A komplementrendszer vizsgálata Józsi Mihály

Átírás

1 A komplementrendszer vizsgálata Józsi Mihály április 8.

2 Veleszületett és adaptív immunitás veleszületett immunitás mikrobák B-limfocita adaptív immunitás ellenanyagok epitélium fagociták T-limfocita komplement NK-sejt órák napok (A. Abbas nyomán)

3 physical barriers (soluble) (modified after Erdei-Gergely: Immunobiology [Medicina])

4 (soluble) physical barriers

5 A komplementrendszer felfedezése XIX.sz. vége: Fodor József a lépfenét okozó Bacillus anthracis-szal immunizált nyulak vérében elpusztul a kórokozó Jules Bordet a szérum hőkezelésével (56 o C-on) inaktiválható ez a hatás (hőlabilis faktor, alexine alexine ) Fodor József ( ) Specifikus ellenanyag jelenléte szükséges, de az immunizálással nem nő ennek a szérum faktornak a mennyisége. Paul Ehrlich Komplementer (kiegészítő) faktor, ami az ellenanyag mellett szükséges a kórokozó elpusztításához.

6 A komplementrendszer felfedezése Jules Bordet 1919, Nobel-díj Factors in blood serum work with antibodies to destroy bacteria, and Bordet's discovery of these complement proteins allowed the creation of tests that could diagnose many dangerous infectious diseases. Komplementfixációs teszt, hemolízis originally described as a heat-labile serum factor that complements IgG in bacterial killing

7 Cikkek száma a PubMed-ben complement vagy complement system kulcsszóra keresve a rendszer (fő funkciója) felfedezése komponensek, új utak azonosítása, leírása, jellemzése betegségek, terápia

8 A komplementrendszer ma több, mint 40 komponens ismert: - egymást láncreakcióban aktiváló oldékony faktorok - szabályozó molekulák (oldékony és sejtmembrán-kötött) - az aktivált komponenseket megkötő sejtfelszíni receptorok a veleszületett immunitás esszenciális végrehajtó rendszere inaktívan testszerte jelen van a vérben, testfolyadékokban lépésről lépésre aktiválódik (kaszkád)

9 A komplementrendszer funkciói Veleszületett immunitás Adaptív immunitás Egyéb élettani folyamatok opszonizáció mikrobák lízise kemotaxis gyulladás sejtek aktiválása B-sejtek aktiválása autoreaktív B-sejtek eliminálása T-sejt válasz elősegítése immunkomplexek eltávolítása apoptotikus és nekrotikus sejtek eltávolítása felesleges szinapszisok eltávolítása érképződés sebgyógyulás méhlepény fejlődése...

10

11 A komplementrendszer aktiválódása és szerepe klasszikus út lektin út alternatív út ellenanyagok felismerés (mintázatfelismerő molekulák) C3 C3b amplification loop opszonizáció, fagocitózis terminális út C5 C5a gyulladás, sejtaktiváció szabályozó molekulák gátolják a saját sejtek, szövetek károsodását C5b-9 lízis (célsejt feloldása)

12 A komplement szerepe a mikrobák elleni védelemben elimináció klasszikus lektin alternatív út út út (fagocitózis, lízis) C1q MBL C3b IgG, IgM mikroba MBL: mannán-kötő lektin Ig: immunoglobulin (ellenanyag, antitest)

13 Komplement és mikrobák lízis lyukak a sejtmembránban komplement patogén C3 C. albicans-on opszonizáció fokozott fagocitózis (komplementreceptorok szerepe) fa agocitált gom mba humán szérum - +

14 Saját nem-saját felismerése 1. stratégia: a nem-saját felismerése és megtámadása 2. stratégia: minden megtámadása, de a saját megvédése - komplementrendszer alternatív út kórokozó kórokozók elpusztítása emberi sejt szabályozó molekulák védik a szervezet saját sejtjeit, szöveteit - H-faktor szerepe

15 A komplementaktiváció szabályozása klasszikus út lektin út alternatív út C1-inhibitor properdin CR1 MCP DAF I-faktor C4BP C3 H-faktor C3b CR1 MCP DAF I-faktor C5 C5a karboxipeptidáz N vitronectin clusterin CD59 C5b-9 C4BP: C4b-binding protein CR1: complement receptor type 1 MCP: membrane cofactor protein DAF: decay accelerating factor

16 A komplementrendszer és betegségek ahus: atypical haemolytic uraemic syndrome AMD: age-related macular degeneration C3G: C3 glomerulopathy CARPA: complement activation-related pseudo allergy PNH: paroxysmal nocturnal haemoglobinuria i SIRS: systemic inflammatory response syndrome SLE: systemic lupus erythematosus TMA: thrombotic microangiopathy Ricklin et al., Nat. Rev. Nephrol., 2018; 14:26-47

17 A komplementrendszer szerepe betegségekben Fertőzések, szepszis, anafilaxiás sokk Iszkémia-reperfúzió Paroxizmális nokturnális hemoglobinuria Pszoriázis Miaszténia grávisz Szisztémás lupusz eritematózusz Szklerózis multiplex Szervkilökődés Daganatok Sztrók Alzheimer-kór Időskori makula- degeneráció Asztma Szívinfarktus Atípusos hemolitikus urémiás szindróma Crohn-betegség Reumatoid artritisz Ricklin D, Lambris JD. Nat Biotechnol. 2007, 25:1265. nyomán

18 A komplementrendszer és betegségek Merle NS és mtsai., Front Immunol May 26;6:257 27

19 Komplementdeficienciák és fertőzések Alternatív út (properdin, D-faktor) deficienciái: fokozott fogékonyság súlyos meningococcus fertőzésre, egyes más bakteriális fertőzésekre is Terminális út (C5-, C6-, C7-, C8-, C9-deficiencia): visszatérő, de ritkán halálos meningococcus fertőzés Klasszikus út (C1q-, C2-, C4-deficiencia): tokkal rendelkező baktériumok általi fertőzések pl. S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae Lektin út (MBL-, fikolin-deficiencia): visszatérő légúti fertőzések C3 deficiencia: légúti fertőzések, meningitis a leggyakoribb (opszonizációs defektus)

20 A komplementrendszer aktiválódása klasszikus út lektin út alternatív út ellenanyagok visszatérő légúti fertőzések felismerés (mintázatfelismerő molekulák) C3 C3b amplification loop opszonizáció, fagocitózis terminális út C5 C5a gyulladás, sejtaktiváció C5b-9 lízis (célsejt feloldása)

21 A komplementrendszer aktiválódása klasszikus út lektin út alternatív út ellenanyagok felismerés (mintázatfelismerő molekulák) C3 C3b amplification loop opszonizáció, fagocitózis terminális út C5 C5a gyulladás, sejtaktiváció C5b-9 lízis Neisseria (célsejt feloldása) meningitidis CDC/ Dr. Brodsky

22 Komplementdeficienciák és fertőzések Regulátor fehérjék, receptorok deficienciája: I-faktor, H-faktor deficiencia a C3-deficienciához hasonló, mert másodlagosan alacsony C3 és B-faktor szint alakul ki (de pl. H-faktor deficiencia glomerulonefritiszt is okoz!) CR1 alacsony expressziója véd a malária ellen. CR3/CR4 deficiencia (LAD-1) súlyos opportunista fertőzések, pl. S. aureus (neutrofil adhézió és fagocitózis defektusa miatt)

23 Malária (Plasmodium spp.) 2012-ben kb. 207 millió maláriás fertőzés, kb. 627 ezer haláleset sporozoiták (forrás: WHO) máj merozoiták vörösvérsejt szúnyogbél CR1 vörösvérsejteken: Plasmodium falciparum receptora gametociták CR1 alacsony expressziója véd a malária ellen

24 A komplementrendszer aktiválódása klasszikus út lektin út alternatív út ellenanyagok felismerés (mintázatfelismerő molekulák) terminális út C3 C5 C3b C5a amplification loop CR3/CR4 deficiencia (LAD-1) súlyos opszonizáció, fagocitózis opportunista fertőzések, pl. S. aureus (neutrofil adhézió és fagocitózis defektusa miatt) C5b-9 lízis (célsejt feloldása) National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)

25 Komplementdeficienciák és betegségek Klasszikus út (C1q-, C2-, C4-deficiencia): i i szisztémás lupus erithematosus t (SLE) és SLE-szerű megbetegedés Lektin út: MBL-deficiencia szív-érrendszeri betegségek rizikófaktora C3-deficiencia: immunkomplex-mediált betegségek g (vasculitis, glomerulonephritis) Regulátorfehérjék: H-faktor-deficiencia: glomerulonephritis (dense deposit disease) I-faktor-deficiencia: immunkomplex-mediált betegségek (vasculitis, glomerulonephr.) CD55, CD59: GPI horgony hiánya miatt alacsony v. nincs expresszió paroxismalis nocturnalis hemoglobinuria C1-INH (autosz. domináns): túl sok bradykinin képződik herediter angioneuroticus oedema

26 Komplement-polimorfizmusok és betegségek Komplement-polimorfizmusok li növelhetik az esélyét ét egyes, az alternatív tí út által mediált betegségek kialakulásának. pl. C3 R102G: C3b 102G hez kevésbé kötődik a H-faktor - időskori makuladegeneráció, dense deposit disease, vasculitis rizikófaktora B-faktor R32Q: konvertáz felépülésének hatékonyságát befolyásolja a FB 32Q kevésbé képes konvertázt kialakítani protektív polimor- fizmus az időskori makuladegeneráció esetén A polimorfizmusok összessége meghatározza, hogy milyen mértékben aktiválódhat a komplementrendszer. - patogének szelekciós nyomása! ui. az aktívabb komplement hatékonyabban pusztítja el a kórokozókat, de egyben növeli a komplement által okozott betegségek kockázatát is.

27 Morgan BP, Harris CL. Nat Rev Drug Discov. 2015;14:

28 A komplementrendszer vizsgálata, aktivitásának mérése

29

30 Összesen ~ 4 mg/ml!

31 A komplementrendszer aktiválódása és szerepe klasszikus út lektin út alternatív út ellenanyagok felismerés (mintázatfelismerő molekulák) C3 C3b amplification loop opszonizáció, fagocitózis terminális út C5 C5a gyulladás, sejtaktiváció szabályozó molekulák gátolják a saját sejtek, szövetek károsodását C5b-9 lízis (célsejt feloldása)

32 1. Diagnózis : deficienciák mikor vizsgáljuk? - gennykeltő fertőzésekre való hajlam, - csalánkiütés, - ödéma hajlam. 2. Betegség aktivitás, terápia hatékonyság követése, szövődmény előrejelzés Hipokomplementémia: genetikai ok, SLE, RA, szeptikus sokk, akut hepatitis, pancreatitis... Hiperkomplementémia:fertőzések fertőzések, krónikus gyulladás, infarktus, trauma, rosszindulatú daganatok In vivo aktiváció: SLE, RA, égés, szepszis, dialízis...

33 Hemolízis esszék össz-komplement Alternatív út aktivitása H-faktor mutáció, H-faktor autoantitest, C3-nefritikus faktor (C3Nef)... Komplementfehérjék szintje (pl. deficiencia) ELISA Western blot (pl. fehérje hiány kimutatására) FACS (pl. CD55, CD59) Nefelometria Mancini Génváltozatok (mutációk, polimorfizmusok, deléciók, allél kópiaszám meghatározása) Szekvenálás MLPA Western blot Autoantitestek kimutatása C1q C3Nef H-faktor stb.

34 Savóból: komplementrendszer pillanatnyi állapota, komponensek szérumkoncentrációja, aktiváltsága, aktiválhatósága jellemzésére: - össz-komplement titrálás - egyes komponensek aktivitása - komponensek koncentrációja - in vivo aktiváció kimutatása - komplementfehérjével fedett immunkomplexek kimutatása EDTA-plazma: komplement aktivációs termékek kimutatása Gyógykészítmények komplement aktiváló képességének in vitro vizsgálata Komplementreceptor expresszió mérése sejteken Komplement lerakódás kimutatása szövetekben Komplement-génváltozatok vizsgálata

35 -savó - frissen használni (szobahőmérsékleten néhány óra) vagy -egyszer lefagyasztva -70 o C tárolni -Hőinaktiválás: 56 o C, 30 perc

36 Klasszikus út mérése - D faktor mentesített szérumból Alternatív út (ACH 50 ) aktivációjának iójá kmérése é - ellenanyag nélkül - EGTA + Mg 2+ - nyúl vvs A két út szelektíven gátolható: Klassszikus út: Ca 2+,Mg 2+ igény Alternatív út: Mg 2+ igény EDTA: Ca 2+ és Mg 2+ -kal komplexet képez EGTA: Ca 2+ -nal komplexet képez

37 Össz-komplement titrálás módszerek A vvs vvs ellenes antitest (hemolizin) + savó (amiben mérjük a + komplement aktivitást) Hemolitikus tesztt hemolízis Hemoglobin meghatározás B liposzóma Liposzóma membrán ellenes antitest + savó G6PDH + (amiben mérjük a komplement aktivitást) lipolízis Liposzóma immunesszé G6PDH meghatározás C aggregált Ig +savó (amiben mérjük a komplement aktivitást) C aktiváció CH50 ekvivalens ELISA sc5b-9 meghatározás

38 Össz-komplement titrálás hemolitikus módszerrel Funkcionális teszt: a komplementaktiváció együttes biológiai aktivitását méri vvt vvt ellenes antitest (amiben mérjük a (hemolizin) +savó komplement + aktivitást) hemolízis Hemoglobin meghatározás (405 nm, spektrofotometria)

39 Össz-komplement titrálás hemolitikus módszerrel Emberi savó vizsgálatához szükséges: birka vörösvértest, birka vvt. specifikus nyúl ellenanyag (hemolizin) standardizált hígítás, térfogat és inkubációs idő VBS (Ca-Mg tartalmú veronál puffer) hemolízis mértéke = szérum összkomplement tartalom/aktivitást itá CH50 : a vvs-ek 50%-ának líziséhez szükséges savó mennyisége Emberi savó normál CH50 = Eltérések: é 0 - C1-C8 örökletes hiánya C9 hiány normális, de lehet D faktor hiány csökken - H, I faktor hiány

40 Össz-komplement titrálás hemolitikus módszerrel CH50 1 ml savóra vonatkozó hemolítikus egység meghatározása: van Krogh egyenlet OD(405nm) - reagens kontroll(rk): szérum nélkül - lízis kontroll(lk): desztillált víz - mintából(m) hígítási sor E M E RK /E LK = y y * 100 = lízis % Hemolízis y/1-y 100% 50% ml szérum 1 0,1 x x x x ml szérum CH50/ml = 1 ml / x ml

41 WIELISA: komplement funkcionális ELISA Coat: IgM mannán lipopoliszacharid source: Svar Life Science AB

42 Springer International Publishing AG, part of Springer Nature R. Y. Alhabbab, Basic Serological Testing, Techniques in Life Science and Biomedicine for the Non-Expert,

43 Komplementkomponensek egyedi vizsgálata 1. Hemolitikus módszer (funkcionális) A rendszer tartalmazza a célsejt líziséhez szükséges valamennyi komponenst - kivéve a mérendő komponenst a lízis mértékét a vizsgált komponens határozza meg a kaszkád-szerű működés miatt 2. Másodlagos vagy jelzéses módszerek - Mancini teszt - ELISA

44 Nefelometria Komplementkomponensek mérése C3 C4 oldott immunkomplexek mérése megvilágítás monokromatikus fénynyalábbal megvilágító fény hullámhossza összemérhető a részecske méretével kis szögben detektáljuk a szórt fény intenzitását fényszóródást mérünk nagy koncentráció nagy fényszórás nagy jel rutin diagnosztikában kisebb koncentrációjú szérumfehérjék mérése pl. IgE, szabad könnyűlánc

45 Precipitáció gél közegben Mancini-módszer Radiális immundiffúzió (RID) C1q C5 B-faktor I-faktor C1-inhibitor Properdin

46 ELISA C5b-9 C3a másodlagos jelölt ellenanyag antigén szubsztrát specifikus jelöletlen ellenanyag csapda ellenanyag

47 vv vt-specifik kus mark ker (CD23 35a) FACS méret (FSC) CD59 expresszió mérése áramlási citofluoriméterrel ejtszám se CD59 CD59 CD59 Normál vvt-k Részleges deficiencia Komplett deficiencia + transzfúzió

48 Példa: atípusos hemolítikus urémiás szindróma egy komplex hátterű betegség, ahol a komplement szerepe részletesebben ismert

49 Atípusos hemolitikus urémiás szindróma (ahus) potenciálisan halálos, ritka vesebetegség 2 eset / 1,000,000 fő / év hemolitikus anémia, alacsony vérlemezkeszám, akut veseelégtelenség jellemzi courtesy of Dr. Ch.J. Mache veseendotél sérülése fontos a betegség kialakulása során a komplementaktiváció szabályozásának hibájával függ össze felszíneken (sejt, alapmembrán) - komplementgén mutációk és polimorfizmusok - génátrendeződések és deléciók a H-faktor génklaszterben - H-faktor ellenes autoantitestek

50 Atípusos hemolitikus urémiás szindróma (ahus) állandó komplementaktiváció endotélaktiváció, vérlemezke-aktiváció, trombusképződés ( Alexion) kapilláriselzáródás (trombotikus mikroangiopátia) trombocitopénia hemolitikus anémia veseelégtelenség, urémia tünetek egyéb szervekben vörösvértest granulocita vérlemezke von Willebrand-faktor

51 Atípusos hemolitikus urémiás szindróma (ahus) kiválthatja fertőzés, gyógyszer, terhesség ~50% végstádiumú veseelégtelenség, ~25% mortalitás az első akut fázis alatt egyéb tünetek (magas vérnyomás, hasmenés, idegrendszeri problémák ) kezelés: plazmaferezis, gyulladásgátlók, anti-c5, immunszuppresszánsok

52 Komplement és ahus klasszikus út lektin út alternatív út (IgG, pentraxinok...) (cukor csoportok) (folyamatos) H-faktor C3 C3b B-faktor MCP I-faktor clusterin terminális út (MAC) funkcióvesztéses (regulátorok) és funkciószerzéses (C3, B-faktor) mutációk szerzett forma: H-faktor autoantitestek MCP: membrane cofactor protein

53 Komplement és ahus Érintett gén/fehérje Gyakoriság H-faktor % I-faktor 4-12 MCP 7-10 B-faktor < 2 C3 8 CFH::CFHR1 hibrid gén 3 H-faktor ellenes antitestek 2-10 Thrombomodulin < 2 döntően heterozigóta mutációk alacsony penetrancia (~50%) kell egy trigger, pl. fertőzés, gyógyszer, terhesség további gének, autoantitestek szerepe? kezelés: plazmaferezis, gyulladásgátlók, anti-c5, immunszuppresszánsok

54 Komplementvizsgálatok ahus betegekben

55

56 elektron- immunfénymikroszkóp mikroszkóp fluoreszcencia anti-c3 Ding et al., Scientific Reports, 7: 6004 (2017)

57 H-faktor autoantitestek jellemzése ahus-ban ELISA Autoantitest-kötő hely meghatározása betegek ahus D+ HUS egészséges H-faktor domének (SCR-ek) Komplementreguláció Felszín- és ligandumkötés autoantitest Józsi et al., Blood 2008, 111: Józsi et al., Blood 2007, 110:

58 Hemolízis esszé birka vörös- vérsejtek egészséges humán plazma autoimmun HUS hemoglobin (A414)

59 Autoantitestek gátolják a H-faktor sejtekhez kötődését in vitro hemolízis esszé birka vörösvérsejt (SRBC) modell betegek vérplazmája egészségesek g vérplazmája Strobel,, Józsi. (2010) Nephrol. Dial. Transplantation, 25:

60 A komplementrendszer aktiválódása klasszikus út lektin út alternatív út ellenanyagok felismerés (mintázatfelismerő molekulák) C3 C3b amplification loop opszonizáció, fagocitózis Anti-C5 (Soliris, eculizumab) C5 C5a gyulladás, sejtaktiváció szabályozó molekulák gátolják a saját sejtek, szövetek károsodását C5b-9 lízis (célsejt feloldása)

61 Eculizumab terápia hatékonyságának követése C3 Zimmerhackl et al., NEJM 2010:

62 Eculizumab terápia hatékonyságának követése sc5b-9 Zimmerhackl et al., NEJM 2010: