A heparinnal felszabadítható TFPI-szint megemelkedése lacunaris stroke-on első alkalommal átesett betegeknél

A heparinnal felszabadítható TFPI-szint megemelkedése lacunaris stroke-on első alkalommal átesett betegeknél I.L.H. Knottnerus, MD K. Winckers, MD H. ten Cate, MD, PhD T.M. Hackeng, PhD J. Lodder, MD, PhD R.P.W. Rouhl, MD J. Staals, MD, PhD J.W.P. Govers- Riemslag, PhD O. Bekers, MD R.J. van Oostenbrugge, MD, PhD Levelezési cím: Dr. Knottnerus: i.knottnerus@mst.nl KIVONAT Célkitűzés: A lacunaris stroke (lacunar stroke, LS) patofiziológiájával kapcsolatos új felismerések arra utalnak, hogy az elváltozást az endothel aktiválódása miatt kialakult fokozott vér-agy gát permeabilitása okozza. Tekintettel arra, hogy a szöveti faktor útvonalat gátló faktor (tissue factor pathway inhibitor, TFPI) legnagyobb része az endothelialis sejtekben termelôdik és tárolódik, ezt a fehérjét az endothel aktivációjának markereként használhatjuk. Ebben a megfigyeléses vizsgálatban a TFPI szintjét különbözô területeken mértük az endothelialis funkció markereként lacunaris stoke-on elsô alkalommal átesett betegeknél. Módszerek: A teljes és a szabad teljes hosszúságú (full-lenght, FL) TFP antigénszintjét mértük ELISA segítségével 149 betegnél és 42 kontrollszemélynél. A heparinnal felszabadítható szabad FL-TFPIszintet 17 beteg és 15 kontrollszemély random kiválasztása után határoztuk meg. Agyi MR-vizsgálattal az LS-en átesett betegeket két csoportra osztottuk aszerint, hogy izolált lacunaris infarktusuk (isolated lacunar infarct, ILA) vagy tünetmentes/csendes ischaemiás laesiójuk (silent ischemic lesions, SIL) volt. Eredmények: A teljes TFPI plazmaszintje magasabb volt azoknál a betegeknél, ahol SIL-t lehetett kimutatni, szemben az ILA elôfordulásával, de ezt az összefüggést az életkorra és az alacsony molekulasúlyú heparin szintjére történô korrekció után nem lehetett kimutatni. Azonban a heparinnal felszabadítható szabad FL-TFPI szintje magasabbnak bizonyult a betegeknél, mint a kontrollcsoportban. Következtetések: Habár a teljes TFPI-szint a környezô plazmában nem különbözött az LS altípusai között, a betegeknél megfigyelt magasabb heparinnal felszabadítható TFPI-szint az endothelialis aktiváció LS patogenezisében kifejtett szerepére utal. Eredeti megjelenés: Neurology 2012;78:493 498 RÖVIDÍTÉSEK alac=(asymptomatic lacunar infarct) tünetmentes lacunaris infarktus; CI=(confidence interval) konfidenciaintervallum; FL=(fulllength) teljes hosszúságú; HDL=(high-density lipoprotein) nagy denzitású lipoprotein; ILA=(isolated lacunar infarct) izolált lacunaris infarktus; LDL=(low-density lipoprotein) alacsony denzitású lipoprotein; LS=(lacunar stroke) lacunaris stroke; MUMC=Maastricht University Medical Centre; OR=(odds ratio) esélyhányados; SIL=(silent ischemic lesion) tünetmentes/csendes ischaemiás laesio; TF=(tissue factor) szöveti faktor; TFPI=(tissue factor pathway inhibitor) szöveti faktor útvonalat gátló faktor; WML=(white matter lesion) fehérállományi laesio. A lacunaris stroke (lacunar stroke, LS) a lacunaris szindrómák azon típusába tartozik, ahol az agyról készült képalkotó vizsgálatokon lacunaris infarktust lehet kimutatni. 1 A feltételezett patofiziológiai mechanizmusokat a neurovascularis endothelium aktivációja indítja el, amely a vér-agy gát fokozott permeabilitásához vezet. Emiatt a vérben található különböző összetevők a perivascularis térbe jutnak glialis és neuronalis károsodást okozva. Ez a folyamat az LS különösen azon altípusában fontos, ahol egyidejűleg tünetmentes/csendes ischaemiás laesiók alakulnak ki (silent ischemic lesions, SIL). 2,3 A vascularis endothelsejtek működésének in vivo vizsgálatát az endothelialis eredetű molekulák szintjének mérésével lehet megvalósítani. 4 Ilyen például a szöveti faktor útvonalat gátló faktor (tissue factor pathway inhibitor, TFPI), 5 amely a véralvadásban szerepet játszó VIIa faktor/szöveti faktor (tissue factor, TF) útvonalat élettanilag gátolja. 6 A TFPI érett formájában, amit teljes hosszúságúnak (full-length, FL) neveznek, egy savas aminoterminális régió található, amelyet három egymás után elrendezett Kunitz-domén és egy lúgos karboxiterminális régió követ. 7 Az endothelsejtek szekréci- Munkahelyi háttér: Department of Neurology (I.L.H.K., J.L., R.P.W.R., J.S., R.J.O.), Cardiovascular Research Institute Maastricht (I.L.H.K., K.W., H.t.C., T.M.H., J.L., J.S., J.W.P.G.-R., R.J.O.), Department of Biochemistry (K.W., T.M.H.), Laboratory for Clinical Thrombosis and Haemostasis, Department of Internal Medicine (H.t.C., J.W.P.G.-R.) és Department of Clinical Chemistry (O.B.), Maastricht University Medical Centre, Maastricht; Department of Neurology (I.L.H.K.), Medisch Spectrum Twente, Enschede, Hollandia. Anyagi háttér: I.L.H. Knottnerus munkáját a Netherlands Thrombosis Foundation finanszírozta (grant 2007-3). K. Winckers munkáját a Netherlands Heart Foundation finanszírozta (grant 2007B138). R.P.W. Rouhl munkáját a Netherlands Heart Foundation támogatta (grant 2005B022). Érdekeltségek: A szerzők érdekeltségei a cikk végén olvashatók. 86 Copyright 2012 by AAN Enterprises, Inc. 2. évfolyam, 2 3. szám, 2012. december

ójakor a TPFI egy része a sejtfelszíni proteoglikánokhoz kötődik. A plazmában a legtöbb TPFI lipoproteinekhez, elsősorban az alacsony denzitású lipoproteinhez (lowdensity lipoprotein, LDL) kötött és néhány karboxiterminális rövidített formából áll, miközben a plazmában található TFPI csupán 10%-át alkotja a szabad FL forma. 8,9 A heparin adása a sejtfelszíni glycocalixban található TFPI-t felszabadítja és az endothelsejtek TPFI-szekrécióját idézi elő. 10,11 Ebben a vizsgálatban a keringő TFPI szintjét határoztuk meg az endothel aktivációjának markereként LS-en első alkalommal átesett betegeknél. Először a teljes TFPI- és a szabad FL- TFPI-szintet mértük. Előbbi a szabad és a lipoproteinhez kötött formákból tevődik össze. Végül beteg és kontrollszemélyek esetén mértük a heparinnal felszabadítható szabad FL-TFPI szintjét. MÓDSZEREK A vizsgált populáció. Ahogy korábban közöltük, 2003 májusa és 2007 decembere között 149, LS-en első alkalommal átesett beteget vontunk be prospektív vizsgálatunkba a Maastricht University Medical Centre (MUMC) és a közeli, hollandiai Orbis Medical Centre Sittard intézményekből. 12 Azokat a betegeket, akiknél feltehetőleg cardioemboliás eredet vagy súlyos (prae)cerebralis nagyérbetegség állt fent, kizártuk a vizsgálatból. Rögzítettük a vascularis kockázati tényezőket. Negyvenkét beteg, akik izomeredetű hátfájdalom vagy idegi eredetű fájdalom miatt keresték fel ambulanciánkat, egészséges kontrollként vett részt a vizsgálatban. Ezek a személyek nem szenvedtek vascularis vagy gyulladásos betegségekben, hypertensióban vagy diabetesben, és esetükben agyi MR-vizsgálattal SIL nem volt kimutatható. A beteg és a kontrollszemélyek több mint 95%-a a kaukázusi rasszba tartozott. Az LS típusainak meghatározása. Minden betegen MR-vizsgálatot végeztük a korábban leírt protokollnak megfelelően. 13 A betegeket akkor soroltuk a SIL-pozitív csoportba, ha egy vagy több tünetmentes lacunaris infarktus (asymptomatic lacunar infarct, alac) vagy kiterjedt fehérállományi laesio (white matter lesion, WML) volt kimutatható az MR-vizsgálat alkalmával. Kiterjedt WML-ről akkor beszéltünk, ha 3-as fokozatú periventricularis WML vagy 2-es, illetve 3-as fokozatú mély WML volt jelen a módosított Fazekas-féle skála szerint. 14 Amennyiben sem alac, sem kiterjedt WML nem volt megfigyelhető az MR-vizsgálat alkalmával, a beteget az izolált lacunaris infarktus (isolated lacunar infarct, ILA) csoportba soroltuk. Minták. Az ischaemiás eseményt követően minimum három hónappal (medián 137 nap, kvartilisek közötti távolság 106 206 nap) egy éjszakán át tartó koplalást követően vénás vérmintákat vettünk. Az első mintát a koleszterin, az LDL-koleszterin, a HDL-koleszterin és a triglicerid meghatározására használtuk. A második minta antikoagulánsként 3,2%-os nátrium-citrátot tartalmazott. Ebből határoztuk meg a TFPI szintjét. A vérlemezkében szegény plazmát a vér levételét követően kétlépéses centrifugálással azonnal elkészítettük. Az első lépés öt percig 2000 g-vel történt, amelyet a felülúszó szobahőmérsékleten, 10 percig 11 000 g-vel történő centrifugálása követett. A maradék plazmát 80 C-on tároltuk, majd felhasználás előtt 37 C-on olvasztottuk fel. A teljes és a szabad FL-TFPI-szint elemzése. Az extrinszik (protrombinidő) és az intrinszik (aktivált parciális tromboplasztinidő) alvadási útvonalak vizsgálatához hagyományos teszteket alkalmaztunk az egyértelmű alvadási rendellenességek kizárásához. A teljes TFPI-szintet a plazmában határoztuk meg könnyen beszerezhető ELISA kit (Asserachom Total TFPI teszteket a Diagnostica Stago, Asnières sur Seine, Franciaország gyártotta) segítségével. Ezzel az ELISA-módszerrel a plazma teljes TFPI-szintjét mértük (szabad és lipoproteinhez kapcsolt TFPI-formák). Egy intézetünkben kifejlesztett szabad FL-TFPI ELI- SA-módszert alkalmaztunk minden minta esetén két alkalommal, mivel ez a vizsgálat kizárólag a bioaktív, szabad FL-TFPI-szintet méri. 15 A szabad FL-TFPI-szintet a normális szinthez viszonyítva százalékos arányában fejeztük ki. A normális szintet, ami 100%-nak felelt meg, 87 egészséges klinikai dolgozó (MUMC) normális, poolozott (kevert) plazmájából határoztuk meg. Heparinnal felszabadítható FL-TFPI. Ebben az alvizsgálatban további kizárási kritériumokat vezettünk be: nem vehettek részt azok a személyek, akik az elmúlt három hónapban thromboticus eseményen estek át, vérzékenységben szenvedtek, anamnézisükben agyvérzés szerepel, az MR-vizsgálat agyi mikrovérzéseket mutat, orális véralvadásgátló kezelésben részesülnek, (ismert) heparinallergiájuk van vagy malignus hypertensióban szenvednek. A vérvételt és a vitális paraméterek rögzítését követően, szárnyas tűvel a mintavétel oldalán intravénásan 7500 NE nem frakcionált heparint (Heparin LEO; LEO Pharma B.V., Breda, Hollandia) adtunk. Tíz perccel később egy második heparinos (heparin adása utáni) vénás vérmintát vettünk az ellenoldali karból. A szabad FL-TFPI-szintet a fent leírt ELISA-technikával mértük. Az anti-xa-aktivitást, a heparinkoncentráció méréseként, Biophen Heparin (hyphen BioMed) használatával egy automata elemző segítségével (BCS analyzer, Siemens, München, Németország) határoztuk meg. Hagyományos protokollra vonatkozó jóváhagyások, regisztrációk és a betegek vizsgálatba történő beleegyezése. A vizsgálati protokollt a helyi, kutatással foglalkozó etikai bizottság hagyta jóvá mindkét kórház esetén. Minden résztvevő tájékozott beleegyező nyilatkozatot tett. A heparin adására vonatkozó alvizsgálatot a Dutch Trial Register (Nederlands Trial Register, NTR 1392, www.trialregister.nl) és az EudraCT (European Union Drug Regulating Authorities Clinical Trials) Database (EudraCT-number 2008 004280-19) jegyezte be. Erre a vizsgálatra vonatkozóan a résztvevők külön tájékozott beleegyező nyilatkozatot írtak alá. Statisztikai elemzés. A normális eloszlást mutató adatokat átlag±sd formában, az ettől elérő eloszlásúakat a medián és a kvartilisek közötti távolság megadásával, a kategorikus változókat pedig a frekvenciák alapján közöljük. Az átlagokat kétmintás t-próbával vagy Mann Whitney-próbával elemeztük. A kategorikus változók esetén Pearson-féle χ 2 -próbát alkalmaztunk. Bináris egyváltozós és többváltozós logisztikus regressziót használtunk a plazmában található teljes TFPI és a szabad FL-TFPI közötti kapcsolat vizsgálatára beteg és kontrollszemélyek, illetve a betegek különböző alcsoportjai (ILA kontra SIL-pozitív) esetén. A következő változókat vettük figyelembe: életkor, nem, hypertensio, diabetes, dohányzás, koszorúér-betegség, a vér teljes LDL-, HDL-koleszterin-, illetve trigliceridszintjét. A változókat csak abban az esetben vettük be a modellbe, ha a korábbi elemzés kapcsán p<0,1 szinten szignifikáns eredményt kaptunk. A kiválasztott változókat egyszerre vittük be a modellbe ( enter módszer az SPSS-ben). Összehasonlítottuk a szabad FL-TFPI-koncentrációt a heparin adása előtt és után (heparinnal felszabadítható FL-TFPI) a kontroll- és a beteg személyek között. Egy új változót (delta- TFPI) hoztunk létre, amelyet a szabad FL-TFPI heparin adása előtti és utáni szintjének különbségével kaptunk meg. Bináris logisztikus regressziós elemzéssel kiküszöböltük az életkort a beteg és kontrollszemélyek szabad FL-TFPI-szintje közötti kapcsolat vizsgálatakor. Vizsgálatunk szerint statisztikailag meggyőző erejű (a=0,05 és β=0,20), 20%-os különbség kimutatásához mindkét heparinos minta esetén 15 alanyra lenne szükség. Szignifikánsnak a p<0,05 értékű kétoldali valószínűséget tekintettük. A statisztikai elemzést SPSS for Windows (16.0 verzió, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program segítségével végeztük. 87

Táblázat Klinikai jellemzôk, teljes TPFI-szint, szabad FL-TPFI és heparinnal felszabadítható FL-TFPI Lacunaris stoke-on átesett betegek Klinikai jellemzôk Összes beteg (n =149) ILA (n =43) SIL-pozitív (n =106) Kontroll (n =42) Életkor, év, átlag±sd 62,7±11,7 58,9±10,0 64,3±11,9 61,6±7,7 Férfi nem, n (%) 93 (62) 26 (61) 67 (63) 21 (50) Hypertensio, n (%) 98 (66) b 27 (63) 71 (67) 0 Diabetes, n (%) 19 (13) b 6 (14) 13 (12) 0 Koleszterinszint, mmol/l, átlag±sd 4,2±0,8 b 4,0±0,9 4,3±0,8 c 5,7±1,0 LDL, mmol/l, átlag±sd 2,3±0,6 b 2,1±0,7 2,4±0,6 c 3,8±1,0 HDL, mmol/l, átlag±sd 1,2 (1,0 1,5) 1,1 (0,9 1,3) 1,2 (1,0 1,5) a 1,1 (1,0 1,5) Triglicerid, mmol/l, medián (IQR) 1,3 (0,9 1,8) 1,3 (0,9 2,2) 1,2 (0,9 1,8) 1,1 (0,8 1,7) Lipidcsökkentô kezelés, n (%) 134 (90) 39 (91) 95 (90) 3 (7) Dohányzás, n (%) 81 (55) 20 (47) 61 (58) 19 (45) Koszorúér-betegség, n (%) 19 (13) b 4 (9) 15 (14) 0 TFPI-szint Teljes TFPI, ng/ml, medián (IQR) 69,5 (60,5 83,9) b 61,3 (54,7 77,7) 71,0 (62,8 86,0) a 80,3 (68,1 91,9) Szabad FL-TFPI, %N, medián (IQR) 138±49 138±45 138±50 142±29 Heparin adása n=17 n=15 FL-TFPI heparin elôtt, %N, átlag±sd 146±37 174±56 FL-TFPI heparin után, %N, átlag±sd 1297±246 b * 1039±302 FL-TFPI delta (után elôtt), átlag±sd 1151±226 b 865±286 Rövidítések: %N: a normálérték százaléka; FL=teljes hosszúságú; ILA=izolált lacunaris infarktus; IQR=kvartilisek közötti távolság; LDL=alacsony denzitású lipoprotein; HDL=nagy denzitású lipoprotein; SIL=tünetmentes/csendes ischaemiás laesio; TFPI=szöveti faktor útvonalat gátló faktor. a p<0,05 ILA kontra SIL-pozitív esetben. b p<0,05 beteg kontra kontroll esetben. c p<0,1 ILA kontra SIL-pozitív esetben. 88 EREDMÉNYEK A klinikai jellemzőket a Táblázatban közöljük. A klinikai lacunaris szindróma 68 (45,6%) betegnél tisztán motoros stroke-ból, 36 (24,1%) betegnél szenzomotoros stroke-ból, 28 (18,8%) esetben tisztán szenzoros stroke-ból, 10 (6,7%) betegnél ataxiás hemiparesisből/dysarthria-ügyetlen kéz szindrómából és 7 (4,7%) esetben egyebekből tevődött össze. A teljes TFPI és a szabad FL-TFPI. A plazma teljes TF- PI-szintje a betegek esetén alacsonyabb volt, mint a kontrollcsoportnál (p<0,01; esélyhányados [odds ratio, OR]: 0,98, 95%-os konfidenciaintervallum [confidence interval, CI]: 0,96 1,00, ng/ml). Az összefüggés többváltozós elemzéssel is kimutatható volt, amelyben a hypertensio, a diabetes és a koszorúér-rendellenesség szerepelt (OR: 0,94, 95%-os CI: 0,94 0,99, ng/ml). Azonban, ha a modellhez a teljes és az LDL-koleszterin-szintet is hozzáadtuk, az LS és a teljes TFPI közötti kapcsolat nem maradt statisztikailag szignifikáns (OR: 1,02, 95%-os CI: 0,98 1,06, ng/ml). Az LS altípusaiban mért teljes TFPI-szint különbsége a kontrollcsoport esetén eltérő volt (p<0,01, OR: 0,95, 95%-os CI: 0,93 0,98, ng/ml az ILA esetén és p=0,03, OR: 0,99, 95%-os CI: 0,97 1,00, ng/ml a SIL-pozitív esetekben). Többváltozós elemzéssel az összefüggés az ILA esetén megmaradt (OR: 0,93, 95%-os CI: 0,88 0,99, ng/ ml), míg SIL-pozitivitás esetén eltűnt (OR: 0,97, 95%-os CI: 0,94 1,00, ng/ml). Azonban, ha a modellhez hozzáadtuk a teljes és az LDL-koleszterin-szintet, az ILA esetén kijött eredmény nem maradt szignifikáns (OR: 0,97, 95%-os CI: 0,90 1,04, ng/ml). Az LS alcsoportjaiban a teljes TFPI-szint magasabbnak bizonyult SIL-pozitív esetekben az ILA-val szemben (p<0,01, OR: 1,03, 95%-os CI: 1,00 1,05). Többváltozós elemzés során, amelybe az életkort is belefoglaltuk (OR életkor: 1,04, 95%-os CI: 1,00 1,07) az összefüggés csökkent, de az OR 1,02 maradt (95%-os CI: 1,00 1,05). A koleszterin, LDL- és HDL-koleszterin figyelembevételével az összefüggés erőssége tovább csökkent (OR: 1,01, 95%-os CI: 0,98 1,03, ng/ml). A szabad FL-TFPI-szint nem különbözött az LS-en átesett betegek és a kontrollszemélyek, illetve az LS altípusai között (Táblázat). Heparinnal felszabadítható FL-TFPI. A heparinnal felszabadítható FL-TFPI szintjét 17 betegnél és 15 kontrollszemélynél határoztuk meg. A stroke és a heparin adása között eltelt idő 46±14 hónap volt. Vizsgáltuk az életkort (64,9±9,7 év a betegeknél és 62,3±6,8 év a kontrollcsoportnál, p=0,27), a nem megoszlását (77% férfi kontra 80% férfi, p=0,81), a diabetes (12% kontra 0%, p=0,17) és a dohányzás (67% kontra 71%, p=0,81) előfordulásának arányát. Hypertensio gyakrabban fordult elő a betegek körében (65% kontra 0%, p<0,01), azonban a heparin adásakor mért vérnyomásérték hasonló

Ábra A normál, poolozott plazmában található TFPI százalékos aránya Heparin beadása elôtti és utáni teljes hosszúságú (full-length, FL) szöveti faktor útvonalat gátló faktor (tissue factor pathway inhibitor, TFPI) szintjérôl készült pontdiagram lacunaris stroke-on átesett és kontrollszemélyeknél 2000 1500 1000 500 0 Elôtte Utána Delta Elôtte Utána Delta Kontrollszemélyek (n=15) Betegek (n=17) Az FL-TFPI szintje átlag- (±SD) értékével ábrázolva a heparininjekció beadása elôtt és 10 perccel utána 15 kontrollszemély és 17 beteg esetén. * p<0,05. volt a betegek és a kontrollszemélyek között (140±15 Hgmm kontra 137±10 Hgmm a szisztolés nyomás esetén, p=0,56 és 89±8 Hgmm kontra 88±6 Hgmm a diasztolés nyomás esetén, p=0,55). A betegeknek alacsonyabb volt a teljes koleszterin- (4,2±0,7 mmol/l kontra 5,9±0,5 mmol/l, p<0,01) és az LDL-koleszterin-szintjük (2,4±0,6 mmol/l kontra 3,9±0,5 mmol/l, p<0,01). Minden esetben megnyúlt, 300 másodperces aktivált parciális tromboplasztinidőt mutattunk ki. Az anti-xa-aktivitás szintén emelkedett volt, de a betegek (3,29±0,83 NE/ml) és a kontrollcsoport (3,31±1,19 NE/ml, p=0,96) között hasonló mértékben. Heparin adása a szabad FL-TFPI-szint közel kilencszeres emelkedését vonta maga után. A szabad FL-TFPI a heparin adása utáni mintákban a betegeknél magasabb volt, mint a kontrollcsoport esetén (p=0,01) ugyanúgy, mint a delta-tfpi (p<0,01) (Ábra). A heparinnal felszabadítható FL-TFPI szintje és az LS közötti összefüggés az életkorra történő igazítás után is megmaradt (OR: 1,00, 95%-os CI: 1,00 1,01 a heparinnal felszabadítható FL- TFPI esetén; OR: 1,01, 95%-os CI: 1,00 1,01 a delta-fl- TFPI esetén). Végül 17, LS-en átesett beteg figyelembevételekor az LS altípusait nem tudtuk értékelni. MEGBESZÉLÉS Bár a teljes TFPI-szint alacsonyabb volt az LS-en átesett betegeknél, mint a kontrollcsoportban, továbbá a TFPI-szint magasabb volt LS-en átesett betegeknél egyidejű SIL előfordulásakor, mint ILA esetén, mindkét összefüggés megszűnt az életkorra és a koleszterinszintre történő igazítás után. A TFPI bioaktív formájának (szabad FL-TFPI) szintje nem különbözött a beteg és a kontrollszemélyek, illetve az LS-altípusok között. Heparin adását követően a szabad FL-TFPI-szint a kilencszeresére emelkedett; a betegeknél magasabb szintet lehetett megfigyelni, mint a kontrollcsoportban. A patológiai 16,17 és képalkotó 18,19 vizsgálatok alátámasztják, hogy az LS SIL-lel társuló altípusának kiváltó tényezője az endothel aktivációja lehet, amit a plazma összetevőinek érfalon történő átáramlása követ a perivascularis térbe és az agyi parenchymába. 2 A SIL altípusban az érfal generalizált, diffúz destrukciója (lipohyalinosis) figyelhető meg a szövettani vizsgálat során. Ezzel szemben ILA altípus esetén lokalizált, atheroscleroticus plakkok (microatheromatosis) láthatóak. 20 Az endothel működését a sejtek által normális körülmények között kiválasztott anyagok szintjének mérésével értékelhetjük. 21 Ilyen anyag a TFPI, amelyből a legnagyobb mennyiség az endotheliumban található. 5 Az ischaemiás stroke-ban jelen lévő TFPI-szinttel kapcsolatban kevés adat áll rendelkezésre. A legtöbb vizsgálatban a TFPI-szintet az akut fázis alatt mérték, így az akut ischaemiás esemény értékelésére használták. 22,23 Más vizsgálatokban az ischaemiás stroke-ot nem osztották alcsoportokra. 24,25 Ez azonban fontos szempont, mivel különböző esetekben eltérő patofiziológiai folyamatok játszódnak le. A teljes TFPI-szintet LS-en átesett betegeknél csak egy vizsgálatban mérték a krónikus fázis során. Ebben a vizsgálatban azt tapasztalták, hogy a TFPI szintje magasabb volt a betegeknél, mint a kontrollcsoport esetén, különösen az ILA-alcsoportban. 26 Mindkét eredmény ellentmond saját tapasztalatunknak, amelyet az alábbiakkal magyarázhatunk. Először is a plazma-tfpi jelentős része (80%) LDL-hez kötött, 9 az LDLszint a plazma TFPI-koncentrációjával összefüggésben áll. 27 Magas koleszterinszintű betegeknél a koleszterin és az LDL szintjének csökkentése 3-hidroxi-3-metilglutaril koenzim A-reduktáz-gátlóval a teljes TFPI szintjének csökkenéséhez vezet. 28 Szinte minden betegünk, kivéve három kontrollalanyt, statinokat szed, ami magyarázhatja a betegeknél megfigyelt alacsonyabb TFPI-szintet. A korábban említett vizsgálatban a statinok használatával kapcsolatban nem áll rendelkezésre információ. 26 Mindezek mellett vizsgálatunkba az LS SIL altípusában magasabb TFPI-szintet figyeltünk meg. Ezt az életkor magyarázhatja, mivel a SIL előfordulása 29 és a teljes TFPI szintje 30 is emelkedik az életkor előrehaladtával. Eredményeinkből a TFPI, mint endothelialis marker, betegségre kifejtett hatására nem lehetett következtetni. A plazma-tfpi csupán 10%-a kering szabad FL formában. 27 Vizsgálatunk során a TFPI e bioaktív formáját mértük egy intézetünkben kifejlesztett ELISA-módszer segítségével. Nem találtunk különbséget az LS-en átesett betegek (alcsoportjai) és a kontrollcsoport között. Tekintettel arra, hogy a keringő TFPI lipoproteinekhez kötött és a szabad FL-TFPI a teljes TFPI csupán kis százalékát adja, 27 a különbségeket nagyobb, a TFPI által jobban érintett (endothelhez kötött) területen vizsgáltuk. Heparin intravénás beadását követően, ami az FL-TFPI endothelből történő felszabadulásának lehetséges serkentője, azt tapasztaltuk, hogy a heparinnal felszabadítható, endothelhez kötött FL-TFPI szintje LS-en átesett betegeknél magasabb, mint a kontrollcsoportnál. Ez az összefüggés az életkorra történő igazítást követően is megmaradt. Szakirodalmi adatok arra utalnak, hogy a heparinnal felszabadítható TFPI nemcsak a glycocalixhoz kapcsolt TFPI-ből áll, hanem intracellularisan képződött TFPI is alkotja. 11 A heparin intravénás adását követően megfigyelt magasabb szabad FL-TFPI-szint arra mutat rá, hogy 89

az endothelsejtekből viszonylag nagy mennyiségű TFPI szabadul fel, ami az endothel aktivációjára utalhat LS-en átesett betegeknél. Vizsgálatunk erőssége, hogy a TFPI különböző formáit mértük, beleértve a heparinnal felszabadítható TFPI-szintet. Emellett a mintákat az ischaemiás eseményt követően minimum három hónappal gyűjtöttük, ami nagy valószínűséggel kizárja az akut fázis során kialakult válaszreakciók hatását. Mivel ugyanabban az időpontban a lipidek különböző típusait mértük, egyúttal elemezhettük a TFPI-szintre kifejtett hatásukat is. Végül pozitívumként sorolhatjuk fel, hogy a vizsgálatot LS-en átesett betegeknél gondoson meghatározott alcsoportokkal végeztük. A betegeinknél az infarktus az agyban található kiserek intrinszik megbetegedése miatt alakult ki. Vizsgálatunk gyenge pontja, hogy a beválasztást csak LS-ben szenvedő betegekre korlátoztuk és így eredményeinket az ischaemiás stroke egyéb típusaival nem hasonlítottuk össze. Továbbá tekintettel arra, hogy vizsgálatunk keresztmetszeti, nem lehet megállapítani, hogy az endothel aktivációja az LS kiváltó okaként szerepel vagy csupán egy kísérő jelenség. A betegek hosszú távú követése MR-vizsgálat ismételt végzésével megoldhatja ezt a kérdést. Vizsgálatunk során a TFPI-szintet az endothel aktivációjának markereként használtuk, így csak a TFPIkoncentrációt mértük. Antikoaguláns hatásával kapcsolatban elemzést nem végeztünk. A TFPI nem tekinthető agyspecifikus markernek. Azonban különböző bizonyítékok arra utalnak, hogy mivel az LS hátterében kimutatható kiserek betegsége szisztémás megbetegedés, 31 a megjelenés az agyi kiserek hálózatának megfelelően alakulhat. Az LS-en átesett betegek teljes TFPI szintjében megfigyelhető különbségeket többnyire az életkorfüggő hatások és az alkalmazott gyógyszerek együttese magyarázza. A heparinnal felszabadítható FL-TFPI magasabb szintje LS-en átesett betegeknél a kontrollcsoporthoz képest alátámasztja azt az elképzelést, miszerint az endotheldiszfunkció szerepet játszik az LS kialakulásában. Eredményeink megerősítésére és az LS-alcsoportok közötti különbségek értékelésére további vizsgálatok szükségesek. A SZERZÔK HOZZÁJÁRULÁSA Dr. Knottnerus: a kézirat elkészítése, a vizsgálat kitalálása/megtervezése, az adatok elemzése/közlése, az adatok összegyűjtése, statisztikai elemzés. Dr. Winckers: a kézirat ellenőrzése, az adatok közlése, az adatok összegyűjtése. Dr. ten Cate: a kézirat ellenőrzése, a vizsgálat kitalálása/megtervezése, az adatok elemzése/közlése, statisztikai elemzés, a vizsgálat ellenőrzése. Dr. Hackeng: a kézirat ellenőrzése, a vizsgálat kitalálása/megtervezése, az adatok közlése. Dr. Lodder: a kézirat elkészítése, a vizsgálat kitalálása/megtervezése, a vizsgálat ellenőrzése. Dr. Rouhl: a kézirat ellenőrzése, az adatok összegyűjtése. Dr. Staals: a kézirat ellenőrzése, az adatok összegyűjtése. Dr. Govers-Riemslag: a kézirat ellenőrzése, az adatok összegyűjtése. Dr. Bekers: az adatok összegyűjtése. Dr. van Oostenbrugge: a kézirat ellenőrzése, a vizsgálat kitalálása/megtervezése, statisztikai elemzés, a vizsgálat ellenőrzése/szervezése, támogatási források biztosítása. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A szerzők köszönetüket fejezik ki Rene van Oerle iránt a laboratóriumi munkában nyújtott segítségéért. ÉRDEKELTSÉGEK Dr. Knottnerus részéről érdekeltség nem áll fenn. Dr. Winckers kutatási támogatást kap a Dutch Heart Association szervezettől. Dr. ten Cate utazási támogatást kapott a Bayer Schering Pharma, a GlaxoSmithKline és a Boehringer Ingelheim cégektől; a Journal of Thrombosis és Haemostasis and Thrombosis szerkesztőbizottsági tagja; kutatási támogatást kap a Center for Translational and Molecular Medicine-től. Dr. Hackeng és dr. Lodder részéről érdekeltség nem áll fenn. Dr. Rouhl kutatási támogatást kap a Netherlands Heart Foundation nevű alapítványtól. Dr. Staals, dr. Govers, dr. Bekers és dr. van Oostenbrugge részéről érdekeltség nem áll fenn. Beérkezett 2011. június 17-én. Végleges formában elfogadva 2011. október 7-én. IRODALOM 1. Bamford J, Sandercock P, Jones L, Warlow C. The natural history of lacunar infarction: the Oxfordshire Community Stroke Project. Stroke 1987;18:545 551. 2. Wardlaw JM, Sandercock PA, Dennis MS, Starr J. Is breakdown of the blood-brain barrier responsible for lacunar stroke, leukoaraiosis, and dementia? Stroke 2003;34:806 812. 3. Farrall AJ, Wardlaw JM. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease: systematic review and meta-analysis. Neurobiol Aging 2009;30:337 352. 4. Deanfield JE, Halcox JP, Rabelink TJ. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation 2007;115:1285 1295. 5. Bajaj MS, Kuppuswamy MN, Saito H, et al. Cultured normal human hepatocytes do not synthesize lipoprotein-associated coagulation inhibitor: evidence that endothelium is the principal site of its synthesis. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:8869 8873. 6. Mackman N, Tilley RE, Key NS. Role of the extrinsic pathway of blood coagulation in hemostasis and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007;27:1687 1693. 7. Wun TC, Kretzmer KK, Girard TJ, et al. Cloning and characterization of a cdna coding for the lipoproteinassociated coagulation inhibitor shows that it consists of three tandem Kunitz-type inhibitory domains. J Biol Chem 1988;263:6001 6004. 8. Lesnik P, Vonica A, Guerin M, et al. Anticoagulant activity of tissue factor pathway inhibitor in human plasma is preferentially associated with dense subspecies of LDL and HDL and with Lp(a). Arterioscler Thromb 1993;13:1066 1075. 9. Broze GJ Jr, Lange GW, Duffin KL, MacPhail L. Heterogeneity of plasma tissue factor pathway inhibitor. Blood Coagul Fibrinolysis 1994;5:551 559. 10. Gori AM, Pepe G, Attanasio M, et al. Tissue factor reduction and tissue factor pathway inhibitor release after heparin administration. Thromb Haemost 1999;81:589 593. 11. Lupu C, Poulsen E, Roquefeuil S, et al. Cellular effects of heparin on the production and release of tissue factor pathway inhibitor in human endothelial cells in culture. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19:2251 2262. 12. Knottnerus IL, Govers-Riemslag JW, Hamulyak K, et al. Endothelial activation in lacunar stroke subtypes. Stroke 2010;41:1617 1622. 13. Rouhl RP, van Oostenbrugge RJ, Damoiseaux JG, et al. Haptoglobin phenotype may alter endothelial progenitor cell cluster formation in cerebral small vessel disease. Curr Neurovasc Res 2009;6:32 41. 14. Fazekas F, Chawluk JB, Alavi A, et al. MR signal abnormalities at 1.5 T in Alzheimer s dementia and normal aging. AJR Am J Roentgenol 1987;149:351 356. 15. Maurissen LF, Castoldi E, Simioni P, et al. Thrombin generation-based assays to measure the activity of the TFPI- 90

protein S pathway in plasma from normal and protein S- deficient individuals. J Thromb Haemost 2010;8:750 758. 16. Ma KC, Olsson Y. Structural and vascular permeability abnormalities associated with lacunes of the human brain. Acta Neurol Scand 1993;88:100 107. 17. Lammie A. The role of oedema in lacune formation. Cerebrovasc Dis 1998;8:246. 18. Wardlaw JM, Dennis MS, Warlow CP, Sandercock PA. Imaging appearance of the symptomatic perforating artery in patients with lacunar infarction: occlusion or other vascular pathology? Ann Neurol 2001;50:208 215. 19. Wardlaw JM, Doubal F, Armitage P, et al. Lacunar stroke is associated with diffuse blood-brain barrier dysfunction. Ann Neurol 2009;65:194 202. 20. Arboix A, Marti-Vilalta JL. Lacunar stroke. Expert Rev Neurother 2009;9:179 196. 21. Knottnerus IL, Ten Cate H, Lodder J, et al. Endothelial dysfunction in lacunar stroke: a systematic review. Cerebrovasc Dis 2009;27:519 526. 22. He M, Wen Z, He X, et al. Observation on tissue factor pathway and some other coagulation parameters during the onset of acute cerebrocardiac thrombotic diseases. Thromb Res 2002;107:223 228. 23. Abumiya T, Yamaguchi T, Terasaki T, et al. Decreased plasma tissue factor pathway inhibitor activity in ischemic stroke patients. Thromb Haemost 1995;74:1050 1054. 24. Adams MJ, Thom J, Hankey GJ, et al. The tissue factor pathway in ischemic stroke. Blood Coagul Fibrinolysis 2006;17:527 532. 25. Ariens RA, Alberio G, Moia M, Mannucci PM. Low levels of heparin-releasable tissue factor pathway inhibitor in young patients with thrombosis. Thromb Haemost 1999;81:203 207. 26. Hassan A, Hunt BJ, O Sullivan M, et al. Markers of endothelial dysfunction in lacunar infarction and ischaemic leukoaraiosis. Brain 2003;126:424 432. 27. Crawley JT, Lane DA. The haemostatic role of tissue factor pathway inhibitor. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008;28:233 242. 28. Morishita E, Asakura H, Saito M, et al. Elevated plasma levels of free-form of TFPI antigen in hypercholesterolemic patients. Atherosclerosis 2001;154:203 212. 29. Goto K, Ishii N, Fukasawa H. Diffuse white-matter disease in the geriatric population. A clinical, neuropathological, and CT study. Radiology 1981;141:687 695. 30. Mitchell CT, Kamineni A, Palmas W, Cushman M. Tissue factor pathway inhibitor, vascular risk factors and subclinical atherosclerosis: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Atherosclerosis 2009;207:277 283. 31. Lindley RI, Wang JJ, Wong MC, et al. Retinal microvasculature in acute lacunar stroke: a cross-sectional study. Lancet Neurol 2009;8:628 634. Fordította: Dr. Kelemen Gyöngyi 91