A csontvelői stroma aktivációja különböző onkohematológiai kórképekben

Átírás

1 EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS A csontvelői stroma aktivációja különböző onkohematológiai kórképekben Dr. Bedekovics Judit Témavezető: Dr. Méhes Gábor DEBRECENI EGYETEM KLINIKAI ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Debrecen, 2014.

2 Tartalomjegyzék 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A normál csontvelői stroma felépítése A rostszaporulat kimutatása a csontvelőben Rostszaporulat megítélése különböző csontvelőt érintő kórképekben A vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor (PDGFR) funkciója és aktivációja A vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor (PDGFR) szerepe fibrotikus kórképekben A PDGFR expresszió vizsgálatának lehetséges előnyei myelofibrosisban CÉLKITŰZÉSEK METODIKÁK Betegcsoport A crista biopsziás minták feldolgozása Az MF grádus meghatározására használt eljárás Immunhisztokémiai vizsgálatok Képalkotás a PDGFRβ expresszió mértékének objektív megítéléséhez Statisztikai feldolgozás EREDMÉNYEK A PDGFR expressziós mintázat normál csontvelői mintákon A PDGFR expresszió mintázata myelofibrosisban A PDGFRβ score és az MF grádus közötti kapcsolat A PDGFRβ expresszió myelofibrosis progresszióra gyakorolt prediktív értéke PDGFRβ expresszió mértékének objektív meghatározása digitális képanalízis segítségével A PDGFRβ expresszió mértékét tükröző numerikus paraméterek és az MF grádus kapcsolata MEGBESZÉLÉS ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY IRODALOMJEGYZÉK TÁRGYSZAVAK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS TÁMOGATÁSOK

3 1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Ang-1: angiopoietin-1 ARC: adventitialis reticularis sejt (adventitial reticular cell) AUC: area under the curve CAR: CXCL12 gazdag reticularis sejt (CXCL12 abundant reticular cell) CML: krónikus myeloid leukemia CXCR4: chemokin type receptor 4 CXCL12: chemokin c-x-c motif ligand 12 (SDF-1) DAB: diaminobenzidin ET: essentialis thrombocythemia FGF: fibroblast growth factor FN: fals negatív FP: fals pozitív HSC: hemopoeticus őssejt (hemopoetic stem cell) IPSS: international prognostic scoring system JAK: Janus kinase MDS: myelodysplasiás szindróma MF: myelofibrosis MPN: myeloproliferativ neoplasia OPN: osteopontin PDGF: platelet derived growth factor PDGFR: plateler derived growth factor receptor PMF: primer myelofibrosis PV: polycythemia vera ROI: region of interest 3

4 SCF: stem cell factor SDF-1: stromal-derived factor 1 alpha (CXCL12) SMA: smooth muscle actin TGFβ: transforming growth factor beta VCAM: vascular cell adhesion molecule VEGF: vascular endothelial growth factor VLA-4: very late antigen-4 VN: valódi negatív VP: valódi pozitív 4

5 2 BEVEZETÉS A csontvelőben található mesenchymalis sejtek aktív elemei a vérképzésnek, és dinamikusan reagálnak a csontvelőt érintő primer vagy másodlagos neoplasticus folyamatokra. A mesenchymalis sejtek expanziója és aktivációja sokszor myelofibrosissal jár 1. A myelofibrosis tehát a csontvelői stroma aktivációja különböző reaktív illetve malignus kórképekben, melynek során rostszaporulat jelenik meg 2. Habár a primer alapbetegség lehet monoklonalis, a rosttermelésért felelős mesenchymalis sejtek jelenlegi ismereteink szerint poliklonalis expanziót mutatnak. A rostszaporulat összetétele alapján beszélhetünk reticulin fibrosisról és kollagén fibrosisról. Az előbbi önállóan is előfordulhat, azonban kollagén fibrosis jellemzően reticulin szaporulat talaján jön létre, és izoláltan nem fordul elő 1. Külön megemlítendő az extracellularis mátrix szaporulat egy speciális formája a csontújdonképződés, mely jellemzően súlyos rostszaporulat mellett jelenik meg, ilyenkor az osteomyelofibrosis elnevezés használható 1. Megfigyelések szerint a klinikai relevancia szempontjából is el kell különítenünk a reticulin illetve kollagén szaporulatot. A reticulin szaporulat elméletileg reverzibilis elváltozás azonban az, hogy a folyamat visszafejlődik vagy progressziót mutat elsősorban a rostszaporulatot előidéző alapbetegség jellegétől függ. A kollagén szaporulat illetve az osteoid képződés ugyanakkor irreverzibilis elváltozások, melyek a kiváltó alapbetegség szanálódása után is fennmaradnak 1,3. A rostszaporulat lehet diffúz illetve fokális. A fokális rostszaporulat gyakran olyan folyamatokhoz társul, amelyek egyszeri, lokális károsodás kapcsán jönnek létre például osteomyelitis, irradiáció talaján kialakuló nekrózis. Ezek az eltérések a vérképző aktivitás egészét nem befolyásolják jelentősen. Diffúz rostszaporulat kialakulhat gyulladásos megbetegedésekben, mint szisztémás kötőszöveti megbetegedések, autoimmun myelofibrosis 5

6 vagy mycobacterium fertőzés. Szintén diffúz eltérés formájában jelennek meg egyes metabolikus eltérések, mint például az osteopetrosis, vagy az osteomalacia 1,3. A rutin diagnosztikában leggyakrabban malignus eltérés gyanúja miatt kerül sor csontvelői mintavételre, így a neoplasiákhoz társuló fibrosissal találkozunk a leggyakrabban. A malignus folyamatok lehetnek primer vérképző rendszeri kiindulású neoplasiák úgy, mint akut illetve krónikus myeloid leukemia, akut illetve krónikus lymphoid leukemia, myelodysplasiás szindróma, egyéb myeloproliferativ kórképek, plasmasejtes, histiocytás illetve hízósejtes folyamatok. Rostszaporulattal számolhatunk azonban akkor is, amikor a csontvelő másodlagosan infiltrált a neoplasticus sejtek által. Így létrejöhet fibrosis szolid tumorok illetve lymphomák csontvelői infiltrációja esetén is 1. A rostszaporulat jelenléte sokszor eltérő megítélés alatt áll a különböző kórképekben. Egyes folyamatokban a rostszaporulat dominálja a képet, és prognosztikai szereppel rendelkezik. Primer myelofibrosisban a reticulin és kollagén fibrosis fontos eleme a kórképnek, és független prognosztikai faktora az általános túlélésnek 4. Krónikus myeloid leukemiában a fibrosis jelenléte a diagnózis időpontjában szintén negatív prognosztikai szereppel bír, megjósolva az elégtelen terápiás választ 5. Primer myelodysplasiás szindrómában szintén gyakori elváltozás a rostszaporulat, amely amennyiben kifejezett, egy önálló klinikopathologiai entitást jelöl (MDS-F), amely agresszív kórlefolyással jár 6. Myelodysplasiás szindrómában a fibrosis jelenléte negatív prognosztikai faktora az általános túlélésnek. A csontvelőt érintő betegségek egy másik nagyobb csoportjában a mesenchymalis sejtek expanziója és a következményes myelofibrosis hatása a prognózisra nem világos 4,7. Egyes esetekben a kóros rostszaporulat segíthet elkülöníteni a neoplasticus és reaktív eltéréseket, úgy, mint például lymphoproliferativ kórképekben. Máskor a mesenchymalis sejtek aktivációja és a rosttermelés még ilyen diagnosztikus szereppel sem bír, 6

7 csupán a stroma sejtek és a neoplasticus sejtek kóros kölcsönhatására hívja fel a figyelmünket 7. A myelofibrosis diagnózisa a rutin munkában crista iliacaból származó csontvelői biopsziás anyagon, reticulin citokémiai reakció alapján történik, melyhez egy négy-fokozatú, szemi-kvantitatív grádus rendszer használatos (MF0-3) 3. Az ezüst-impregnáción alapuló festés kiválóan alkalmas a reticulin illetve a kollagén rostozat feltűntetésére, azonban nem ad információt a rosttermelő stroma sejtek számáról és aktivitásáról 3,8. Számos fibrosissal járó kórképben igazolták, hogy a rost termeléséért felelős stroma sejtek proliferációja és maga a rost termelése különböző növekedési faktorok kontrollja alatt állnak 9. Ezek közül kiemelendő a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF, platelet derived growth factor), valamint a transforming growth factor β (TGF-β). Ezen növekedési faktorok közül a PDGF a fibroblastok proliferációjában, míg a TGF-β a rosttermelés szabályozásában játszik szerepet A vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor (PDGFR) a transzmembrán tirozinkináz receptorok családjába tartozik, és két altípusa különíthető el (PDGFRα és PDGFRβ), melyek homo- vagy heterodimerek képzésére képesek Egyéb fibrotikus kórképekben történt vizsgálatok alapján a tirozin-kináz gátló szerek alkalmazása a fibroblast proliferáció gátlásán keresztül csökkentik a rostszaporulat mértékét 11,15. A doktori munka célja volt a PDGFR expressziós profiljának meghatározása normál csontvelői állományban, valamint a PDGFR expresszió és a myelofibrosis (MF) grádus közötti kapcsolat vizsgálata. További cél volt a fokozott PDGFR expresszió prediktív értékének meghatározása MF progresszió szempontjából. A tanulmány utolsó lépésében egy, a stroma aktiváció mértékét és megoszlását objektíven jelző módszer kidolgozására került sor. 7

8 3 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1 A normál csontvelői stroma felépítése A vérképző (vörös) csontvelői állomány felnőttkorban a koponyacsontokban, a csigolyákban, a bordákban, a sternumban és a medencecsontokban található. Az egyik legnagyobb szervünknek számító csontvelői állomány gazdag mesenchymalis komponensekben, melyek nem csupán mechanikus és nutricionális támogatást nyújtanak a vérképző elemek számára, hanem részt vesznek a hemopoiesis finom szabályozásában is 16. A hemopoeticus őssejtek (HSC) reciprok kölcsönhatásban állnak a csontvelői stroma különböző komponenseivel. A csontvelői homeosztázis fenntartásáért felelős stromalis mikrokörnyezet, vagy más néven niche, a növekedési faktorok, citokinek, extracelluláris mátrix, ionok olyan összetételét és gradiensét alakítja ki, amely szabályozza a hemopoeticus őssejtek osztódási aktivitását, differenciálódási készségét, mobilizációját. Egyes tanulmányok szerint a nyugvó őssejtek az osteoblastos (endostealis) nichben találhatók, míg a proliferáló őssejtek a vascularis nichben foglalnak helyet (1. Ábra) Endostealis és vascularis niche A csontvelőben kiterjedt medullaris sinus hálózat található, amely az endosteumnál lévő corticalis kapillárisoktól ered és a szisztémás vénás keringésben végződik 16. A sinusok felépítésében endothel sejtek, illetve ún. adventitialis reticularis sejtek (ARC) vesznek részt, melyeket a basalis membrán választ el egymástól. A reticularis sejtek reticulin rostokat termelnek, amelyek a reticularis sejtek nyúlványával együtt az intersinusoidalis térbe nyúlnak, 8

9 emellett ezek a sejtek kis mennyiségben az intersinusoidalis térben önállóan is előfordulhatnak A reticularis sejtek egy része CXCL12 (stromal-derived factor 1 alpha; SDF-1α) expressziót mutat, melyeket CAR (CXCL12 abundant reticular cells) sejteknek is neveznek. A CXCL12 receptorául szolgáló CXCR4 a hemopoeticus őssejtek felszínén azonosítható, és a CXCR4/CXCL12 tengely az őssejt homing egyik legfontosabb szabályozó eleme 7, Az említett sinushálózatot alkotó endothel sejtek is egyedi, specializált elemei a vasculaturának. A sinus hálózatot alkotó reticularis és endothel sejtek együttesen vesznek részt a mikrokörnyezet kialakításában. Ez az egység az ún. vascularis niche, amelyre magas oxigén és alacsony kalcium koncentráció jellemző. Itt megy végbe a HSC-k proliferációja és differenciációja 17. A csontvelői stroma másik fontos alkotóeleme a trabecularis csontgerendák bélését képző endostealis réteg. Az endosteum tartalmaz osteoblastokat, endostealis fibroblastokat, és helyenként osteoclastok is feltűnhetnek 16. Az endostealis régióban látható őssejt pool topográfiai vizsgálatokkal igazolható. Az endostealis sejtek és a HSC-ek száma között pozitív korreláció figyelhető meg. Az endostealis sejtek által termelt legfontosabb faktorok az osteopontin (OPN), angiopoietin-1 (Ang-1), membrán kötött stem cell factor (SCF) melyek a HSC sejtek nyugvó állapotban tartásának irányában hatnak Fontos megjegyezni, hogy az endostealis rétegben is kimutathatók CXCL12 termelő sejtek, valamint kisebb mennyiségben az csontgerendák közelében is láthatók sinus és kapilláris átmetszetek 19. Az endosteumban és közvetlen környezetében látható egység az ún. osteoblastos niche, amely kisebb oxigén és nagyobb kalcium koncentrációt mutat. Az itt lévő HSC sejtek nyugvó (G0) fázisban vannak 17. A két niche tehát részben eltérő felépítéssel rendelkezik, másrészt azonban a CXCL12 termelés mindkét lokalizációban kimutatható. Átfedést jelent még a vascularis és az osteoblastos mikrokörnyezet között a nestin expressziót mutató sejtek jelenléte, melyek szintén képesek CXCL12 termelésre. A nestin pozitív sejtek perivascularis lokalizációban 9

10 helyezkednek el, és funkcionális valamint morfológiai szempontból átfedést mutatnak a CAR sejtekkel. Úgy vélik, a nestin pozitív mesenchymalis sejtek a CAR sejtek primitívebb altípusát képviselik, a nestin expresszió a mesenchymalis őssejtekben megfigyelhető. 1. ábra. Hemopoeticus őssejt (HSC) niche lokalizációja a csontvelőben (Enhinger A. és mtsai, 2011) 20. A hemopoieticus őssejtek az osteoblastos és vascularis mikrokörnyezet (niche) szomszédságában mutathatók ki. Az osteoblastos niche-ben osteoblastok, osteoclastok, mesenchymalis őssejtek (MSC) és kis számban sinusok láthatók. A vascularis niche a csontgerendáktól távolabb helyezkedik el, és nagy mennyiségben tartalmaz CXCL12 termelő reticularis sejteket (CAR), itt is megfigyelhetők nestin pozitív mesenchymalis őssejtek. Bár az osteoblastos és vascularis niche fogalma széles körben ismert, jelenleg nem teljesen elfogadott elmélet. Felmerül annak a lehetősége, hogy a két kompartment nem különül el élesen egymástól, illetve egyes kutatók szerint az osteoblastos mikrokörnyezetben is az ott jelen lévő erek játsszák a fő szerepet. 10

11 3.1.2 A zsírsejtek szerepe a csontvelő felépítésében Említést kell tenni a zsírsejtekről, amelyek életkortól függően a vörös csontvelő állomány 30-70%-át képzik, valamint mennyiségük a legtöbb esetben fordított arányban áll a hemopoeticus állomány méretével 3,16. A zsírsejtek szintén aktív résztvevői a hematopoiesis finom szabályozó rendszerének, adiponectin és tumor nekrózis faktor termelésével negatív hatást gyakorolnak a HSC-poolra A csontvelői mátrix A csontvelői mesenchymalis sejtek gazdag extracellularis mátrixot termelnek, amely tartalmaz proteoglykánokat, glycosaminoglykánokat, fibronectint, tenascint, reticulint, kollagént, laminint, thrombospondint. Az extracellularis mátrixhoz számos citokin kötődhet, így az részt vesz egy citokin gradiens kialakításában, amely a különböző régiók eltérő sajátságait magyarázza. A rostok továbbá különböző adhéziós molekulákhoz kapcsolódva aktiválhatnak, vagy éppen gátolhatnak sejtfunkciókat 1,16. Korábbi vizsgálatok felmérték az egészséges egyénekből származó csontvelő biopsziás minták reticulin és kollagén rost tartalmát. A vizsgálatba bevont személyeknél kizárható volt olyan alapbetegség jelenléte, amely rostszaporulatot eredményez. Két ilyen tanulmány eredménye érhető el, melyek a kiértékelés során a Bauermeister skálát 21 használták (1. táblázat). Az eredmények alapján elmondható, hogy az egészséges populáció 20-27%-ának látható a csontvelő biopsziás mintáiban igen finom rostozat (Bauermeister 2). Ez azt jelenti, hogy a mintában azonosítható elszórtan néhány egyedülálló reticulin rost, mely mellett elszórtan kisebb gócokban reticulin rostokból álló finom hálózat is megjelenik. Ez az Európai 11

12 Konszenzus rendszerében MF-1 grádusnak felel meg (1. táblázat). A populáció mindössze 4-5%-ában lehetett ennél kifejezettebb rostszaporulatot azonosítani, azonban egyetlen esetben Módosított Bauermeister gradálási rendszer (Bauermeister, 1971; Bain et al, 2001) 0 Nincs kimutatható reticularis rostozat 1 Elszórtan láthatók izolált rost fragmentumok vagy kisebb gócokban finom rost hálózat 2 Finom rosthálózat látható diffúzan az egész mintában, nincs durva rostozat 3 Finom rosthálózat látható diffúzan az egész mintában, kisebb gócokban durva kötegekkel, kollagén szaporulat nem mutatható ki (Trichrome festés negatív) 4 Diffúz, gyakran durva rostozat kötegekkel, kollagén szaporulat kimutatható (Trichrome festés pozitív) Az Európai Konszenzus ajánlása (Thiele et al, 2005) 0 Elszórt reticulin rostozat kereszteződések nélkül, ekvivalens a normál csontvelővel 1 Laza rosthálózat számos kereszteződéssel, különösen a perivascularis régiókban 2 Diffúz és denz rosthálózat számos kereszteződéssel, kisebb gócokban rostkötegekkel és/vagy osteosclerosis jeleivel 3 Diffúz és denz rosthálózat számos kereszteződéssel, durva rostkötegekkel, kollagén szaporulattal, a folyamatot gyakran szignifikáns osteomyelofibrosis kíséri sem jelent meg kollagén szaporulat táblázat. A csontvelői rostszaporulat megítélésére használt leggyakoribb szemikvantitatív gradálási rendszerek. 3.2 A rostszaporulat kimutatása a csontvelőben A rostszaporulat kimutatása minden esetben dekalcinált, fixált, paraffinba ágyazott biopsziás mintákból történik, melyek jellemzően a crista iliacából származnak. A csontvelői aspirátum nem alkalmas a rostszaporulat kimutatására, mivel a rostozat rögzül a környező nagyobb erekhez, csontgerendákhoz, így az aspirátumban csak kisebb mennyiségben jelenhet meg. Fibroticus csontvelő esetén az aspirátum egyéb betegség kimutatására is alkalmatlan lehet, amennyiben a kinyert minta hypocellularis vagy acellularis (punctio sicca) 1,3. A myelofibrosis reprezentatív értékeléshez szükséges, ideális minta jellemzői az Európai Konszenzus alapján: A biopsziás minta minimum 1,5 cm hosszúságú, és legalább 10 12

13 intertrabecularis, reprezentatív látóteret tartalmaz. A reticulin mennyiségének megítélése csakis a vérképző állomány területén lehetséges. A csontvelő biopsziás minta gyakran tartalmaz periosteum részletet illetve egyéb lágyrészeket, melyek rostban gazdagok. Ezen részletek természetesen nem tartoznak a vérképző állományhoz 3. A biopsziás minta mechanikus stressztől való védelme a pre-analitikai fázisban szintén fontos szempont, hiszen a külső behatás következtében összenyomódott állományban a kisebb ereket illetve zsírsejteket körülvevő, valamint az egyesével elhelyezkedő finom reticulin rostok közel kerülnek egymáshoz, és azt a benyomást kelthetik, hogy a mintában fokális rostszaporulat van jelen. Ahhoz, hogy a klinikai tanulmányokban a fibrosis mértéke összehasonlítható legyen, régóta kialakult a törekvés egy egységes szemi-kvantitatív értékelési rendszer kidolgozására. Ezen score rendszerek alapja a rostszaporulat kimutatására szolgáló speciális festések kidolgozása volt. Az egyik ilyen napjainkban is használt festés a Gömöri-féle ezüst impregnáció, amely a rostokat övező glycoprotein mátrixot tünteti fel 8. Ezen festéssel a reticulin rostozat fekete vékony szálcsák formájában tűnik fel, míg a kollagén rostok világosbarna illetve sárgásbarna kötegek formájában jelennek meg. A másik gyakran használt festési eljárás a trichrome festés, amely kék színben rajzolja ki a kollagén rostokat 1,3. Bizonyos esetekben a legmagasabb grádusú rostszaporulathoz csontújdonképződés is társulhat, ennek kimutatása HE festéssel is lehetséges, nem igényel speciális eljárást. Ilyenkor a csont trabeculákhoz kisebb csipkék, tövisek formájában osteoid kapcsolódik, amely színben eltér a már calcifikált csontállománytól 1. A csontvelőben az erek adventitialis rétegében, a zsírsejtek körül normál esetben is láthatunk reticulin rostokat, így ezek a festések minőségének megítélése során belső kontrolként szolgálnak. Kollagén rostokból álló kötegek illetve csontújdonképződés normál esetben nem figyelhetők meg 1,3. 13

14 Összesen tíz szemi-kvantitatív rendszer ismert, amelyek közül a legelterjedtebb a Bauermeister scale (1971) 21, illetve az Európai Konszenzus rendszere (2005) 3. Ezen rendszerek kidolgozása primer myelofibrosisban szenvedő betegek csontvelői biopsziás mintáinak vizsgálatával valósultak meg (1. táblázat). 3.3 Rostszaporulat megítélése különböző csontvelőt érintő kórképekben Rostszaporulat számos kórképben megjelenhet, melyek közül a neoplasticus folyamatoknak van kiemelt jelentősége (2. táblázat). A különböző, a csontvelőt infiltráló Diffúz rostszaporulattal járó kórképek Primer csontvelői neoplasiák Primer myelofibrosis (PMF) Nem neoplasticus szisztémás betegségek Szekunder myelofibrosis egyéb myeloproliferativ kórképekben PV, ET, CML Primer- és szekunder myelodysplasiás szindróma MDS-F Akut myeloid leukemiák Akut lymphoid leukemiák Érett B- és T-sejtes neoplasiák Szisztémás mastocytosis Szisztémás histiocytosis A csontvelőt másodlagosan infiltráló betegségek Szolid tumormetasztázis Hodgkin- és non-hodgkin-lymphoma Primer autoimmun MF Egyéb kötőszöveti betegségek Osteopetrosis Primer és szekunder hyperparathyroidismus D-vitamin defficiencia Primer hypertrophiás osteoarthropathia Toxikus hatás primer- illetve secunder neoplasticus folyamatok más-más mértékben aktiválják a csontvelői stromát, és a stroma aktiváció eltérő klinikai relevanciával bír. 14

15 2. táblázat. Diffúz rostszaporulattal járó kórképek (Kuter DJ. és mtsai, 2007) Rostszaporulat myeloproliferativ neoplasiákban A myeloproliferativ neoplasia hemopoeticus őssejteket érintő klonális elváltozás, amely egy vagy több sejtvonal szaporulatával jár. A 2008-as WHO klasszifikáció alapján a myeloproliferativ neoplasiák két fő csoportra oszthatók, ezek a Philadelphia- kromoszóma pozitív és negatív formák. Philadelphia-kromoszóma (BCR-ABL) pozitív eltérés a krónikus myeloid leukemia. A Philadelphia-kromoszóma negatív csoportba tartoznak az essentialis thrombocythemia, polycythemia vera, primer myelofibrosis 22. A BCR/ABL negatív myeloproliferativ kórképek nagy átfedést mutatnak klinikailag, histopathologiailag illetve a JAK2 mutáció felismerése óta kijelenthetjük, hogy molekuláris szinten is 4,22. Ugyanakkor meg kell jegyezni azt, hogy a három jól ismert altípus eltérő gyakorisággal mutat transzformációt súlyos myelofibrosis illetve akut leukemia irányába 4. Polycythemia vera esetében a csontvelői vizsgálat során trilinearis hyperplasia látható a hypercellularis mintában (3. táblázat). A megakaryocyták száma emelkedett, méretük változatos, a myeloid és az erythroid vonal balra tolt 4,22. Az esetek 30%-ában fejlődik ki később súlyos myelofibrosis, amelyet post-pv fibrosisnak nevezünk, valamint az esetek 10%- a mutathat AML transzformációt 4. A post-pv-ben látható előrehaladott fibrosis előtt, a cellularis fázisban is előfordulhat reticulin szaporulat, amely igen enyhe fokú (MF-1). Ha a cellularis fázisban már jelen volt ilyen rostszaporulat, nagyobb a későbbi fibroticus transzformáció esélye. A kezdettől fibrosist mutató eseteknél nagyobb továbbá a lép mérete, illetve érdekes módon alacsonyabbnak mutatkozik a thrombotikus események száma, mely két megfigyelés között összefüggést feltételeznek. A leukemiás transzformációban azonban nincs különbség a kezdetben enyhe fibrosist mutató és a rostszaporulat nélküli esetek között

16 Polycythemia vera (PV) diagnózisa /összes major és egy minor vagy első major és két minor kritérium/ major kritériumok: hemoglobin >18,5g/dl férfiakban, >16,5g/dl nőkben; illetve egyéb bizonyíték megléte az emelkedett vörösvértest térfogatra JAK2V617F mutáció vagy más funkcionálisan hasonló mutáció, pl. JAK2 exon 2 mutáció minor kritériumok: csontvelő biopsziás mintában korhoz képest hypercellularitás és trilinearis myeloproliferatio a serum erythropoetin szint a normáltartomány alatt van endogén erythroid kolónia formáció in vitro 3. táblázat. WHO 2008-as kritériumrendszere a polycythemia vera (PV) diagnózisához. Az essentialis thrombocythemia és a primer myelofibrosis esetében is előfordulhat areaktív thrombocytosis 24. Essentialis thrombocythemiában a normocellularis vagy mérsékelten hypercellularis csontvelőben a megakaryocyták aránya emelkedett, azok laza csoportokat alkotnak. A sejtek általában a szokványosnál nagyobbak, érettek, ebben a kórképben jellemző az ún. staghorn-like megakaryocyta. A myeloid és erythroid vonal többnyire nem érintett (4. táblázat) 4,22,24. Az essentialis thrombocythemia jellemzően nem társul fibrosissal (ez az esetek kevesebb, mint 10%-ában mutatható csak ki), és a Philadelphianegatív MPN csoporton belül a legkedvezőbb kórlefolyással rendelkezik 4. A betegek átlagos túlélése nem tér el jelentősen a normál populációjáétól 25. Amennyiben essentialis thrombocythemiában kifejezett myelofibrosis jelenik meg a követés során, az eredeti diagnózis revíziója szükséges. Ebben az esetben a kezdeti eltérés a kialakult morfológiai képtől függően polycythemia vera vagy primer myelofibrosis korai formája lehetett. A jelenleg legszélesebb körben elfogadott prognózisbecslő illetve terápiás protokollok nem tartalmazzák a myelofibrosis megítélését ET-ben 24,26. 16

17 Essentialis thrombocythemia (ET) diagnózisa /mind a 4 kritériumnak teljesülnie kell/ thrombocyta szám tartósan >/ = 450 x 10 9 /L a csontvelő biopsziás mintában főként a megakaryocyta sejtvonalat érintő proliferatio, emelkedett számú, nagyméretű, érett megakaryocyták, nem jelentős neutrophil granulopoesis és erythropoesis JAK2V617F vagy más klonális marker kimutatható vagy JAK2V617F hiányában a reaktív thrombocythosis kizárható 4. táblázat. WHO 2008-as kritériumrendszere az essentialis thrombocythemia (ET) diagnózisához. Primer myelofibrosis (PMF) esetében a diagnózis egyik major kritériuma a rostszaporulat. Szinte mindig láthatunk megakaryocyta szaporulatot, és a sejtek alakja változatos, megakaryocyta atypia is megjelenhet. Emellett hypercellularis állomány, balra tolt granulocyta vonal, esetleg erythroid depletio a főbb jellemzők. Minor kritériumok a splenomegalia, anemia, magas LDH szint illetve erythroblastosis (5. táblázat) 4,22. A PV-hez hasonlóan itt is elkülöníthető egy ún. pre-fibroticus stádium. Ennek a kezdeti fázisnak több elnevezése is ismert úgy, mint krónikus megakaryocyta-granulocyta myelosis, cellularis idiopathiás myelofibrosis, cellularis primer myelofibrosis. Később, a kórlefolyás során azonban súlyos reticulin szaporulat jelenik meg, mely kollagén fibrosissal valamint ostesclerosissal társulhat. Leukemiás transzformáció mintegy 8%-ban fordul elő 4. Az International Working Group for Myelofibrosis Research and Treatment ajánlása alapján a primer myelofibrosis prognózisbecslésében széles körben elfogadott klinikai score rendszer az International Prognostic Scoring System (IPSS) amely öt klinikai paramétert vizsgál, és ez alapján négy prognosztikai csoportot különít el 27. A klinikai vizsgálatok alapján ezen prognosztikai score rendszer jó összefüggést mutat az általános túléléssel. A vizsgálatokból kiderül, hogy a primer myelofibrosis egy prognosztikailag heterogén csoport, a betegek túlélése tág határok között változik. A fibrosisnak a prognózisra gyakorolt hatását legrészletesebben ebben a kórképben vizsgálták. Ezen vizsgálatok szerint az Európai 17

18 Konszenzus grádusa független prognosztikai faktornak tekinthető az általános túlélés tekintetében 27,28. Ez alapján a myelofibrosis grádus rendszerének is van létjogosultsága az IPSS mellett, és a kettő együttes használata tűnik a legoptimálisabbnak. A primer myelofibrosis kezelésében megjelenő új lehetőségek, mint az allogén őssejt transzplantáció és a JAK-2 gátló kezelések teszik fontossá ebben a csoportban a prognózis pontos megítélését 29. Primer myelofibrosis (PMF) diagnózisa /mindhárom major és két minor kritériumnak teljesülnie kell/ major kritériumok: megakaryocyta proliferatio és atypia, melyhez reticulin vagy kollagén fibrosis társul vagy jelentős reticulin-fibrosis hiányában a megakaryocytákat érintő elváltozást csontvelői hypercellularitás kíséri, melyet főleg a granulocyta proliferatio okoz és gyakran társul csökkent erythropoesissel (prefibroticus cellularis fázis) PV, CML, MDS vagy más myeloid kórképek WHO kritériumainak nem felel meg JAK2V617F vagy más klonális markerek (MPLW515K/L) kimutathatók vagy a fent említett klonális markerek hiányában szekunder fibrosisra nincs bizonyíték minor kritériumok: leuko-erythroblastosis emelkedett serum laktát-dehidrogenáz szint anemia splenomegalia 5. táblázat. WHO 2008-as kritériumrendszere a primer myelofibrosis (PMF) diagnózisához. A primer myelofibrosis illetve polycythemia vera esetében tehát súlyos fibrosis és akár osteomyelofibrosis is előfordulhat a betegség terminális állapotában. Az előrehaladott myelofibrosis (MF-2 ill. -3) klinikai jelei az anemia, splenomegalia, leuko-erythroblastosis, tear-drop vörösvérsejtek, melyek a myeloid metaplasia tüneteinek felelnek meg 30,31. Ilyenkor a csontvelőben elszórtan maradvány hemopoeticus gócok előfordulhatnak, amelyek hypocellularis, fibroticus zónákkal keverednek. Csontújdonképződés gyakran látható. 18

19 A primer myelofibrosis komplex pathomechanismussal rendelkezik. Egyrészt a neoplasticus myeloid sejtek növekedési faktorokat termelnek (pl. PDGF, FGF, TGFβ, VEGF), melyek a stroma sejteket aktiválják, ezek pedig szintén képesek növekedési faktorok termelésre. A folyamat során az adventitialis reticularis sejtek, valamint a mesenchymalis őssejt markerekkel azonosítható sejtek száma emelkedik 2,32,33. Primer myelofibrosisban deprimált továbbá a CXCL-12/CXCR4 tengely. Ennek kapcsán egyrészt a HSC sejtek CXCR4 expressziója csökkent, másrészt a funkcionális CXCL-12 mennyisége is alacsonyabb. Mindez együttesen a HSC sejtek homingjának csökkenéséhez vezethet, amely következtében azok a keringésbe juthatnak, ez pedig hozzájárulhat az extramedullaris vérképzéshez 2,33. A myelofibrosis pathogenesisében fontos szerepet tulajdonítanak bizonyos növekedési faktoroknak, így a vérlemezke eredetű növekedési faktornak (platelet derived growth factor = PDGF) is, amely a tirozin-kináz receptor családba tartozó PDGF receptort aktiválja. A tirozin kináz gátló kezelések bevezetése óta a myelofibrosis megítélése krónikus myeloid leukemiában eltérő a többi myeloproliferativ neoplasiához képest. Az imatinib kezelés a BCR/ABL aktivitás gátlásán túl, blokkolja a PDGFRα és PDGFRβ útvonalat, valamint a TGFβ általi c-abl stimulációt is 15. Ez egy fontos szempont, hiszen a myelofibrosis az imatinib kezelés előtt a CML gyakori szövődménye volt, mely összefüggést mutatott a CML stádiumával valamint a túléléssel. Az imatinib kezelés bevezetése kapcsán azonban ezeket az összefüggéseket újra kell elemezni, mely jelenleg is folyamatban van. Az azonban már ismert, hogy az imatinib kezelés a betegek jelentős hányadában csökkenti a csontvelőben a rosttartalom mértékét, és egyes esetekben a rosttartalom a normál szintre áll vissza 5,34. Ugyanakkor meg kell jegyezni, hogy az imatinib kezelés nem jelent biztos védelmet a rostszaporulat megjelenése ellen. Megállapítható, hogy a diagnózis időpontjában kimutatott rostszaporulat az imatinib kezelés érájában is hatással van a prognózisra. CML accelerált fázisa gyakrabban fordult elő a 19

20 diagnóziskor fibrotikus esetekben, illetve a fibrosis nélküli esetekben nagyobb gyakorisággal értek el major molekuláris és komplett citogenetikai választ. Tehát igaz, hogy egyes esetekben az imatinib visszafordítja a fibrosist, a kezdetben fennálló fibrosis negatív prognosztikai hatását nem törli el 5,35. Megemlítendő ugyanakkor, hogy a myeloproliferativ neoplasiák pathogenesisében fontos szerepet tulajdonítanak bizonyos mutációk jelenlétének, melyek kimutatása része ezen kórképek diagnosztikájának. A 2008-a WHO klasszifikáció is említést tesz a JAK2 (V617F) illetve az MPL (W515) mutációkról, melyek a myeloproliferativ kórképek klonális elváltozásainak tekinthetők. A 2013-ban leírt CALR (calreticulin mutáció) szintén klonális eltérésnek bizonyult MPN-ben. A fentieken túl számos szubklonális eltérés is leírásra került (ASXL1, SRSF2, EZH2, IDH1 és IDH2), melyek szintén összefüggést mutatnak a betegség progressziójával és egyes klinikai paraméterekkel 36. Az eddigi vizsgálatok alapján elmondható, hogy a CALR mutációt hordozó beteg kórlefolyása kedvezőbb, mint a JAK2 illetve MPL mutációt hordozó betegeké, valamint megállapítható, hogy a tripla-negatív alcsoport a legkedvezőtlenebb kimenetellel társul. Az eddigi eredmények alapján felmerül, hogy a három klonális mutáció meghatározása része lehetne a prognózis meghatározásának az IPSS-ben használt klinikai paraméterek mellett. Ezt a megközelítést kliniko-molekuláris prognózisbecslésnek nevezik 36. A különböző mutációk meghatározásának azonban nem csak prognosztikai szerepe van, hanem azok terápiás célpontként is szolgálhatnak. Így például már a klinikumban is használatos JAK-2 inhibitorok, mint például a ruxolitinib - nemrégiben kerültek bevezetésre, indikációjuk a közepes illetve magas kockázatú myelofibrosis, illetve poszt-polycythemia vera és poszt-essentialis thrombocythemia myelofibrosis

21 3.3.2 Rostszaporulat myelodysplasiás szindrómában Myelodysplasiás szindrómákban a fibrosis gyakorisága 12-50% között mozog és előfordulhat enyhe (MF-1) illetve előrehaladott (MF2-3) rostszaporulat is 38. Bár enyhe rostszaporulat bármely WHO alcsoportban előfordulhat, az Európai Konszenzus ajánlása alapján a myelodysplasiás szindrómákon belül elkülöníthető az a klinikopathologiai alcsoport, amely legalább MF-2 grádusú fibrosissal társul. Az MDS-F (MDS fibrosissal) alcsoportot több sejtvonalat érintő dysplasia jellemzi, valamint gyakoribb dysmegakaryopoiesis, és a blasztszaporulat 38. Az általában agresszív lefolyású betegségben nagy a betegek transzfúziós igénye. Összességében megállapítható, hogy az előrehaladott fibrosis az IPSS-től független prognosztikai faktornak tekinthető az általános túlélésre vonatkoztatva MDS-ben 6, A fibrosis kedvezőtlen hatása valószínűleg nem a vérképző állomány csökkenésével magyarázható, hanem a fibrosis a csontvelői homeosztázis zavarát, a csontvelői mikrokörnyezet diszfunkcióját jelzi. Így a fibrosis nem a közvetlen magyarázata lehet a kedvezőtlen kórlefolyásnak, hanem egyfajta indikátora annak 6. Jelenleg az MDS-ben használt két klinikai prognózisbecslő rendszer közül sem az IPSS, sem pedig a WHO klasszifikáción alapuló score rendszer sem tartalmazza a fibrosis megítélését Rostszaporulat akut leukemiákban Az akut myeloid leukemiáknak két alcsoportja ismert, amely kifejezett rostszaporulattal járhat: az akut panmyelosis myelofibrosissal, illetve az akut megakaryoblastos leukemia. Mindkét betegség igen ritka, és jellemző rájuk a dysplasticus dwarf megakaryocyták jelenléte hypolobulált sejtmaggal. Egyes elképzelések szerint a kóros megakaryocyták citokin 21

22 termelésének hatására jelenik meg rostszaporulat a csontvelőben 42. Rostszaporulat azonban egyéb leukemia típusokban is előfordulhat enyhébb formában, és az a mikrokörnyezet zavarára utal. Akut leukemiákban a neoplasticus sejtek a hemopoeticus progenitor sejtek számára fiziológiás mikrokörnyezetet modulálják, és használják fel progressziójuk során. Ennek alapján egyes újabb terápiás beavatkozások a CXCL12/CXCR4 tengelyt, integrineket és az angiogenesist célozzák Rostszaporulat hajas sejtes leukemiában és egyéb lymphoproliferativ kórképekben Bár számos lymphoproliferativ kórkép társul stroma reakcióval és így fibrosissal, a rostszaporulat szempontjából kiemelt jelentőséggel bír a hajas sejtes leukemia klasszikus formája. Ez a krónikus lymphoproliferativ kórkép, mono- vagy pancythopeniával illetve splenomegaliával jelentkezik és jellemző rá a szignifikáns rostszaporulat jelenléte, valamint a következményes punctio sicca 43. E miatt a jellegzetesség miatt a hajas sejtes leukemia neoplasticus sejtjei és a csontvelői mesenchymalis sejtek kapcsolata részletesen tanulmányozott. A CXCR4 illetve VLA-4 molekulák fontos szerepet játszanak a hemopoeticus őssejtek migrációjában, adhesiójában és retentiójában. A neoplasticus B-sejtek ezen kapukat használják arra, hogy elfoglalják azon fészkeket vagy mikrokörnyezeteket, amelyek normál körülmények között a hemopoeticus őssejtek védelmét és szabályozását szolgálják. Mindez úgy lehetséges, hogy a neoplasticus őssejtek is rendelkeznek ezen receptorokkal (CXCR4, VLA-4), melyek ligandjait a mesenchymalis sejtek termelik (CXCL- 12 valamint VCAM-1 és fibronectin). Ezt a kapcsolatot részben felelőssé teszik a kóros sejtek terápia rezisztenciájáért is 44. A hajas sejtes leukemia mellett egyéb lymphoproliferativ kórképekre is jellemző az, hogy csontvelői infiltrációt okoznak. Érdekes jelenség az, hogy egyes kórképek interstitialis, mások 22

23 nodularis míg ismét mások paratrabecularis megoszlást mutatnak. Ez a különböző neoplasticus sejtek szelektív homing mechanizmusával magyarázható. A homing után a neoplasticus sejtek kórosan befolyásolják a stromalis mikrokörnyezet összetételét, így létrehozva a neoplasticus niche-t. Ez általában az erek proliferációjával, az adhéziós molekulák expressziós profiljának változásával jár. Egyes esetekben a folyamathoz fibroblast szaporulat és reticulin fibrosis is társul. A rostszaporulat a kivételes esetektől eltekintve mint hajas sejtes leukemia általában nem jelentős, azonban jelenléte segíthet a reaktív és neoplasticus lymphoid infiltrátum elkülönítésében 7, Rostszaporulat szolid tumor metastasisban Számos szolid tumor érintheti a csontvelőt, amelyet a csont metastasis előfutárának is tartanak 1. Előfordulhatnak disszeminált tumor sejtek egyesével vagy kisebb csoportokban a csontvelői mikrokörnyezetben, illetve megjelenhet klinikailag releváns metastasis is. A lymphoproliferativ neoplasiákhoz hasonló módon, a szolid daganatok tumor sejtjei a hemopoieticus őssejtek belépési pontjait és speciális szupportív környezetét használják ki a csontvelőbe való bejutáshoz és a további invázióhoz, amit parasitismusnak is nevezhetünk. A kóros citokin expressziós profil itt is egy neoplasticus niche kialakulásához vezet, amely azonban általában jelentősebb ér- és fibroblast proliferációval társul, amely jelentős reticulin fibrosist vonhat maga után A vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor (PDGFR) funkciója és aktivációja A vérlemezke eredetű növekedési faktornak két fő alegysége ismert, a PDGF A és a PDGF B, melyek diszulfid-híddal összekapcsolt homo-és heterodimer alkotására képesek, és 23

24 a PDGF/VEGF család tagját képezik. Összességében elmondható, hogy két gén által kódolt három funkcionálisan aktív fehérjét különíthetünk el 14. A növekedési faktort először thrombocyták α-granulumjaiból izolálták, azonban később ismeretessé vált, hogy számos sejttípus képes ezek szintézisére (6. táblázat). Sejttípus PDGF-A PDGF-B Fibroblast + + Keratinocyta + + Cytotrophoblast + + Leydig-sejt + + Glomerularis mesangialis sejt + + Skeletalis myoblast + Vascularis simaizomsejt + + Astrocyták + Neuronok + + Schwann-sejtek + + Oocyták, blastocysta sejtek + Endometrialis/myometrialis sejtek + + Epithelialis sejtek + + Retina pigment epithel sejtek + + Macrophagok + + Thrombocyták/megakaryocyták táblázat. Vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) A- és B- alegység termelésére képes sejttípusok (Heldin CH és mtsai., 1999) 12. A legtöbb sejt mind a két fő alegység termelésére képes. Újabb kutatások alapján két további alegység is leírásra került, melyek a PDGF C és a PDGF D elnevezést kapták 12,13. A PDGF expresszió spatio-temporalis szabályozás alatt áll, szintje bizonyos fiziológiás és patológiás stimulusok hatására változik 14. A növekedési faktor poszt-transzlációs módosítása során a C-terminális vég lehasítására kerül sor, amely a fehérje mátrix-komponensekhez való kötődésének affinitását csökkenti, így az távolabbi szövetrészletekbe jutva fejtheti ki hatását. A mátrix és növekedési faktorok közötti kapcsolat egyenetlen térbeli elrendeződés, gradiens kialakítását teszi lehetővé, amely befolyásolja a növekedési faktor hatását 12,14. Bár normál 24

25 körülmények között a PDGF parakrin hatással rendelkezik, bizonyos tumoros folyamatokban ismert autokrin szabályozó körök kialakulása is 14. A vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor az enzimaktivitáshoz kapcsolt receptorok, azon belül a tirozin kináz receptorok közé tartozik. A PDGFR-nek két altípusa ismert, melyek a PDGFRα és a PDGFRβ, ezek szintén homo-és heterodimer kialakítására képesek. A dimerként funkcionáló PDGF fehérjék két receptor alegységet kötnek meg egy időben, melyek így hozzák lére a fentebb említett receptor dimereket In vitro a PDGFRα mind a PDGF A, mind pedig a PDGF B fehérjéket nagy affinitással köti meg, míg a PDGFRβ receptor csak a PDGF B iránt mutat nagy affinitást. In vivo a PDGF A homodimer a PDGFRα, míg a PDGF B homodimer a PDGFRβ receptorhoz kötődik, míg a PDGF AB illetve PDGFRαβ heterodimer szerepe és affinitása nem tisztázott (2. ábra) 14. A különböző receptor dimerek átfedő jelátviteli útvonalak beindítására képesek, melyek közül kiemelt a mitogén szerep, az aktin reorganizáció, és a kemotaxis. Mind az α- mind a β homodimerek mitogén hatással rendelkeznek, illetve részt vesznek az aktin reorganizációban. A β-homodimerek aktivációja kemotaktikus hatással rendelkezik, azonban az α- homodimerek esetében ez sejttípus függő funkció. Fibroblastokon és a simaizom sejteken a kemotaxis gátlása figyelhető meg Mivel az α-és β homodimerek valamelyest eltérő funkcióval rendelkeznek, egy adott sejt PDGF ligandra adott válasza függ a sejt PDGFR expressziós profiljától 14. Eddigi megfigyelések alapján elmondható, hogy a PDGFR különböző típusú mesenchymalis sejteken figyelhető meg. PDGFRα expressziót írtak le pulmonalis, dermalis, intestinalis lokalizációjú mesenchymalis progenitor sejteken és oligodendroglia progenitor sejteken, míg PDGFRβ expresszió jellemzi a vascularis simaizom sejteket (vsmc), illetve a pericytákat 12. A szabályozási rendszerhez hozzátartozik az a megfigyelés is, miszerint egy adott sejttípus különböző interleukinek, citokinek hatására képesek megváltoztatni PDGFR profiljukat 12,14. 25

26 2. ábra. PDGF-PDGFR PDGFR interakció in vitro és in vivo (Andrae J. és mtsai., 2008)14.Az ábra felső része a sejtkultúrákon igazolt ligand-receptor ligand receptor interakciót jelzi, a szaggatott vonal a gyenge kapcsolatot mutatja. Az alsó panel az emlősökben eml már in vivo is igazolt kapcsolatokat írja le. A PDGFR tehát enzimaktivitáshoz kapcsolt receptorok családjába tartozik, tartozi melyek két fő doménbőll álló transzmembrán fehérjék. Ligandkötő részük a sejtmembrán külső küls felszínén helyezkedik el, míg citoplazmatikus alegységük alegység enzimekkel alkot komplexet. A ligand kötődésére désére adott válasz általában lassan alakul ki, melynek az a magyarázata, hogy olyan intracelluláris jelátviteli útvonalak aktiválódnak, melyek a génexpressziós mintázat mintáz változását eredményezik. 26

27 A tirozin kináz receptor alegységek a ligand kötődését követően dimerizációt mutatnak, amelyet autofoszforiláció követ. Az autofoszforiláció során a foszforilált tirozin oldalláncok intracelluláris jelátviteli útvonalak kötőhelyéül szolgálnak. A PDGFR aktiváció ily módon képes aktiválni a mitogén-aktivált protein kináz (MAPK) kaszkádot, amely a c-jun, c-fos és c-myc aktiválásán keresztül sejtosztódásért felelős fehérjék átírását idézi elő. A PDGFR aktivációjának hatására szintén aktiválódik a foszfolipáz-c (PLC), amely jelátviteli útvonal végén a BAD fehérje inaktiválásán keresztül a bcl-2 antiapoptotikus faktor felszabadul a gátlás alól, amely a sejtek túlélését segíti elő. Megemlítendő továbbá a PI3K útvonal aktiválása, amely eredményeként aktin reorganizáció megy végbe (3. Ábra) 12,13, ábra. Vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor (PDGFR) aktivációjához köthető jelátviteli útvonalak (Schermuly R.T. és mtsai., 2011) 47. A PDGFR aktiváció hatására elindul a MAPK kaszkád, aktiválódik a PI3K és a PLC útvonal, melyek eredőjeként proliferáció, apoptózis gátlás, aktin reorganizáció és így migráció jön létre. 27

28 A PDGFR-hoz köthető jelátviteli útvonal gátlására több módszert is kidolgoztak, melyek közül a legoptimálisabbnak a tirozin kináz aktivitás gátlása bizonyult. A tirozin-kináz gátlók a kináz domén ATP-kötőhelyéhez kapcsolódva fejtik ki hatásukat. Jelenleg az imatinib mezilát (imatinib, ST1571, Gleevec) a legelterjedtebb tirozin kináz gátló, amely egyaránt blokkolja a PDGFRα, a PDGFRβ, a bcr-abl fúziós fehérje, a c-kit és az Flt3 aktivitását 14,15. Az imatinib a klinikumban is használatos Philadelphia-kromoszóma pozitív krónikus myeloid leukémia, gastrointestinalis stroma tumor esetében, valamint PDGFR gén transzlokációt hordozó kórképekben. A PDGFR aktivációja az embriogenesisben és az organogenesisben is szerepet játszik. A PDGFRα szerepét leírták a gastrulatioban illetve a velőcső kialakulásában, valamint főként az oligodendroglia sejtek migrációjában. A PDGFRβ-nak pedig főként a cardiovascularis rendszer fejlődésében van szerepe a pericyták migrációjának szabályozása révén. Az organogenesisben is megoszlik a két receptor típus szerepe. A PDGFRα az oligodendrogenesis mellett szerepet játszik a tüdő alveolus hálózatának, a bél boholyrendszerének fejlődésében, illetve a haj morfogenesisében. A PDGFRβ szerepét pedig az angiogenesisében és a glomerulogenesisben hangsúlyozzák. Az angiogenesis során az endothelsejtek által termelt és az újdonképződő erek lefűződéseiben nagy koncentrációban jelen lévő PDGF BB hatására a pericyták és egyéb érfal progenitor sejtek proliferálnak és migrálnak a megfelelő lokalizációba 14,50. Bár a PDGF a VEGF családba tartozó növekedési faktor, és a VEGF szerepét már leírták a hematopoiesisben, a PDGF szerepe egyelőre nem tisztázott. A PDGF BB és PDGFRβ knock-out egerek esetében megfigyelhető volt a hematopoiesis zavara, azonban ezen egerek őssejtjei letális irradiáción átesett egerekbe injektálva képesek voltak normál vérképző aktivitásra, amely arra utal, hogy a PDGFRβ jelátviteli útvonal zavara 28

29 másodlagosan, a vascularis defektusok, illetve a PDGFRβ expressziót mutató hemangioprekurzor sejtek zavarán keresztül képes befolyásolni a vérképzést A vérlemezke eredetű növekedési faktor receptor (PDGFR) szerepe fibrotikus kórképekben Több olyan betegség is ismeretes, amely összefüggésbe hozható a PDGFR jelátviteli útvonallal. Olykor a PDGFR-t érintő genetikai defektus minden esetben azonosítható az adott kórképben, míg más esetekben ilyen genetikai eltérés nem azonosítható, azonban a jelátviteli útvonal és a kórkép közötti kapcsolat farmakológiai úton bizonyítható 9. A fibroticus kórképekről általánosságban elmondható, hogy fibroblastok proliferációja és extracellularis mátrix termelése jelenik meg. A PDGFR útvonal aktivációja leginkább az első lépésben játszik szerepet, míg a rost termelése a már felszaporodott fibroblastokon TGFβ hatására jön létre. Az így kifejlődő stroma sejt szaporulat és mátrix depositio hatására progresszív hegesedés jön létre, amely az adott szerv funkciójának károsodásához vezet. A fibroticus folyamatok esetében a PDGF termelése leginkább a gyulladásos sejtekhez, macrophagokhoz köthető, amelyek egyúttal olyan citokineket is termelnek, amely a PDGFR fokozott expressziójához vezet 9,47. Tüdőfibrosis esetében az alveolaris falban, az erek illetve a bronchusok falában lévő myofibroblastok proliferációját írták le. Ebben a kórképben az emelkedett PDGF szint mérhető a bronchoalveolaris lavage-ban, amely forrásaként a macrophagok jelölhetők meg. A gyulladásos mediátorok hatására fokozódik PDGFRα expresszió, azonban a PDGFRβ expresszió nem változik 9. Állatmodellekben a tirozin kináz inhibítorok alkalmazása csökkentette a fibrosis mértékét, és növelte a túlélést 51,52. Az idiopathiás tüdőfibrosisban végzett nemzetközi tanulmány során a tirozin kináz gátlók alkalmazásával csökkent a FVC romlása és a progresszió mértéke

30 Májfibrosis esetén a perisinusoidalis stellate sejtek proliferációja figyelhető meg, melyek PDGFRβ expressziója csupán fibrosis esetén mutatható ki. Állatmodellekben a perisinusoidalis, periportalis térben emelkedett PDGF DD szint volt kimutatható, melynek forrásaként a Kuppfer sejteket tartják 9,54,55. Állatmodellen az imatinibe-mesylate csökkentette a fibrosis kialakulásának esélyét 56, azonban a szer hatása előrehaladott esetben kérdéses 57. Humán alkalmazásban összefoglaló tanulmány még nem készült. Scleroderma esetében mind a PDGF, mind pedig a PDGFR fokozott expressziója kimutatható volt a bőrben. A PDGFRβ pozitív rosttermelő sejtek scleroderma és hegképződés esetén is valószínűleg a perivascularis sejtekből erednek. A sclerodermában megfigyelhető fibroblastok fokozott PDGFRα expressziót is mutatnak és autokrin PDGF aktivációra is képesek. A fokozott PDGFRα expressziót a TGF-β hatásnak tulajdonítják 9,58,59. Scleroderma esetében PDGFR foszforilációt előidéző PDGFR-autoantitestek voltak azonosíthatók. Bár kisebb tanulmányok, és esetismertetések felvetették a tirozin kináz gátló kezelés szerepét 60, a scleroderma terápiájában, az első kiterjedt study nem erősítette meg ennek pozitív hatását előrehaladott esetekben 61. Nephrosclerosis számos kórkép talaján létrejöhet és lehet glomerularis illetve tubulointerstitialis eredetű. Glomerularis fibrosis esetében fokozott PDGFRβ expresszió volt kimutatható. Állatmodellek esetében a PDGFR jelátviteli útvonal gátlása a mesangialis sejtek proliferációjához és a mátrix depositio csökkenéséhez vezet. Valamennyi PDGF ligand szintje emelkedett a glomerularis fibrosisban, azonban a növekedési faktor forrása jelenleg nem tisztázott 9. Állatmodellekben a tirozin kináz inhibítorok kedvező hatással voltak a krónikus glomerularis betegségekre 62, azonban humán vonatkozásban jelenleg nem érhető el tanulmány a témában. Myelofibrosisban emelkedett szérum PDGF szint volt azonosítható, valamint emelkedett növekedési faktor mrns szintet igazoltak 9,32,63,64. A csontvelő 30

31 immunhisztokémiai vizsgálatára, a rosttermelő sejtek azonosítására ugyanakkor ezidáig nem került sor. A tirozin kináz gátló kezelés alkalmazásáról fibrosissal társuló CML-es esetekből állnak rendelkezésre eredmények A PDGFR expresszió vizsgálatának lehetséges előnyei myelofibrosisban A stroma sejtek vizsgálata a rostszaporulat mértékének meghatározásával szemben több lehetséges előnyt rejt, melyek vizsgálatára eddig nem került sor. A PDGFR kimutatására szolgáló immunhisztokémiai eljárás standard jelölődést mutat, a kémiai reakción alapuló ezüst-impregnációval szemben. A normál csontvelői stroma PDGFR expressziójának vizsgálatával negatív és pozitív belső kontrollok határozhatók meg, melyek növelik a kiértékelés megbízhatóságát. A már megtermelt rostozattal ellentétben a rosttermelő stroma sejtek száma egy dinamikusabb, a környező faktorokra gyorsabb változást mutató paraméter lehet. A rostszaporulat pathogenesisének ismeretéből arra következtethetünk, hogy a stromasejtek proliferációja a myelofibrosis megjelenésének prediktív mutatója lehet azokban a kórképekben, amelyekben az irodalmi adatok alapján a rostszaporulat prognosztikai szereppel bír. Az immunhisztokémia módszerrel járó festődési sajátosságok lehetővé teszik a pozitív és negatív jelölődést mutató területek éles elkülönítését, amely digitális képanalízisen alapuló objektív vizsgálómódszerhez ad lehetőséget. A szubjektív sajátságokkal is rendelkező, szemi-kvantitatív grádus rendszerrel szemben a digitális képanalízis használatával megadott numerikus paraméterek követéses esetek precíz összehasonlítására adnak lehetőséget, amely elsősorban az anti-fibrotikus terápiás eljárások hatásának mérésére lehetne alkalmas. A PDGFR expresszió kimutatása egyben terápiás célpont azonosítását is jelöli a tirozin-kináz gátló szerek érájában. 31