mléketető: fluorescencia spektrumok Fluorescencia polariáció, aniotrópia FRT Definíció! a. missiós spektrum b. Gerjestési spektrum (ld. absorpciós sp.) Stokes-féle eltolódási törvén A emissiós spektrum maimuma eltolódik a nagobb hullámhossak iránába (energiavesteség!). Gerjestett-állapot Jablonski diagram; hol les a emissiós spektruma? S1 Vibrációs relaáció (10-12s) S1 T1: rendserek köötti átmenet (10-10 10-8 s) T1 gerjestés (10-15s) S0 S1 T1 S0 (10-3 10-1 hν Alap-állapot S0 4 3 2 1 0 vibrációs sintek 5 Fosforescencia Fluorescens folamatok időtartama átmenet elneveés sebességi állandójele időtartam (s) S(0) S(1)(Sn) gerjestés - 10-15 S(n) S(1) belsőátalakulás k(ic) 10-14 - 10-10 S(1) S(1) vibrációs relaáció k(vibr.) 10-12 -10-10 S(1) S(0) fluorescencia k(f) 10-9 -10-7 S(1) T(1) S(1) S(0) rendserek kööttiátmenet sugárásmentes átmenet k(interss.crossing) k(q) 10-9 -10-7 10-7 -10-5 T(1) S(0) fosforescencia k(p) 10-3 - 1 T(1) S(0) sugárásmentes átmenet k(qp) 10-3 - 1 1
SPKTROFLUOROMÉTR SMATIKUS RAJZA F M S 90o Tükör A fluorescencia alkalmaásának előnei - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluorescencia éréken a körneetre M D 90 -os (nem lineáris) elrendeés!!! A fluorescencia alapvető paraméterei Fluorescencia spektrum Intenitás Kvantumhatásfok Élettartam Polariáció A kvantum fiikában a legkisebb adag, amivel eg mérhető menniség növelhető. A energia kvantuma például a foton, eg adod frekvenciájú hullámserű csomag. A elektromágneses sugárás ilen csomagokban érkeik. Kvantumhatásfok (Q) Milen hatásfokkal fordítódik a elnelt energia fénkibocsátásra. emittált fotonoksáma Q = absorbeált fotonoksáma A fluorescencia alapvető paraméterei Fluorescencia spektrum Intenitás Kvantumhatásfok Élettartam Polariáció F0 0.4 F0 Fluorescencia élettartam (τ) A gerjestett állapot élettartama: Időtartam, mel alatt a gerjestett molekulák sáma e-ad résére csökken. 1 0.8 0.6 1.2 F = F0e (kt +knr )t t τ = F0e e 0.2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 τ t 2
A fluorescencia alapvető paraméterei Fluorescencia spektrum Intenitás Kvantumhatásfok Élettartam Polariáció Polariátor működésének elve Polariáció fogalma A elektromágneses sugárás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatároott görbe mentén moog (térbeli iránultság!). Síkban polariált fén Ha a görbe egenes: lineáris v. sík polariáció Ha a görbe kör: cirkuláris polariáció (Ha a görbe elipsis: elliptikus polariáció) A polariálatlan fénben a polariációs síkok keverednek. A polariált fénben a polariációs síkok össhangban vannak (aonosak). A polariátor Definíció: A polariátor eg olan eskö mel képes a polariálatlan elektromágneses sugárást (fén) olan sugárássá alakítani, melben csak egféle polariációs sík van jelen. Hol találkotunk már polariátorral? 3
Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Polariáció, intenitások Optikai aktivitás: poláros fén síkját elforgatják Fénforrás t α = αλ lc Θ polariátor Intenitás eg adott iránban: 2 Ι =Ιma cos Θ Polariátor Párhuamos állás: Mintatartó Θ = 0, I = Ima Merőleges állás: Analiátor Θ = 90, I = 0 Megfigelő királis molekulák nem kell gerjesteni! Polariméter A absorpciós vektor fogalma Fotoselekció MA = absorpciós vektor θa Nincs absorpció (θ= 90o) gerjestés Maimális absorpció (θ= 0o) θa Absorpció ~ cos2θa (ma=1) absorpciós vektor: megsabja a foton absorpciójának valósínűségét. A fotoselekció eredméne Mi történik a fotoselekciót követően? " " Mogás: - transláció; - rotáció. 4
Hogan jellemehető e a rotációs mogás? A emissiós vektor M = emissiós vektor IZ θ gerjestés Detektor emissiós vektor: megsabja a foton emissiójának valósínűségét. Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a komponens! SPKTROFLUOROMÉTR SMATIKUS RAJZA F M P S IZ θ IZ vs. Isum = IZ + + Vag vertikálisan, vag horiontálisan heleük el a polariátorokat: 90o P M IVV IVH (A teljes intenitásho tudjuk visonítani.) IHV IHH D Polariátorokat alkalmaunk!!! Íg a teljes intenitás: Isum = IZ + + Fluorescencia polariáció Isum = IVV + IVH + IVH IZ θ Isum = IVV + 2IVH 5
Fluorescencia polariáció p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) Ha τ = 0 lenne: IVV ma., IVH = 0, tehát p = 1. dimenió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja nem additív!!! értéke 0-tól 1-ig váltohat (ld. követkeő dia). G = IHV / IHH Ha τ nagon hossú lenne: IVV = IVH, tehát p = 0. De nem additív!!! missiós aniotrópia Fluorescencia aniotrópia r = (IVV - GIVH) / (IVV + 2GIVH) dimenió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától G = IHV / IHH a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja additív!!! Isum = IZ + + Isum = IVV + IVH + IVH Isum = IVV + 2IVH Mint láttuk, rotációs mogást ír le! A aniotrópia jelentése és alkalmaásai Polariált fén IZ θ τ IZ θ Résben polariált fén Rotációs diffúió 6
A aniotrópia időfüggése Határérték aniotrópia (r0) A teljes modulatlan, fagott fluorofór aniotrópiája. r I(t) = I0ep-t/τ r0 = 2 3cos2 β 1 5 2 Absorpciós vektor β missiós vektor r(t) = r 0 ai ep( t/θ) β: a absorpciós és emissiós vektor által beárt sög. t β 0 45 54.7 r0 0.4 0.1 0 Mire emléketet a időfüggés? 90-0.2 Alkalmaások Mitől függ a aniotrópia értéke? - A rotációs mogás gorsaságától; rotációs diffúió; - A rendelkeésre álló időtől; fluorescencia élettartam! Serkeeti tulajdonságok visgálata Fehérje denaturáció nomonkövetése Protein-ligand kölcsönhatás visgálata Serkeet visgálata a körneeti paraméterek (ph, ionok) váltoásának függvénében Dinamikus tulajdonságok visgálata Membránho kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viskoitásról Fehérjékhe kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a fehérjemátri fleibilitásáról Fluorescencia Reonancia nergia Transfer (FRT) - Theodor Förster, 1948 A FRT Feltételei A Förster Rpusú energiatransfer a gerjested állapotban lévő fluoreskáló molekula (donor), valamint eg megfelelő spektroskópiás követelméneket kielégítő molekula (akceptor) kööd dipól- dipól kölcsönhatás révén, sugárás nélküli energiaátadás formájában jön létre. A gerjested donor relaációja a akceptor molekula emissiója révén valósul meg.! Fluorescens donor és akceptor molekula. A donor és akceptor molekula köö^ távolság 2-10 nm.! Ábedés a donor emissiós spektruma és a akceptor absorpciós spektruma kööd. k t~1/r 6 R 7
Spektrális ÁAedés Fluorescencia Reonancia nergia Transfer k t ~1/R 6 R k t = konst. * J(λ) n - 4 k f R - 6 κ 2 J(λ): ábedési integrál, n: törésmutató (1.33-1.6), k f : a fluorescencia emissiójának sebességi állandója, R: a donor és a akceptor molekula köö^ távolság, κ: orientációs faktor (2/3) k t = (1/τ D ) * (R 0 /R) 6 k t : a energia transfer sebességi állandója, τ D : a donor molekula fluorescencia éledartama a akceptor hiánában, R: a donor és a akceptor molekula köö^ távolság, R 0 : Förster távolság a donor és a akceptor molekula kööd. KriCkus Förster Távolság (1) KriCkus Förster Távolság (2) A a távolság melen a FRT hatásfok felére csökken (transferhatásfok 0.5). FRT hatásfok R 0 = 0.211 [η -4 Q 0 κ 2 J(λ)] 1/6 κ 2 (κ-néget) = orientációs faktor, a donor emissiós vektorának és a akceptor absorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít várható érték 0 4 köött általában a k 2 = 2/3 (gors mogások miatti átlagolódás követketében) η = a köeg törésmutatója (1.33-1.6) Q 0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiánában J(λ) = átfedési integrál nergia Transfer Hatásfoka Távolságmérés FRT Segítségével (Molekuláris Mérősalag) FRT hatásfok 1: stead- state mérések = 1 (F DA / F D ) 2: időfüggő mérések (fluorescencia éle?artam) = 1 (τ DA / τ D ) 8
A donor intenitáscsökkenése a akceptor jelenlétében Össefoglalás 1: stead- state mérések = 1 (F DA / F D ) FRT távolságok meghatároására alkalmas megfelelő donor-akceptor párok esetén Molekulák köötti kölcsönhatások tanulmánoása Molekulákon belüli serkeeti váltoások tanulmánoása 9