1 2 3 4 0 60 2. Fermentált tejminták elõállítása A mintát 8,0 és 8, közötti ph¹értékre kellett beállítani abból a célból, hogy megközelítsük az ACE ph¹optimumát. A fermentált tejet elõször centrifugáltuk, a felülúszó ph¹ját ezt követõen 8,0 és 8, közötti értékre (ideálisan 8,3¹ra) állítottuk, majd 000 Da áteresztési küszöbû, Vivaspin filtráló egység (Vivascience, Franciaország) alkalmazásával ultrafiltráltuk abból a célból, hogy elkerüljük az interferáló elemeket (teljes proteinek, kalciumsók). A protokoll az alábbi volt: Körülbelül 6 ml fermentált tejet helyeztünk egy 1 ml¹es Falcon csõbe, miután az üres csövet elõzõleg lemértük. Megmértük a csõbe helyezett fermentált tej mennyiségét. A fermentált tejet percen át, 4 C¹on, 14 000 g mellett centrifugáltuk. Összegyûjtöttük a felülúszót; meghatároztuk az üledék/felülúszó arányát, ami adott esetben lehetõvé tette az eredeti termék IC 0 ekvivalens értékének a meghatározását, és nemcsak a felülúszójáét. Kivettünk 2,0 ml felülúszót egy kémcsõbe és megmértük a ph¹értékét. Hozzáadtuk 2 mol/l NaOH oldat szükséges mennyiségét abból a célból, hogy a ph¹értéket 8,0 és 8, közé állítsuk (a cél 8,3), majd hozzáadtunk borát-puffert és összeráztuk. Hozzáadtuk a borát-puffer szükséges mennyiségét abból a célból, hogy kétszeresére hígítsuk a felülúszót, számításba véve a hozzáadott NaOH pontos mennyiségét (például: a felülúszó vizsgálati térfogata=2 ml+ l NaOH+1,7 ml borát-puffer). Ellenõriztük, hogy a végsõ ph¹érték 8,0 és 8, közé essen. Ezt követõen még egy kevés NaOH¹t adtunk az elegyhez. Precipitátum képzõdött: ez kalciumsóknak tulajdonítható. A mintát 12 000 g mellett, 1 percen át, C¹on ultracentrifugáltuk, Vivaspin 000 Daltonos filtrációs egység (kapacitás: 4 6 ml) alkalmazásával abból a célból, hogy áttetszõ mintát kapjunk. 3. A fermentált tejminták által kiváltott ACE-gátlás mérése Minden vizsgálatsorozathoz kontroll mintákat (0 és 0% aktivitású ACE) kellett beállítani. Minden minta és minden hígítás esetében két független vizsgálatot végeztünk, és egy vak mintát vizsgáltunk. Valójában (hígítással) minél közelebb be kellett állítani a minta azon mennyiségét, amely az ACE aktivitásának 0%- kal történõ csökkentéséhez szükséges. Ebbõl a célból: A vak és a vizsgálati csövekbe 80 l, ph=8,3 értékre beállított mintát mértünk be. A 0 és 0% kontroll csövekbe 80 l desztillált vizet mértünk be. Minden csõbe bemértük mmol/l HHL-szubsztrátoldat 0 l¹ét és az elegyet összeráztuk. A csöveket 37 C¹on termosztált vízfürdõbe helyeztük, és hagytuk, hogy felvegyék a hõmérsékletet.
1 HU 00 89 T2 2 Az enzimatikus reakciót úgy indítottuk el, hogy minden csõbe 0,1 E/ml ACE-oldat l¹ét mértük be, kivéve a vak mintát és a 0% kontrollt, amelyekbe l borát-puffert (ph=8,3) adagoltunk. Engedtük a hidrolízist 1 órán át, pontosan 37 C¹on. A reakciót úgy állítottuk le, hogy minden csõbe 1 mol/l HCl l¹ét mértük be. Összefoglaló táblázat a különbözõ reakcióelegyek összetételérõl: 0% kontroll 0% kontroll Minta (vizsgálati) Vak minta Vizsgálat tárgya 80 l desztillált víz 80 l desztillált víz Szubsztrát hozzáadás Hidrolízis indítása 0 ml HHL l ACE 0 ml HHL l borátpuffer 80 l minta 0 ml HHL l ACE 80 l minta 0 ml HHL l borátpuffer 1 A leolvasást úgy végeztük, hogy extraháltuk és fotometriás eljárással mennyiségileg meghatároztuk a hidrolizált terméket (hippursavat), az alábbi protokoll szerint. Minden csõbe bemértünk 1,7 ml etil-acetátot és összeráztuk. Kétezer g mellett, percen át, C¹on centrifugáltuk. Kivettünk pontosan 1 ml felülúszót és áttettük egy eppendorf mikrocsõbe. Melegítõ blokk alkalmazásával elpárologtattuk az etil-acetátot 1 C¹on, percen át. Hozzáadtunk pontosan 1 ml desztillált vizet, majd másodpercen át összeráztuk, hogy visszanyerjük a hippursavat. Leolvastuk az abszorbanciát 228 nm hullámhosszon, UV fényben történõ alkalmazásra adaptált küvettákban. Az eredmények kifejezése Az ACE-gátlás százalékos mértéke az alábbiak szerint számítható ki: (Abs 0% ctl-abs 0% ctl)-(abs éch-abs blanc éch) 0 (Abs 0% ctl-abs 0% ctl) Ahol: Abs jelentése 228 nm¹en mért abszorbancia, a hippursav extrahálását követõen; ctl jelentése kontroll; éch jelentése minta (échantillon). Adott fermentált tej esetében az IC 0 -értéket a fermentált tej felülúszójának azon mennyiségével fejezzük ki, amely a reakcióközegben 0%-kal csökkenti az ACE enzimatikus aktivitását, és amelyet a fermentált tej felülúszójának mikroliterben megadott mennyiségével jelölünk, a reakcióközeg egy milliliterére vonatkoztatva. Eredmények A 3. ábra a találmány szerinti különbözõ törzsek angiotenzin-konvertáló enzimre gyakorolt gátló hatását mutatja, összehasonlítva a technika korábbi állása szerint ismert törzsek gátló hatásával. Az ordinátán a fermentált tej azon ekvivalens koncentrációja van feltüntetve a reakcióközeg egy milliliterére vonatkoztatva, amely az angiotenzin-konvertáló enzim aktivitásának 0%¹os csökkentéséhez szükséges (IC 0 ). Minél magasabb ez a koncentráció, annál kisebb az adott törzs kapacitása az angiotenzin-konvertáló enzim gátlására. 3 4 0 60. példa: A találmány szerinti (probiotikus) tejtermék elõállítása Az elõzõleg lefölözött, elõpasztõrözött és 4 C¹ra hûtött elegytejet sovány tejporral proteinekre nézve standardizáltunk (4,0%). Az így elõállított tejes közeget pasztõröztük (9 C¹on, 8 percen át). Miután a tejes közeget 32 C¹ra hûtöttük, 7 CFU/ml arányban beoltottuk az I 343 törzzsel, és a fermentálás teljes idõtartama alatt a hõmérsékletet 32 C¹on tartottuk. Miután elérte a ph=3, értéket, az alvadékot eltávolítottuk a fermentáló kádból, és állománysimításnak vetettük alá (szûrõn történõ áteresztéssel), majd lemezes hõcserélõ alkalmazásával C¹ra hûtöttük. A simított állományú és lehûtött alvadékot ezt követõen (4 és 4,1 közötti ph¹jú) gyümölcskészítménnyel egészítettük ki, a végtermékre vonatkoztatott 1%¹os arányban, 1 ml¹es flakonokba adagoltuk, majd 4 C¹on, 28 napon át tároltuk. Az így elõállított termék az IPP/VPP szekvenciájú tripeptidet 90 mg/kg VPP-ekvivalens mennyiségben tartalmazta. A termék IPP/VPP peptidtartalma a termék teljes élettartama alatt stabil maradt. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Lactobacillus helveticus I 343 törzs, amely a Budapesti Egyezmény elõírásainak megfelelõen, 0. május 2¹én lett letétbe helyezve a CNCM ( Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes, azaz Mikroorganizmus-tenyészetek Nemzeti Gyûjteménye ) gyûjteményben (28 rue du Docteur Roux, 7724 Párizs, Franciaország), továbbá a törzs azon variánsai és mutánsai, amelyek képesek 2 tömeg%-nál nem kisebb teljes proteintartalmú tejes közeg C és 4 C közötti hõmérsékleten történõ fermentálása révén IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptidek elõállítására, a fermentált termék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 6 mg VPP-ekvivalens (VPPeq) mennyiségben. 2. Az 1. igénypont szerinti Lactobacillus helveticus törzs, továbbá azon variánsai és mutánsai, amelyek 6
1 HU 00 89 T2 2 képesek 2 tömeg%-nál nem kisebb teljes proteintartalmú tejes közeg C és 4 C közötti hõmérsékleten történõ fermentálása révén IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptidek elõállítására, a fermentált termék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 70 mg VPP-ekvivalens mennyiségben. 3. Az 1. igénypont szerinti Lactobacillus helveticus törzs, továbbá azon variánsai és mutánsai, amelyek képesek 2 tömeg%-nál nem kisebb teljes proteintartalmú tejes közeg C és 4 C közötti hõmérsékleten történõ fermentálása révén IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptidek elõállítására, a fermentált termék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 7 mg VPP-ekvivalens mennyiségben. 4. Az 1. igénypont szerinti Lactobacillus helveticus törzs, továbbá azon variánsai és mutánsai, amelyek képesek 2 tömeg%-nál nem kisebb teljes proteintartalmú tejes közeg C és 4 C közötti hõmérsékleten történõ fermentálása révén IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptidek elõállítására, a fermentált termék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 80 mg VPP-ekvivalens mennyiségben.. Az 1. igénypont szerinti Lactobacillus helveticus törzs, továbbá azon variánsai és mutánsai, amelyek képesek 2 tömeg%-nál nem kisebb teljes proteintartalmú tejes közeg C és 4 C közötti hõmérsékleten történõ fermentálása révén IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptidek elõállítására, a fermentált termék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 8 mg VPP-ekvivalens mennyiségben. 6. Az 1. igénypont szerinti Lactobacillus helveticus törzs, továbbá azon variánsai és mutánsai, amelyek képesek 2 tömeg%-nál nem kisebb teljes proteintartalmú tejes közeg C és 4 C közötti hõmérsékleten történõ fermentálása révén IPP és/vagy VPP szekvenciájú tripeptidek elõállítására, a fermentált termék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 90 mg VPP-ekvivalens mennyiségben. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti Lactobacillus helveticus törzs, amely továbbá fruktóz mínusz fenotípust mutat. 8. Az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti Lactobacillus helveticus törzs alkalmazása élelmiszertermék vagy gyógyászati termék, különösen fermentált tejtermék elõállítására. 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az élelmiszertermék vagy gyógyászati termék magas vérnyomás elleni tulajdonságokat mutat. 1 2 3 4. Élelmiszertermék, különösen fermentált tejtermék, amely legalább egyetlen, 1 7. igénypontok bármelyike szerinti Lactobacillus helveticus törzset tartalmaz. 11. A. igénypont szerinti élelmiszertermék, amely legalább 6 CFU/ml élõ Lactobacillus helveticus baktériumot tartalmaz. 12. A. igénypont szerinti élelmiszertermék, amely legalább 7 CFU/ml élõ Lactobacillus helveticus baktériumot tartalmaz. 13. A. igénypont szerinti élelmiszertermék, amely legalább 8 CFU/ml élõ Lactobacillus helveticus baktériumot tartalmaz. 14. A. igénypont szerinti élelmiszertermék, amely az élelmiszertermék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 2 mg VPP-ekvivalenst tartalmaz. 1. A. igénypont szerinti élelmiszertermék, amely az élelmiszertermék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 0 mg VPP-ekvivalenst tartalmaz. 16. A. igénypont szerinti élelmiszertermék, amely az élelmiszertermék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 7 mg VPP-ekvivalenst tartalmaz. 17. A. igénypont szerinti élelmiszertermék, amely az élelmiszertermék egy kilogrammjára vonatkoztatva legalább 90 mg VPP-ekvivalenst tartalmaz. 18. A 17. igénypontok bármelyike szerinti élelmiszertermék, amely tartalmaz továbbá gyümölcskészítményeket, különösen gyümölcsdarabokat és/vagy gyümölcslevet. 19. A 18. igénypontok bármelyike szerinti élelmiszertermék, amely magas vérnyomás elleni tulajdonságokat mutat.. Eljárás élelmiszertermék elõállítására, amely tartalmazza az alábbi lépéseket: tej proteinjeit, különösen IPP és/vagy VPP peptidszekvenciákat hordozó proteineket tartalmazó kiindulási anyag kiválasztását, legalább egyetlen, az 1 7. igénypontok bármelyike szerinti Lactobacillus helveticus törzs kiválasztását, a kiindulási anyag beoltását a törzzsel, a kiindulási anyag 12 órán át, 4 C¹on történõ fermentálását, adott esetben a kapott fermentált termék hõkezelését. 7
HU 00 89 T2 Int. Cl.: C12N 1/ 8
HU 00 89 T2 Int. Cl.: C12N 1/ 9
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest