Immunológiai módszerek (szemináriumi gyakorlat) 2018/2019 II. Félév

Átírás

1 Immunológiai módszerek (szemináriumi gyakorlat) 2018/2019 II. Félév Kísérleti állatok tartása, kezelése, az állatkísérletek szabályai Az állatok immunizálása Az antigének általános jellemzése Adjuvánsok alkalmazása Állatmodellek Előadó: Dr. Kövesdi Dorottya

2

3

4

5

6

7

8

9

10 Állatvédelmi szervezeti egységek: Munkahelyi állatjóléti bizottság, MÁB Állatkísérleti Tudományos Etikai Tanács (ÁTET) A tudományos célból felhasznált állatok védelmét és jólétét érintő kérdések megtárgyalása, valamint a terület széles körű társadalmi, tudományos és szakmai megalapozása érdekében a Kormány 1465/2013. (VII. 24.) számú határozatában létrehozta az Állatkísérleti Tudományos Etikai Tanácsot. Nemzeti Élelmiszerlánc-biztonsági Hivatal (NÉBIH)

11 A 3R elv (Russel and Burch: The principles of humane experimental technique 1959.) alkalmazása!!! 1. Replacement Állati sejtvonalak Állat sejtek, szövetek, szervek Vágóhídról származó szövetek, szervek Gerinctelenek Kétéltűek lárva alakjai 2. Reduction A kísérleti módszerek, statisztikai analízis javítása Az adatok, eredmények megosztása Modern képalkotó eljárások felhasználása 3. Refinement Non-invazív technika alkalmazása Megfelelő anaesthesia és analgesia Állatok felkészítése a beavatkozásra Megfelelő körülmények megteremtése

12 A kísérleti állatok tartása

13

14 Immunizálás Az immunizáció a fertőző betegségekkel szembeni védetté (immunissá) tétel pl. védőoltások segítségével. A fertőző betegségek megelőzése a világon mindenhol fontos cél, megfelelő oltási renddel, oltási naptárral a kötelező és ajánlott védőoltásokra, oltóanyagokra vonatkozó szabályozásokkal.

15 Az antigén (hordozó és haptén komplexe) többféle specificitású ellenanyag képződését indukálja Számos B-sejt klón aktiválódik, eltérő specificitású ellenanyagok keletkeznek Poliklonális immunválasz Az antigének hordozóból (karrier) és antigén-determinánsokból (epitóp) állnak.

16 Oltóanyagok, vakcinák az antigén mellett adjuvánst is tartalmaznak

17 Specol Specol adjuvant is water in purified mineral oil. It induces an immune response comparable to Freund's adjuvant while producing fewer toxic effects. Ribi adjuvant system Ribi adjuvants are oil-in-water emulsions. The antigen is mixed with metabolizable oil (squalene), which is emulsified in a saline solution containing Tween 80. Ribi also contains refined mycobacterial product that acts as immunostimulants and a gram negative bacterial product monophosphoryl lipid A. Ribi interacts with membranes of immune cells resulting in cytokine induction that enhances antigen uptake, processing and presentation. Titermax Titermax adjuvants are less toxic and contain no biological materials. They are based on mixtures of surfactant acting, linear, blocks or chains of non-ionic copolymers polyoxypropylene (POP) and polyoxyethylene (POE). Its properties induce chemotaxis, complement activation and antibody production. Aluminum salt adjuvants are used with antigens: As aluminum-precipitated vaccines As aluminum-adsorbed vaccines Al(OH) can be used to adsorb proteins in a ratio of g protein/mg aluminum hydroxide. They are generally weaker adjuvants than emulsion adjuvants. However, they induce a mild inflammatory response. For safety reasons and for efficacy of generating memory cells, they are the primary adjuvants utilized in human vaccinations. Freund's complete adjuvant (FCA) FCA is a water-in-oil emulsion that localizes antigen for slow release within the immunized host for up to six months. It contains mineral oil, the surfactant mannide monoleate and heat killed Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium butyricum or their extracts (for aggregation of macrophages at the inoculation site). FCA stimulates both cell mediated and humoral immunity and preferentially induces antibodies against epitopes on denatured proteins. The disadvantage of this adjuvant is that it can produce some immunologically toxic effects, due to the non-metabolizable mineral oil. Additionally, the mycobacterial elements can create severe granulomatous reactions. For this reason, it is mainly used on laboratory animals. Freund's incomplete adjuvant (FIA) FIA has the same formulation as FCA but does not contain mycobacterium or its components. For this reason it is less effective than FCA in inducing high antibody titers but it is much less toxic.

18 Laboratóriumi kisállatok immunizálási módjai

19 Immunkompetens sejtek izolálása egerek szerveiből, szöveteiből (Primer sejtek) Csontvelő Lép Nyirokcsomók Tímusz Hasüreg Vér (vérplazma+ alakos elemek) eritrociták, trombociták leukociták Granulociták (neutrophil, bazofil, eozinofil) Limfociták (T, B) Monociták

20 Az egér nyirokszervei

21 Szervek, szövetek dezintegrálása, homogenizálása vvs eltávolítása Elkülönítés pl. sűrűség gradiens centrifugálással, MACS, FACS sort Sejtek festése, számolás Életképesség vizsgálat: pl. Tripán kék festés (elpusztult sejt kék) Morfológiai jellemzés magfestéssel: pl. kristályibolya festés

22 Várható sejthozam

23 Szérum minták vétele kisállatokból Szérum minták tesztelése ELISA módszerrel, antigen-specifikus ellenanyag válaszra a CIA során

24

25 Néhány egértörzs genetikai jellemzői

26 Állatmodellek és alkalmazásuk előnyei A kísérleti állatok általában szabadon keresztezhetőek. Az emberrel szemben itt lehetőségünk nyílik több generáción keresztül a genetikai háttér és a fenotípus közötti összefüggéseket vizsgálni. Különböző egértörzsek állnak rendelkezésre, amelyek fenotípusban (pl. betegségre való hajlamban) különböznek egymástól. Embereken nyilvánvaló etikai okokból csak nagyon korlátozottan lehet kísérletezni. Állatokkal ez szélesebb körben (engedélyhez kötötten!!!) megtehető. Az állatokból sokkal könnyebb szövetekhez jutni (pl. tüdő, agy stb.), és pl. génexpressziós vizsgálatokat végezni, könnyebb, pontosabb a betegségek diagnózisa. Rengeteg állatspecifikus reagens, anyag áll már rendelkezésünkre, pl. egérspecifikus ellenanyagok, genetikai próbák. Ismert már több állat géntérképe. Legtöbb betegségünkre kidolgozható állatmodell, amely segítségével részletesen vizsgálható a betegségek molekuláris háttere. Genetikailag módosított állatok lehetősége. Forrás: Genetika és genomika Falus András, László Valéria, Tóth Sára, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba (2014)

27 Állatmodellek és alkalmazásuk hátrányai Ha génszinten kicsi is a különbség pl. ember és egér között, genomszinten nagyobb. A vizsgálatok során kiderült, hogy egyes folyamatok egerekben teljesen máshogy működhetnek, mint emberben. Ebből az következik, hogy az egéren kapott eredmények csak kiinduló-pontok lehetnek, ha emberre akarunk következtetni. Ezután még az összefüggéseket emberben is meg kell erősíteni. Hasonló a helyzet a betegségeknél is. Sok betegség nem modellezhető tökéletesen egérben, mások a vezető patomechanizmusok, sokszor pont a legfontosabb tünetek különböznek, vagy egyes gének hiányai emberben igen, egérben nem okoznak betegséget, vagy fordítva. Egyes, a betegségben az emberben jelentős gének az egérben más sejtekben, vagy szövetekben expresszálódnak, más a funkciójuk. Például az inzulinrezisztenciát fokozó hatású, így a 2-es típusú cukorbetegségben fontos resistin gén egérben főleg a zsírsejtekben, emberben a makrofágokban expresszálódik. Forrás: Genetika és genomika Falus András, László Valéria, Tóth Sára, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba (2014)

28 Kísérletes egérmodellek Immunhiányos egerek (spontán génmutációk következtében egyes emberi immunhiányos kórképekhez hasonló tünetek alakulnak ki), ilyenek pl: Nude egerek: (meztelen egerek) beltenyésztett egerek, melyekben homozigóta géndefektus következtében tímuszhiány, súlyos T-sejt-deficiencia, a sejtközvetített immunválasz hiánya és szőrtelenség alakul ki. A human Di-George szindróma modellállata. Scid egerek: A SCID (severe combined immunodeficieny) egerekben a DNS-javító gén mutációja nem teszi lehetővé a V(D)J rekombinációt, és ez az érett limfociták hiányát okozza. Rag-deficiens egerek: A rag gének hiánya miatt nincsenek érett T és B sejtek xid egerek: A Btk (Bruton s tyrosine kinase) PH-doménjében bekövetkezett mutáció következménye az IgG3 és az IgM alacsony szintje és a TI (Thymus Independent) 2 típusú antigénekre való válaszképtelenség. MLR lpr egerek: a Fas mutációja okozza az ALPS-hez (Autoimmune LymphoProliferative Syndrome) hasonló limfoproliferatív kórképet. Genetikailag módosított egerek Autoimmun egérmodellek

29 Genetikailag módosított állatok I. Knockout vagy KO állat ahol pl. az egér egy génjét (vagy esetleg a genom egy funkcionális egységét) valamilyen módszerrel inaktívvá teszik. KO állatok segítségével vizsgálni lehet, hogy egy gén hiányának milyen fenotípusos jegyei vannak, így a gén funkciójáról jóval többet megtudhatunk, mintha csak in vitro körülmények között tanulmányoznánk. Az ismert gének többségéről már kapható KO egér, illetve meg is rendelhetünk cégektől ilyen egereket. Így derült ki pl., hogy az APOA5 gén hiánya magas szérumtriglicerid-szintet okoz. Egy másik lehetőség, hogy gén-ko segítségével elő lehet állítani az egéren valamilyen betegséget. Pl. ismert, hogy a vad egéren nem alakul ki atherosclerosis. Azonban, ha az LDL-receptor (LDLR), vagy az APOE génjüket kiütjük, és megfelelő, ún. Western-típusú diétával etetjük őket, az emberéhez igen hasonló atherosclerotikus léziók alakulnak ki az ereik falában. Forrás: Genetika és genomika Falus András, László Valéria, Tóth Sára, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba (2014)

30

31 Genetikailag módosított állatok II. Transzgenikus állatok Ebben az esetben, egyes gének működését felerősítik, túlexpresszáltatják. Ennek végső céljai ugyanazok, mint a KO egérnél leírtak. Mindkét technikát lehet szövetspecifikusan alkalmazni. Pl. transzgenikus esetben a gént egy olyan gén promótere után illesztjük be, ami csak az egyik szövetben expresszálódik. Pl. a SCGB1A1, korábban CC16 gén főleg a tüdőben expresszálódik, ott viszont nagyon erősen. Amikor egérbe az IL5 génjét rakták mögé, az IL5 a tüdőben mutatott igen erős expressziót, és az állatban tüdőeozinofília és asztma alakult ki. Ezzel bizonyították, hogy az IL-5 citokin az eozinofílek működésében fontos szerepet játszik, és a tüdőeozinofília közvetlenül asztmát okozhat. Forrás: Genetika és genomika Falus András, László Valéria, Tóth Sára, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba (2014) Parsell, D.L., Fluorescent Mice Herald Gene Transfer Breakthrough.11 Jan National Geographic. Web. 13 April 2013 Transgenic mice expressing green fluorescent protein, which glows green under blue light. The central mouse is wild-type (Wikipedia).

32 Kondicionális KO állatok Genetikailag módosított állatok III. Sokáig problémát okozott az életfontosságú gének tanulmányozása, hiszen azok hiánya vagy esetleg túlexpressziója magzati korban letális. Ezért fejlesztették ki pl. a Cre-lox-rekombináció segítségével az olyan KO állatokat, ahol pl. valamilyen indukció (pl. antibiotikumetetés) segítségével időzítetten lehet in vivo kivágni a kérdéses gént vagy genomszakaszt. Ezek az ún. kondicionális KO állatok. Géncsendesítés RNS interferenciával Más in vivo technikákkal is lehet még géneket időlegesen inaktiválni. Ezek közül a legjelentősebbek az RNS-interferencia jelenségét felhasználó technikák. Pl. a fonalféreg Caenorhabditis elegans-ban minden génnek tanulmányozták az RNSi-vel inaktivált hatását. De a módszer pl. egérben is működik. Forrás: Genetika és genomika Falus András, László Valéria, Tóth Sára, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba (2014)

33

34

35 Az állatkísérletek alternatívái lehetnek: In silico módszerek (pl. számítógépes modellezés) A rendelkezésre álló ismeretek hatékony felhasználása In vitro módszerek (sejtvonalak, sejt-, szövetkultúrák) Alacsonyabb rendű szervezetek A fejlődés korai stádiumai Egészséges, kóros humán szövet donációk

36 Köszönöm a figyelmet!