Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában

Átírás

1 Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában Dr. Prohászka Zoltán Semmelweis Egyetem III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratórium prohoz@kut.sote.hu

2 Mi az egészséges immunrendszer működésének két alapvető jellemzője? A veszélyes idegentől védj meg Fertőzések ne alakuljanak ki A saját flóra tolerálása Az ártalmatlan sajátot ne bántsd Autoimmunitás ne alakuljon ki A károsodott saját kerüljön eltakarításra

3 A klinikai immunológiai vizsgálatok célja A beteg immunrendszerének vizsgálata Jól működik az immunrendszer? Immundeficiencia gyanú, fokozott infekció hajlam valamely jól jellemezhető tényező hiánya miatt Megfigyelhető valamely fertőzés vagy oltás hatására kialakult immunválasz? A károsodott saját eltakarításra kerül? Kóros az immunrendszer működése? Tolerancia vesztés, autoimmunitás A megváltozott sajátra adott helytelen válasz Kóros sejtszaporulat vagy kóros szekréciós tevékenység Immunológiai módszerek felhasználása egyéb betegségek vizsgálatában Az immunrendszer elemeinek felhasználása diagnosztikai célból, legtöbbször antitest alapú mérések Akut fázis reakció és a gyulladás mértékének mérése

4 Akkor mit is csinálnak egy immunológiai laborban? Antitestet mérnek vagy antitesttel mérnek A beteg immunrendszerének vizsgálata Jól működik az immunrendszer? Immundeficiencia gyanú, fokozott infekció hajlam valamely jól jellemezhető tényező hiánya miatt Megfigyelhető valamely fertőzés vagy oltás hatására kialakult immunválasz? Kóros az immunrendszer működése? Tolerancia vesztés, autoimmunitás Immunglobulin szint meghatározás Infekciós szerológia Autoantitest meghatározás Akut-fázis fehérje meghatározás, szérum elektroforézis Komplement fehérje meghatározás Limfocita-transzformció, sejtes vizsgálatok Sejtfelszíni markeranalízis Kóros fehérje meghatározás, immunelektroforézis Immun(hiszto)kémia, immunassay-k

5 Az előadás célja Típusos esetek bemutatása az immunológiai laboratóriumban gyakran felmerülő klinikai problémák megvilágítására A gyakori problémák megoldása során használt módszerek áttekintése Antitestek általános és analitikai tulajdonságai Antitest meghatározás a klinikai diagnosztikában Autoantitestek Infektív szerológia Funkcionális vizsgálatok Antitest alapú mérések klinikai-diagnosztikai felhasználása, Gyulladás, akut fázis reakció Molekuláris medicina, biomarkerek Sejtfelszíni markeranalízis Nem célja az előadásnak az összes módszer áttekintése és az egyes mérések elvének részletes bemutatása, valamint az immunológiai betegségek részletes áttekintése és laboratóriumi jeleik összefoglalása

6 Az antitestek alaptulajdonságai Két könnyűlánc (kappa vagy lambda) Antigénkötés (Fab) Variábilis és hipervariábilis régiók Biológiai funkciók (Fc) Osztály (izotípus) és alosztály Féléletidő Receptorkötés (FcR) Komplementaktiváió Két nehézlánc (gamma, mű, alfa, epszilon vagy delta) (izotípusok, vagy osztályok)

7 Az antitestek alaptulajdonságai Image provided by Wellcome Library, London Illustration of Paul Ehrlich s lecture "On Immunity with Special Reference to Cell Life", which he gave to the Royal Society on 22 March 1900.

8 Mi a közös a 4 betegben? Beteg ban született fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat. Beteg ban született nő, 20 éves kora óta van szem- és szájszárazsága, izületi panaszai, bőrtünetei, gyorsult süllyedése, vashiányos anémiája. 2 hete hőemelkedése és szúró mellkasi fájdalma is van, sürgős kórházi felvétel. Beteg ben született férfi, 46 éves korában intermittáló láz, hepato-splenomegalia miatt kórházi kezelés. Hepatitis B és C szerológia negatív, EBV szerológia negatív, ennek ellenére Mononucleosis diagnózissal bocsátották el. 1 évvel később ismét lázas, jó étvágy mellett fogyott, éjszakai izzadása és hőemelkedése tartós. Néhány hónappal később elhúzódó panaszok és nyirokcsomó duzzanat miatt kórházi felvétel kivizsgálás céljából. Beteg ban született nő, korábban lényeges betegsége nem volt, 5 napja gyenge, palpitáció érzése van, feje fáj. Láztalan,, enyhén icterusos, sápadt, vérzés nincs. Sürgős kórházi felvétel.

9 Beteg 1, általános kivizsgálás 2003-ban született fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat. Fennáll-e krónikus betegség (szekunder immundeficiencia)? Vérkép, máj- és vesefunkció, gyulladástápláltság, vasanyagcsere Jó általános állapotú, jól fejlett, kissé obes fiú. Status: neg. Vérkép Vvt 5 T/L, Hgb 132 g/l, HCT 0,375, MCV 75 fl Vas 15 umol/l, TVK 65 umol/l WBC 5,16 G/L, Neut 53%, Ly 33% PLT 329 G/L Máj és vesefunkció, gyulladás sgot 31 U/L, sgpt 15 U/L, Kreatinin 67 umol/l, C-reaktív fehérje 2 mg/l Megalapozott a gyanú, hogy primer immundeficiencia áll a háttérben

10 Beteg 1, immunológiai kivizsgálás Immundeficiencia gyanú miatti kivizsgálás Immunglobulin szintek, (alosztályok) Komplement aktivitás Fagocita funkció Limfocita populációk vizsgálata (citometria) Aktív immunizálás hatásának lemérése Immunglobulin szintek IgG 11,3 g/l, IgA 0 g/l, IgM 0,4 g/l Komplement funkcionális szűrőtesztek Klasszikus reakcióút aktivitás 67% Alternatív reakciót aktivitás 93% Lektin reakcióút aktivitás 4% Komplement fehérje meghatározás Komplement C3 1,28 g/l Komplement C4 0,38 g/l

11 Immunológiai méréstechnikák 1: az antigén-antitest reakció detektálása folyadék fázisban Turbidimetria: A koncentrációval arányos fényintenzitás csökkenését méri. Nefelometria: A koncentrációval arányos szórt fény intenzitását méri Ezek az eljárások kifejezetten alkalmasak egy nagyobb, fehérje természetű molekula mennyiségének meghatározására Feltétele, hogy rendelkezzünk a mérendő molekula ellen antitesttel (agglutináljon vagy precipitáljon) Az 1-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az immunglobulinok, a C-reaktív fehérje, a C3 vagy a C4 koncentráció mérése.

12 A precipitáció Érzékeny az antigén és antitest mennyiségére, pontos beállítást igényel, lényege az antitest-antigén kapcsolódási reakció után keletkező komplex (csapadék) Lehet kvalitatív vagy kvantitatív Megfelelő diffúziós közeg megválasztása után egyes esetekben szabad szemmel is látható a precipitin (Ouchterlony analízis) Fehérje festéssel, egyéb detektálási módszerekkel, standardok alkalmazásával érzékenysége növelhető: immunprecipitáció Elektroforézissel kombinálható (Immun-elfo, rakéta immunelfo, keresztezett immunelfo) A precipitáció elvén működnek a folyadék fázisú immunassay-k, melyek antigénmeghatározási módszerek: nefelometria, turbidimetria, particleenhanced-immunoturbidimetry

13 Az immunglobulinok mennyiségének változása az életkor függvényében (g/l) Immunglobulinok mennyisége g/l ,02-0,2 0,01-0,08 IgM IgA IgG ,2-0,7 0,2-1 Felnőtt: ,8-4 0,5-2 életkor

14 A komplementrendszer működésének vizsgálata funkcionális szűrőtesztekkel Birka-vörösvértest lízis mérésén alapuló eljárások CH50/ml = a beteg 1 ml szérumának azzal a részével, amely 1 ml 2%-os szenzibilizált birka vörösvérsejt szuszpenzió 50%-os hemolízisét hozza létre (72 CH50/mL= 1/72 ml szérum okozza az 50%-os lízist) Szilárdfázisú technikán alapuló eljárások (Wielisa rendszer) A csökkent működésű, vagy hiányzó komponensek A funkcionális tesztben mért aktivitás Klasszikus Lektin Alternatív C1q, C1r, C1s Alacsony Normál Normál C4, C2 Alacsony Alacsony Normál MBL, MASP2 Normál Alacsony Normál B, D, P Normál Normál Alacsony C3, C5, C6, C7, C8, C9 Alacsony Alacsony Alacsony

15 A Beteg 1 kivizsgálásának összefoglalása Jó általános állapot, megfelelő tápláltság Krónikus betegség hiánya Gyakori infekcióhajlam Primer immundeficiencia gyanú majd kivizsgálás Diagnózis: szelektív IgA hiány és komplement lektin-út (MBL) hiány Közönséges variábilis immundeficiencia (<4 g/l immunglobulin) További kivizsgálási lehetőségek primér immundeficiencia gyanú esetén Fagocita funkció vizsgálata (jelzett mikróbával vagy oxidative-burst detektálással) Limfocita populációk vizsgálata citofluorimetriával, blasztos transzformáció vizsgálata mitogénekkel vagy spec. antigénekkel) NK-sejt aktivitás vizsgálata Kemotaxis vizsgálata Oltásra (pl. pneumococcus) adott antitestválasz vizsgálata

16 2. beteg: általános kivizsgálás 1978-ban született nő, 20 éves kora óta van szem- és szájszárazsága, izületi panaszai, bőrtünetei, gyorsult süllyedése, vashiányos anémiája. 2 hete hőemelkedése és szúró mellkasi fájdalma is van, sürgős kórházi felvétel. Differenciáldiagnosztika, gyors orientálódás Sovány, sápadt, arcon bőrpír, egyéb lényeges kóros fizikális eltérés nélkül. Megalapozott a gyanú, hogy autoimmun betegség áll a háttérben Vérkép Vvt 3,1 T/L, Hgb 86 g/l, HCT 0,27 WBC 5,9 G/L, Neut 69%, Ly 28% PLT 280 G/L Máj és vesefunkció, gyulladás sgot 38 U/L, sgpt 48 U/L, Kreatinin 76 umol/l, C-reaktív fehérje 19,6 mg/l Véralvadás Prothrombin 66% (INR 1,3) Fibrin-degradációs termék (D-dimer) 10,16 ug/ml Vizeletvizsgálat proteinuria (1,7 g/24 óra) kilúgozott vvt Infekció Hemokultúra negatív

17 Beteg 2: immunológiai kivizsgálás (kivonat) Immunológiai kivizsgálás poliszisztémás autoimmun betegség gyanúja esetén Szérum elektroforézis (és immun elektroforézis) Immunglobulin szintek Autoantitestek Akut fázis fehérjék Komplement Összfehérje 80 g/l, alb. 30 g/l, gamma globulin 34 g/l Immunelfo: kóros fehérje nem mutatható ki, poliklonális immunglobulin szaporulat IgG 32,4, IgA 4,55, IgM 3,17 g/l

18 Szérum elektroforézis + - A szérum összfehérje tartalma és az egyes frakciók egymáshoz viszonyított aránya alapján kiszámolható az ALB-α1 α2 β γ frakció mennyisége. Paraprotein (kóros immunglobulin) elektroforetikus képe Denzitás

19 Immun-elektroforézis Szemikvantitatív változat (leolvasás szemmel): Betegek szérumai (elfo) + - Kvantitatív változat (leolvasás denzitométerrel): Elfo G A M κ λ Anti-humán szérum Anti-humán IgG (IgG-kappa monoklonális komponens) Anti-humán IgM Anti-humán IgD Korszerű eljárás: a szabad könnyűés nehézlánc meghatározása nefelometriával

20 Beteg 2: immunológiai kivizsgálás (kivonat) Immunológiai kivizsgálás poliszisztémás autoimmun betegség gyanúja esetén Szérum elektroforézis és immun elektroforézis Immunglobulin szintek Autoantitestek Akut fázis fehérjék Komplement Összfehérje 80 g/l, alb. 30 g/l, gamma globulin 34 g/l Immunelfo: kóros fehérje nem mutatható ki, poliklonális immunglobulin szaporulat IgG 32,4, IgA 4,55, IgM 3,17 g/l anti-nukleáris antigén (ANA) 1:160 erősen poz (homogén) Pozitív: Anti-kromatin, anti-hiszton, anti-ssb, anti-dns, anti-nucleosoma Anti-kardiolipin (ACLA), anti-beta2- gpi pozitív Anti-C1q pozitív Negatív: anti-centromer, SSA, Scl70, Jo, Sm, RNP, ANCA

21 Autoantitest kimutatás: Immunfluoreszcencia Anti-nukleáris antitestek, anti-neutrofil citoplazma antitestek stb kimutatása mikroszkópos technikával ANA (Hep2G) canca (granuláris, citoplazmatikus) panca (homogén, perinukleáris) Ez az eljárás kifejezetten alkalmas olyan autoantitestek meghatározására, amelyek egy jól meghatározható helyű/fajta sejtantigénnel reagálnak, a festődés mintázata lényeges információt hordoz. A mérés/leolvasás munkaigényes, nehezen standardizálható. Feltétele, hogy rendelkezzünk az autoantigént kifejező sejttel/szövettel és fluoreszcens jelölésű anti-humán IgG/IgA/IgM antitesttel A 2-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az ANA és ANCA meghatározás

22 Antitest kimutatási technikák 2: szilárd fázisú technikák ag jelölt anti-humán antitest beteg szérum Ez az eljárás kifejezetten alkalmas olyan autoantitestek meghatározására, melyek egy könnyen előállítható antigénnel reagálnak, a mérés kevéssé munkaigényes, jól standardizálható Feltétele, hogy rendelkezzünk a tiszta autoantigénnel és jelölt antihumán IgG/IgA/IgM antitesttel A 2-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az ANA és ANCA meghatározás kivételével az összes autoantitest meghatározás.

23 Titrálás, titer Titer: a koncentráció mérőszáma. Olyan esetekben kerül sor alkalmazására, ahol a mérendő anyag mennyisége nem fejezhető ki egyértelmű analitikai egységekben, pl. vírusmennyiség, antitest. A titer annak a legmagasabb hígítási foknak felel meg, amelyben egy reakció még pozitív. Ha a 8. lépésben pozitív utoljára a reakció, akkor a minta titere 1:256 (2-8 ). Mikrotiter lemez 3 Optikai denzitás (read-out) Titer

24 Titrálási görbék, direkt antitest ELISA (pl. anti-hbsag-igg) Optikai denzitás (490nm) Titer Sok antitest, titere 1:512 Kevés antitest, titere 1: pozitív negatív

25 Szilárd fázisú immunasssay típusok: felosztás jelölés alapján RIA: Radio (γ); a jelölés izotóp. Előnye elsősorban analitikai, hátránya a sugárzással járó veszély. Egyre inkább visszaszorul ELISA: Enzim; előnye az egyszerűség és olcsóság, hátránya elsősorban analitikai (méréshatár). FIA: Fluorochrome; Előnye analitikai, hátránya a különleges detektáló műszer és az ár. Chemiluminescens: Előnye analitikai, hátránya a luminométer szükséglet, és az ár. (Bioszenzor technológia) (Macro- és microarray technológia)

26 A 2. beteg kivizsgálásának összefoglalása Fiatal nőbeteg több hónapos típusos panaszokkal Tájékozódó vizsgálattal több, lényeges eltérésre derült fény Tüdőembólia gyanú (Glomerulo)nefritisz Anémia Gyulladásos válaszreakció, poliklonális immunglobulin szaporulat A megalapozott klinikai gyanú alapján részleges kivizsgálás történt szisztémás autoimmun betegség vonatkozásában: Immunpanel Diagnózis (típusos autoantitestek): Szisztémás lupus erythematodes (ANA, anti-dns), szekunder Sjögren sy (SSB), szekunder anti-foszfolipid sy (ACLA, anti-b2gpi), lupus nephritis (anti-c1q)

27 3. beteg: részletes kivizsgálás 1951-ben született férfi, 46 éves korában intermittáló láz, hepato-splenomegalia miatt kórházi kezelés. Hepatitis B és C szerológia negatív, EBV szerológia negatív, ennek ellenére Mononucleosis diagnózissal bocsátották el. 1 évvel később ismét lázas, jó étvágy mellett fogyott, éjszakai izzadása és hőemelkedése tartós. Néhány hónappal később elhúzódó panaszok és nyirokcsomó duzzanat miatt kórházi felvétel Kp. fejlett és táplált. Arcon és hajas fejbőrön seborrhoeás dermatitis. Testszerte összefolyó urticák. A nyak bo-án, supraclavicularisan, axillarisan, inguinalisan több kisebb fájdalmatlan, mobilis nycs., hepar elérhető, lien 1 hu majus. Megalapozott a gyanú, hogy malignus hematológiai kórkép (limfóma?) áll a háttérben Vérkép Vvt 4,1 T/L, Hgb 115 g/l, HCT 0,38 WBC 3,1 G/L, Neut 68%, Ly 21% PLT 188 G/L Máj és vesefunkció, gyulladás sgot 150 U/L, sgpt 195 U/L, Kreatinin 123 umol/l, C-reaktív fehérje 21 mg/l, We 80 mm/ó Véralvadás Prothrombin 97% (INR 1,1) Vizeletvizsgálat neg Szérum elektroforézis és immunelfó Összfehérje 84 g/l, alb 42 g/l, gamma globulin 21 g/l IgG 22,3 IgA 5,06, IgM 3,05 g/l Monoklonális fehérje nem mutatható ki Infekció Hemokultúra, HBsAg, anti-hcv negatív Epe üledék tenyésztés: Streptococcus Köpet tenyésztés: E. coli és gomba

28 Beteg 3: hematológiai kivizsgálás Kivizsgálás hematológiai malignóma irányában Perifériás vér sejtfelszíni markeranalízis Nyirokcsomó biopszia

29 Immunológiai méréstechnikák 3: Az antigén-antitest reakció detektálása a sejtfelszínen Áramlásos citofluorimetria, FACS analízis A mérés kifejezetten alkalmas a perifériás vér sejtes összetevőinek vizsgálatára, alcsoportjaik számának, aktiváltságának meghatározására A méréshez rendelkezni kell a meghatározott sejtfelszíni antigénekkel (CD) reagáló, fluoreszcens festékkel jelzett antitestekkel Előnye hogy gyors és részletgazdag képet ad, hátránya, hogy csak suspensióba vihető sejteket lehet vizsgálni

30 3. beteg: Sejtfelszíni markeranalízis, perifériás vér, limfocita kapu CD3+: 84.2% (T sejtek) CD 19+: 3.8% (B sejtek) CD5+: 79.5% CD10+/CD19+: 0.1% CD5+/CD19+: 2.3% κ+/cd 19+: 1.37% CD3+/CD4+: 2.83% (Th sejtek) λ+/cd % CD3+/CD8+: 78.9% (Tc sejtek) CD3+/CD16+: 3.92% (aktivált T sejtek) CD3-/CD16+/CD56+: 14% (NK sejtek) CD3+/CD7+: 42% CD45+: 98.7% (pan leukocyta marker) Vélemény: A kórfolyamat T sejtes eredete igazolható. A CD3+/CD8+ kettős poz. sejtek magas aránya az LGL T sejtes lymphoma fennállását valószínűsíti. CD4-FITC

31 3. beteg kivizsgálása: a nem várt fordulat A beteg abszolút T-helper száma: WBC x limfocita x CD4+/CD8-3,1 G/L x0,21 x 0,028=0,018 azaz 18/mikroliter Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben LAV (1983), avagy miről egyeztetettek Franciaország és az Egyesült Államok elnökei (1987)? Orvosi Nobel díj, 2008: Francoise Barré-Sinoussi, Luc Montagnier

32 3. beteg kivizsgálása: a nem várt fordulat A beteg abszolút T-helper száma: WBC x limfocita x CD4+/CD8-3,1 G/L x0,21 x 0,028=0,018 azaz 18/mikroliter Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (ELISA) (szenzitív szűrőteszt) Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (Western blot) (specifikus verifikáló teszt) Szérumban HIV gp24 core antigén pozitív (viraemia)

33 3. beteg kivizsgálása: a nem várt fordulat A beteg abszolút T-helper száma: WBC x limfocita x CD4+/CD8-3,1 G/L x0,21 x 0,028=0,018 azaz 18/mikroliter Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (ELISA) (szenzitív szűrőteszt) Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (Western blot) (specifikus verifikáló teszt) Szérumban HIV gp24 core antigén pozitív (viraemia) Nyirokcsomó szövettan: HIV-asszociált lymphadenopathia, kevert follicularis hyperplasia/follicularis involutiós típus (follicularis involutió dominál). Mindezek mellett paracorticalis hyperplasia figyelhető meg, kifejezett polyclonalis plasmasejtes reakcióval, feltehetően bakteriális infekcióra adott válaszreakcióként.

34 Antitest kimutatási technikák 4: Infektív szerológia, Western-blot technika Antigének szétválasztása elektroforézissel Transzfer nylon membránra Antigén+jelölt antitest reakció Kifejezetten alkalmas infekciós szerológiai vizsgálatokra, rendelkezni kell a kórokozó antigénjeivel A 3-as beteg esetében a HIV antitest teszt megerősítő vizsgálata történt ezzel a módszerrel

35 Az infektív szerológia során meghatározott izotípus (osztály) megoszlás klinikai haszna Az antitestek izotípus-megoszlásának értéke a Chlamydia pneumoniae fertőzés dinamikája példáján (vizsgálat savópárból) Akut infekció: IgM pozitivitás, IgA, IgG negatív Perzisztáló infekció: IgA, pozitív és IgG pozitív, IgM negatív, vagy ha >1:128, IgG titernövekedés lép fel Reinfekció: IgM+IgG pozitív Akut (első) Akut (reinfekció) IgM + + IgG - + IgA - - Lezajlott infekció Perzisztáló infekció - + +

36 A 3. beteg kórtörténetének összefoglalása Több hónapos anamnézis, ismeretlen eredetű láz Fizikális és laboratóriumi jelek gócbetegségre utaltak Részletes kivizsgálás több potenciális gócot (prostat, epehólyag) tárt fel Nyirokcsomó duzzanat és B tünetek miatt hematológiai malignitás gyanú, sejtfelszíni markeranalízis, szövettan Klonalitás nem igazolódott Többszörös lezajlott bakteriális infekciók jele látszódott (szekunder immundeficiencia) Véletlen lelet, csökkent T-helper sejtszám Verifikált HIV-fertőzés (AIDS)

37 4. beteg, szül: 1988 Családi és saját anamnézis negatív, gyógyszert nem szed. 5 napja gyenge, palpitáció, fejfájás. Láztalan. Vérzés nincs. Sápadt, halvány nyh., enyhe icterus, P 100/min, bőrön suffusiok. Tájékozódó vizsgálat leukémia irányában Vérkép WBC 7,16 G/L (12% Mo) RBC 1,64 T/L HGB 53 g/l HCT 0,16 MCV 95 fl MCH 32 pg MCHC 338 g/l PLT 23 G/L RDW-CV 23,2% Csv. működés? Retikulocita 296 G/L Hct-re és érési gátlásra korrigált reti. index Kémia Össz bilirubin 33,7 umol/l Indirekt bi 8,6 Crea 60 umol/l GOT 56 U/L GPT 142 U/L LDH 1714 U/L Hapltoglobin 1,1 mg/dl Perif kenet: fragmentocyta d. Coombs: neg.

38 Klinikai gyanú: hányás, hasmenés, anaemia, thrombocytopaenia, veseelégtelenség, neurológiai tünetek Klinikai diagnózis: Thrombotycus microangiopathia (TMA) Haemolyticus anaemia (Htk<30%) LDH (>450 U/l) indirekt Bi, vizelet ubg haptoglobin szabad haemoglobin fragmentocyták, schistocyták reticulocytosis d. Coombs negatív Egyéb okok kizárása Thrombocyta szám (< /l) Veseelégtelenség esetén : Hemolitikus urémiás szindróma (HUS) Neurológiai tünetek esetén: Trombotikus thrombocytopéniás purpura (TTP) Slide thanks to Dr. Kline Bolton, UVA. Thromboticus microangiopathia (TMA): Olyan veselaesio, amelyben a glomerulusokban és a kis arteriolákban hyalin thrombusok vannak Curtesy of Diana Krapman

39 A TTP keletkezésének molekuláris oka az endothel felszín prokoaguláns átalakulása az éretlen vwf megjelenése miatt, ugyanis gátló autoantitestek keletkeznek a vwf-hasító proteáz (ADAMTS13) ellen Endothel sejt Endothel sejt

40 Az antitestek kimutatása 5: Specifikus funkció gátlás Feltétele az antigén jól mérhető funkciója (pl. enzimfunkció, kofaktor aktivitás, receptor-jelátviteli aktivitás, lízis) Véralvadási ko-faktor: fibrin dugó (pl. szerzett, autoantitestesviii-as faktor hemofília) Enzim: reakciósebesség, végtermék (pl. trombotikus trombocitopéniás purpura, TTP, ADAMTS13) Komplement fehérje: molekuláris komplex kialakulása, neo-epitóp megjelenése vagy lízis (pl. herediter angioneurotikus ödéma, HANO, vagy hemolitikus urémiás szindróma, HUS) Receptor aktiválás (pl. Basedow kór, TSH receptor antitest) vagy blokkolás (Myasthenia gravis, Acetil-kolin receptor antitest) A kimutatás módja a keveréses, funkcionális vizsgálat (a beteg mintájában található antitest gátolja az egészséges minta aktivitását) Sejtes (riporter) assay Direkt vizsgálat (antigén-antitest reakció kimutatása immunassay-vel) Titrálással meghatározható az 50%-os gátlást okozó koncentráció (hagyományosan 1 Bethesda egység)

41 ADAMTS13 aktivitás mérés a 4. beteg mintájában A beteg plazmájában több plazmaferezis után is 0%-os aktivitást találtunk A keveréses vizsgálat anti-adamts13 gátló antitestek jelenlétét igazolta (14 Bethesda egység) Festék Jelfogó Festék Jelfogó Nincs ADAMTS13 aktivitás Van ADAMTS13 aktivitás ADAMTS-13 aktivitás mérés Elhasított vwf mennyisége (FRETS-vWF-73 fluoreszcencia unit 340nm/460nm) Normál plazma (100%) idő (perc) Kevert minta (NP+4. beteg, 1:1) 4. beteg

42 A 4. beteg kórtörténetének összefoglalása Fiatal nőbeteg akut, sürgősségi felvételt indokoló tünetekkel Hematológiai vizsgálat Kóros sejteket nem talált a periférián és ép csontvelőműködésre utalt Súlyos normociter anémia és fragmentociták mellett LDH emelkedés, indirekt bilirubinémia mutatkozott (hemolízis, direkt Coombs negatív) Alacsony trombocitaszám Megalapozott gyanú merült fel trombotikus mikroangiopátiára A megerősítő, specifikus, funkcionális vizsgálattal anti-adamts13 autoantitesteket lehetett kimutatni, vagyis megszületett a thrombotikus trombocitopéniás purpura (TTP, Moschcowitz szindróma) diagnózis.

43 Az előadás során bemutatott eljárások összefoglalása Turbidimetria, nefelometria, folyadékfázisú immunassayk (immunkémia), akut fázis reakció, elektroforézis, immun-elektroforézis CRP, (PCT, TnT), C3, C4, Ig Mikroszkópos autoantitestkimutatás, immuhisztokémia Anti-nukleáris faktor, anti-neutrofil citolplazma antitest Szilárd fázisú immunassay-k Autoantitest meghatározások (pl. anti-dna) Sejtfelszíni antigénkimutatás, flow-cytometria Perifériás sejtpopulációk (CD4/CD8), kóros sejtek vizsgálata Infektív szerológia (szilárd fázisú mérések, Western-blot), immunglobulin osztályok megoszlása HIV, EBV, HBsAg, HCV szerológia Funkcionális autoantitest meghatározások ADAMTS13 gátló antitest meghatározás

44 Antitestekkel kapcsolatos Nobel díjak 1901 Emil Adolf von Behring szérum terápia 1908 Ilya Ilyich Mechnikov, Paul Ehrlich immunológiai felismerés 1913 Charles Robert Richet anafilaxiás reakció 1919 Jules Bordet immunológiával kapcsolatos felfedezések 1930 Karl Landsteiner Tom, a diftéria toxinnal elsők között immunizált ló ABO vércsoport 1972 Gerald M Edelman, Rodney R Porter az ellenanyag kémiai szerkezete 1977 Rosalyn Yallow - Radio-immunoassay 1984 Niels K Jerne, Georeg JF Köhler, César Milstein immunszabályozás és a monoklonális ellenanyagok előállítása 1987 Susumu Tonegawa az ellenanyag diverzitás háttere

45 Immunológiai módszerek Medicina kiadó, 2006 Szerk: Erdei Anna 13. fejezet (Pálóczi Katalin) Gyakorlati laboratóriumi medicina Literatura Medica kiadó, 2008 Szerk: Debreczeni Lóránd, Kovács L. Gábor 9. fejezet (Sipka Sándor, Lakos Gabriella)