(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) Int. Cl.: A61K 38/46 ( ) A61K 48/00 ( ) A61P 1/16 ( ) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/NL 05/ (30) Elsõbbségi adatok: P US (72) Feltaláló: VAN DEVENTER, Sander, Jan, Hendrik, NL-2012 CH Haarlem (NL) (73) Jogosult: Amsterdam Molecular Therapeutics B. V., 1105 BA Amsterdam (NL) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Protein- és nukleinsavterapeutikumok alkalmazása nem alkoholos steatohepatitis kezelésére (57) Kivonat A találmány tárgya protein- és nukleinsavterapeutikumok, közelebbrõl lipoproteinlipáz (LPL) terapeutikumok alkalmazása, nem alkoholos eredetû steatohepatitis kezelésére. HU T2 A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 A találmány tárgyköre A találmány tárgyát protein- és nukleinsavterapeutikumok alkalmazása képezi nem alkoholos eredetû steatohepatitis kezelésére. A találmány háttere A nem alkoholos steatohepatitis ( non-alcoholic steatotic hepatitis, NASH) a nem alkoholos zsírmáj ( non-alkoholic fatty liver disease, NAFL) betegségcsoportba tartozik, és olyan szövettani elváltozások kialakulására utal a májban, amelyek hasonlók a túlzott alkoholfogyasztás által elõidézettekhez. A NASH azonban olyan betegeknél fordul elõ, akik nem fogyasztanak túlzott mértékben alkoholt. A NASH¹t a szérumamino-transzferázok emelkedett szintje jellemzi, amely májsejtkárosodásra utal. A betegséget makrovesicularis steatosis (azaz, citoplazmán belüli vakuólumok, amelyek a májsejt magjának excentrikus eltolódását okozzák), gyulladás, és esetenként fibrózis jellemzi, amely cirrhosisba (májzsugorba) mehet át. Bizonyítékok növekvõ száma utal arra, hogy a NASH a metabolikus inzulinrezisztencia-szindróma része. Ez a rendellenességek egy csoportja, amelybe az elhízás, dyslipidaemia, arteriosclerosis és diabetes mellitus tartoznak, és amelyek közös jellemzõje az inzulinrezisztencia [de Sligte és munkatársai: Eur. J. Int. Med. 15, 10 (2004)]. Bár számos hatóanyagot próbáltak ki NASH enyhítésére és a további károsodás megelõzésére, nincs elfogadott terápia erre a potenciálisan súlyos állapotra. A NASH kezelésében hatékonyságra tesztelt hatóanyagok egyike a roziglitazon [Muurling és munkatársai: Metabolism 52, 1078 (2003)]. A testtömeg csökkenése szintén javíthatja a NASH kimenetelét. E beavatkozások ellenére azonban, a betegek jelentõs számánál a NASH cirrhosisba megy át, és végül májtranszplantációt igényel, amelyet követõen az állapot kiújulhat. Mivel az elhízás és diabétesz elõfordulása az egyesült államokbeli és európai populációban egyaránt emelkedõ tendenciát mutat, sürgetõ igény mutatkozik a NASH kezelésére alkalmazható új eljárások kifejlesztésére. A találmány részletes ismertetése A találmány tárgyát képezi eljárás nem alkoholos steatohepatitis kezelésére, arra rászoruló egyénben. Az eljárásban lipoproteinlipáz (LPL) terapeutikumot adunk be az egyénnek hatékony mennyiségben. A leírásban LPL-terapeutikum kifejezésen LPL-aktivitású proteint (EC ), vagy ilyen proteint kódoló nukleinsavat értünk. Az LPL-terapeutikum protein formája A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az LPL-terapeutikum LPL-protein, amelynek aminosavszekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencia mutatja, és amelyeket a leírásban LPL S447X proteinekként vagy peptidekként jelölünk. Általánosságban, ezek az LPL S447X proteinek rövidebbek, mint a jól ismert, vad típusú LPL, amely 448 aminosavat tartalmaz [lásd például Wion és munkatársai közleményét: 235, (1987), vagy a WO 01/00220 számú nemzetközi közzétételi iratot]. Magukban foglalhatnak olyan vegyületeket, mint például a vad típusú LPL karboxiterminális végérõl a aminosavaknál csonkított LPL peptidfragmensei, módosított peptidfragmensei, analógjai vagy gyógyászatilag elfogadható sói. Az ilyen vegyületeket a leírásban összefoglaló néven LPL S447X peptideknek nevezzük. Az LPL S447X peptidek közé tartoznak a vad típusú, érett LPL aminosavszekvenciájának megfelelõ homológok, beleértve olyan homológokat, amelyek nem homo sapiens eredetûek (amelyek állatorvosi területen nyerhetnek alkalmazást). LPL S447X peptidek közé tartoznak a vad típusú LPL származékai és természetben elõforduló izoformjai vagy genetikai variánsai. Az LPL S447X protein származékainak és variánsainak az alkalmazása szintén a találmány oltalmi körébe tartozik. Az S447X protein származékai Közelebbrõl, a származékok közé tartoznak olyan, LPL-aktivitású proteinek, amelyek az LPL S447X proteinével azonos aminosavszekvenciájúak, amelyekben azonban néhány N¹ vagy O¹glikozilációs helyet módosítottak vagy kiiktattak. A származékok közé tartoznak továbbá a C¹terminális hidroxi-metil-származékok, O¹módosított származékok (például C¹terminális hidrometil-benzil-éter), valamint helyettesített amidokat, például alkil-amidokat és hidrazidokat magukban foglaló, N¹terminálisan módosított származékok. A találmány szerinti LPL terapeutikumban egy adott peptidstruktúra közvetlenül vagy közvetett módon kapcsolódhat módosító csoporthoz. A leírásban a módosító csoport kifejezésen olyan struktúrákat értünk, amelyek közvetlenül kapcsolódnak a peptidstruktúrához (például kovalens kötéssel), valamint olyanokat, amelyek közvetett módon kötõdnek a peptidstruktúrához (például stabil, nem kovalens kötéssel vagy kovalens kötéssel bármely további aminocsoporthoz, vagy azok mimetikumaihoz, analógjaihoz vagy származékaihoz, amelyek határolhatják az MCP 3 mag peptidstruktúrát). A módosítócsoport kapcsolódhat például az LPL terapeutikum struktúra aminoterminális vagy karboxiterminális végéhez, vagy a mag domént szegélyezõ egyik peptid vagy peptidomimetikus régióhoz. Más megoldás szerint, a módosítócsoport kapcsolható az LPL terapeutikum egy aminocsoportjának oldalláncához, vagy a mag domént szegélyezõ egyik peptid- vagy peptidomimetikus régióhoz [például lizilcsoport(ok) epszilon-amino-csoportján keresztül, aszparaginsavcsoport(ok) vagy glutaminsavcsopor(tok) karboxilcsoportján vagy csoportjain keresztül, tirozilcsoport(ok), szerincsoport(ok) vagy treonincsoport(ok) hidroxilcsoportján keresztül, vagy bármely aminosav-oldallánc megfelelõ más reaktív csoportján keresztül]. A peptidstruktúrához kovalensen kötõdõ módosító csoportok hozzáadása kémiai struktúrák összekapcsolására alkalmas, szakember által jól ismert eljárásokkal végezhetõ, például amid¹, alkil-amino¹, karbamát vagy ureakötésekkel. A találmány egyes megvalósítási módjai szerint, a módosító csoport tartalmazhat ciklusos, heterociklusos 2

3 1 HU T vagy policiklusos csoportot. A leírásban ciklusos csoport kifejezésen 3 10, 4 8 vagy 5 7 szénatomot tartalmazó, telített ciklusos vagy telítetlen ciklusos (azaz aromás) csoportokat értünk. Ilyen ciklusos csoportok például a ciklopropil¹, ciklobutil¹, ciklopentil¹, ciklohexilés ciklooktilcsoportok. A ciklusos csoportok lehetnek nem szubsztituáltak, vagy a gyûrû egy vagy több pozíciójában szubsztituáltak. Adott ciklusos csoport szubsztituálható például halogén¹, alkil¹, cikloalkil¹, alkenil¹, alkinil¹, aril¹, heterociklusos¹, hidroxil¹, amino¹, nitro¹, tiol¹, amino¹, imin¹, amid¹, foszfonát¹, foszfin¹, karbonil¹, karboxil¹, szilil¹, éter¹, tioéter¹, szulfonil¹, szulfonát¹, szelenoéter¹, keton¹, aldehid¹, észter¹, CF 3 ¹ és/vagy CN-csoportokkal. A leírásban heterociklusos csoport alatt telített vagy telítetlen ciklusos, és aromás csoportokat értünk, amelyek 3 10, 4 8 vagy 5 7 szénatomot tartalmaznak, és amelyek a gyûrû szerkezetében egy vagy több heteroatomot hordoznak. Heterociklusos csoportok közé tartoznak például a pirrolidin, oxolán, tiolán, imidazol, oxazol, piperidin, piperazin és morfolin. A heterociklusos gyûrû egy vagy több pozícióban szubsztituálva lehet olyan szubsztituensekkel, mint például halogén¹, alkil¹, cikloalkil¹, alkenil¹, alkinil¹, aril¹, más heterociklusos¹, hidroxil¹, amino¹, nitro¹, tiol¹, amino¹, imin¹, amid¹, foszfonát¹, foszfin¹, karbonil¹, karboxil¹, szilil¹, éter¹, tioéter¹, szulfonil¹, szelenoéter¹, keton¹, aldehid¹, észter¹, CF 3 ¹ és/vagy CN-csoportokkal. A heterociklusos csoportok továbbá más ciklusos csoportokhoz hidalhatók vagy fuzionáltathatók, amint azt alább ismertetjük. A leírásban policiklusos csoport kifejezésen két vagy több, telített, telítetlen vagy aromás ciklusos gyûrût értünk, amelyekben két szomszédos gyûrû két vagy több szénatomja közös, így a gyûrûk fuzionált gyûrûk. Az olyan gyûrûket, amelyek nem szomszédos atomokon keresztül kapcsolódnak, áthidalt gyûrûknek nevezzük. A policiklusos gyûrûk bármelyike szubsztituálható a fent ismertetett szubsztituensekkel, például halogén¹, alkil¹, cikloalkil¹, alkenil¹, alkinil¹, hidroxil¹, amino¹, nitro¹, tiol¹, amino¹, imin¹, amid¹, foszfonát¹, foszfin¹, karbonil¹, karboxil¹, szilil¹, éter¹, tioéter¹, szulfonil¹, szelenoéter¹, keton¹, aldehid¹, észter¹, CF 3 ¹ és/vagy CN-csoportokkal. A leírásban az alkil kifejezésen telített alifás csoportokat értünk, ide sorolva egyenes láncú alkilcsoportokat, elágazó láncú alkilcsoportokat, cikloalkil (aliciklusos) csoportokat, alkilszubsztituált cikloalkilcsoportokat és cikloalkilszubsztituált alkilcsoportokat. Egyes megvalósítási módok szerint, az egyenes vagy elágazó láncú alkil a vázban 20 vagy kevesebb szénatomot (egyenes lánc esetében C 1 C 20, elágazó lánc esetében C 3 C 20 ), vagy 10 vagy kevesebb szénatomot tartalmaz. Egyes megvalósítási módok szerint, a cikloalkilek gyûrûszerkezetükben 4 10 szénatomot, például 5, 6 vagy 7 szénatomot tartalmazhatnak. Hacsak a szénatomok számát kifejezetten másképp nem adjuk meg, a leírásban a kis szénatomszámú alkil kifejezésen olyan, fent ismertetett alkilcsoportot értünk, amely vázszerkezetében 1 10 atomot tartalmaz. Hasonlóképpen, a kis szénatomszámú alkenil és kis szénatomszámú alkinil csoportok tíz vagy kevesebb szénatom lánchosszúságúak. A leírásban és az igénypontokban alkil (vagy kis szénatomszámú alkil ) kifejezés egyaránt vonatkozik nem szubsztituált alkilekre és szubsztituált alkilekre, amely utóbbiak alatt olyan alkileket értünk, amelyek szénhidrátvázának egy vagy több szénatomján elhelyezkedõ hidrogént szubsztituensek helyettesítik. Ilyen szubsztituensek lehetnek például halogén¹, hidroxil¹, karbonil- [például karboxil¹, keton¹, (például alkilkarbonil- és aril-karbonil-csoportok), és észter- (például alkil-oxi-karbonil- és aril-oxi-karbonil-csoportok)], tiokarbonil¹, acil-oxi¹, alkoxil¹, foszforil¹, foszfonát¹, foszfinát¹, amino¹, acil-amino¹, amido¹, amidin¹, imino¹, ciano¹, nitro¹, azido¹, szulfhidril¹, alkil-tio¹, szulfát¹, szulfonát¹, szulfamoil¹, szulfonamido¹, heterociklil¹, aralkil¹, vagy aromás vagy heteroaromás csoportok. Kívánt esetben, a szénhidrátláncon szubsztituált csoportok maguk is lehetnek szubsztituáltak. Például, adott szubsztituált alkil szubsztituensei lehetnek az alábbiak szubsztituált és/vagy nem szubsztituált formái: amino¹, azido¹, imino¹, amido¹, foszforil (például foszfonát és foszfinátcsoportok), szulfonil- (például szulfát¹, szulfonamido¹, szulfamoil- és szulfonátcsoportok) és szililcsoportok, valamint éter¹, alkil-tio¹, karbonil- (például keton¹, aldehid¹, karboxilát- és észtercsoportok), CF 3, CN és hasonló csoportok. Példaként szolgáló, szubsztituált alkileket alább ismertetünk. Cikloalkilek tovább szubsztituálhatók alkil¹, alkenil¹, alkoxi¹, alkiltio¹, amino-alkil¹, karbonilszubsztituált alkil¹, CF 3, CN és hasonló csoportokkal. A leírásban alkenil és alkinil kifejezésen olyan, telítetlen alifás csoportokat értünk, amely hosszukat és szubsztitúciós lehetõségeiket tekintve analógok a fenti alkilekkel, azonban legalább egy kettõs vagy hármas kötést tartalmaznak. A leírásban aralkil kifejezésen olyan alkil- vagy alkilenilcsoportot értünk, amely legalább egy arilcsoporttal szubsztituált Aralkilcsoportok közé tartoznak például a benzil- (azaz fenil-metil¹), 2¹naftil-etil¹, 2¹(2¹piridil)- propil¹, 5¹dibenzo-szuberil-csoportok és hasonlók. A leírásban alkil-karbonil kifejezésen C(O)-alkilcsoportot értünk. Hasonlóképpen, aril-karbonil kifejezéssel C(O)-aril-csoportra utalunk. A leírásban alkiloxi-karbonil kifejezésen C(O) O-alkil-csoportot, ariloxi-karbonil kifejezésen C(O) O-aril-csoportot értünk. Az acil-oxi kifejezés O C(O) R 7 csoportra vonatkozik, ahol R 7 jelentése alkil¹, alkenil¹, alkinil¹, aril¹, aralkil- vagy heterociklilcsoport. A leírásban amino kifejezésen N(R )(R ) csoportot értünk, ahol R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogén, alkil¹, alkenil¹, aralkil- vagy aril¹, vagy amelyben R és R, a nitrogénatommal együtt, amelyhez kapcsolódnak, 4 8 atomos gyûrût képeznek. Ennek megfelelõen, a leírásban amino kifejezésen nem szubsztituált, monoszubsztituált (például monoalkil-amino- vagy monoaril-amino-csoportok) és diszubsztituált (például dialkil-amino- vagy alkil-arilamino-csoportok) aminocsoportokat értünk. A leírás- 3

4 1 HU T2 2 ban amido kifejezésen C(O) N(R 8 )(R 9 ) csoportot értünk, ahol az R 8 és R 9 csoportok a fentiek szerint definiáltak. Az acil-amino kifejezés N(R 8 )C(O) R 7 csoportra vonatkozik, ahol R 7 a fentiek szerint definiált, és R 8 alkil. A leírásban a nitro kifejezés NO 2 csoportot jelent; a halogén kifejezés F, Cl, Br vagy I csoportokat jelöl; a szulfhidril kifejezés SH csoportot, a hidroxil kifejezés OH csoportot jelent. A leírásban aril kifejezésen 5, 6 és 7 tagú aromás csoportokat értünk, amelyek gyûrûjükben 0 4 heteroatomot tartalmazhatnak, például fenil¹, pirrolil¹, furil¹, tiofenil¹, imidazolil¹, oxazol¹, tiazolil¹, triazolil¹, pirazolil¹, piridil¹, pirazinil¹, piridazinil- és pirimidinilcsoportokat, és hasonlókat. Az olyan arilcsoportokat, amelyek gyûrûszerkezetükben heteroatomot tartalmaznak, heterociklusos aril¹,, vagy heteroaromás csoportoknak is nevezzük. Az aromás gyûrû, a gyûrû egy vagy több pozíciójában a fent ismertetett szubsztituensekkel lehet szubsztituálva, például halogén¹, azid¹, alkil¹, aralkil¹, alkenil¹, alkinil¹, cikloalkil, hidroxil¹, amino¹, nitro¹, szulfhidril¹, imino¹, amido¹, foszfonát¹, foszfinát¹, karbonil¹, karboxil¹, szilil¹, éter¹, alkil-tio¹, szulfonil¹, szulfonamido¹, keton¹, aldehid¹, észtercsoporttal, heterociklusos, aromás vagy heteroaromás csoporttal, CF 3, CN vagy hasonló csoporttal. Arilcsoportok szintén részét képezhetik egy policiklusos csoportnak. Például, arilcsoportok tartalmazhatnak fuzionált aromás csoportokat, mint például naftil¹, antracenil¹, kvinolil¹, indolil- és hasonló csoportokat. Módosító csoportok közé tartozhatnak biotinilstruktúrákat tartalmazó csoportok, fluoreszceint tartalmazó csoportok, dietilén-triamin-pentaacetil-csoport, ( )- mentoxi-acetil-csoport, N¹acetil-neuraminil-csoport, kolilstruktúra vagy iminio-biotinil-csoport. Adott LPL-terapeutikum a karboxiterminális végén módosítható kolilcsoporttal szakember által jól ismert eljárásokkal [lásd például Wess, G. és munkatársai: Tetrahedron Letters 34, (1993)]; kolilszármazékok és analógok szintén alkalmazhatók módosító csoportokként, például Aic [3¹(O¹amino-etil-izo)-kolil], amely olyan szabad aminocsoportot tartalmaz, amely az LPL-terapeutikum további módosítására alkalmazható. Módosítócsoport lehet biotinilstruktúra, amely lehet biotinilcsoport, vagy annak analógja és származéka (például 2¹imino-biotinil-csoport). Más megvalósítási mód szerint, a módosító csoport fluoreszceint tartalmazó csoportot tartalmazhat, például olyan csoportot, amelyet LPL-terapeutikum peptidnek és 5¹(és 6¹)-karboxi-fluoreszceinnek, szukcinimidil-észternek vagy fluoreszcein-izotiocianáttal történt reagáltatásával származtattak. Különbözõ egyéb megvalósítási módok szerint, a módosító csoport(ok) tartalmazhat(nak) N¹acetil-neuraminil-csoportot, transz-4-cotinin-karboxilcsoportot, 2¹imino-1-imidazolidin-acetil-csoportot, (S)¹( )-indolin- 2-karboxilcsoportot, ( )-mentoxi-acetil-csoportot, 2¹norbornán-acetil-csoportot, gamma-oxo-5-acenaftén-butiril-csoportot, ( )-2-oxo-4-tiazolidin-karboxil-csoportot, tetrahidro-3-furoil-csoportot, 2¹imino-biotinilcsoportot, dietilén-triamin-pentaacetil-csoportot, 4¹mor folin-karbonil-csoportot, 2¹tiofén-acetil-csoportot vagy tiofén-szulfonil-csoportot. LPL S447X protein variánsai Variáns LPL-polipeptidek közé olyan polipeptidek tartoznak, amelyek az LPL S447X-proteinnel lényegében hasonló szekvenciájúak, például az 1. azonosító számú szekvencia megfelelõ részével 90%¹os, 95%¹os vagy 99%¹os szekvenciaazonosságot mutatnak, ahol a megfelelõ rész bármely hosszúságú folyamatos szekvencia, például 10, 20, 30, 40, 50 vagy több aminosav. Az ilyen proteinek jellemzõen LPL-aktivitást vagy más LPL-szerû tulajdonságot mutatnak, amelyek lehetnek az LPL S447X-proteinével azonos mértékûek vagy erõsebbek. Néhány megvalósítási mód szerint, az LPL S447X-proteinszekvenciában található aminosavak szubsztituálhatók kémiailag hasonló aminosavakkal (konzervatív aminosavszubsztitúciók létrehozása céljából). A találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint, kerülni kell olyan aminosavszubsztitúciókat, amelyek csökkentik az LPL-aktivitást, és amelyekbõl több mint 50 példát leírtak, például a 291. pozícióban található Ser szubsztitúcióját Asn-csoporttal (Asn291Ser), a 9. pozícióban található Asn szubsztitúcióját Asp-csoporttal (Asp9Asn), a 188. pozícióban található Glu szubsztitúcióját Gly-csoportra [Gly188Glu, lásd Monsalve és munkatársai: J. Clin. Invest. 86(3), (1990)] vagy az Asp250Asn [Me és munkatársai: Genomics. 13, (1992)] szubsztitúciót. LPL-terapeutikum nukleinsavformája A találmány egy további megvalósítási módja szerint, az LPL-terapeutikum vad típusú LPL-proteint vagy LPL S447X-proteint kódoló nukleinsav. Más megoldás szerint, a nukleinsav tartalmazhat olyan DNS kódolószekvenciát, amely a 2. azonosító számú, az érett, vad típusú LPL-peptidet kódoló szekvencia szerinti nukleotidszekvenciával legalább 90%¹os szekvenciaazonosságot mutat. További más megoldás szerint, az LPL-terapeutikum olyan DNS kódolószekvenciát tartalmazó nukleinsavat tartalmazhat, amely sztringens körülmények között hibridizál a 2. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidokkal. Szekvenciaazonosság Két nukleinsav- vagy proteinszekvenciát akkor tekintünk lényegében azonosnak, ha optimálisan összerendezve, legalább körülbelül 70%¹os azonosságot mutatnak. További megvalósítási módok szerint, a szekvenciaazonosság lehet például legalább 75%¹os, legalább 90%¹os vagy legalább 95%¹os. Szekvenciák azonosságának összehasonlítása érdekében optimális összerendezés számos algoritmussal hajtható végre, ilyenek például Smith és Waterman [Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)] lokális homológia algoritmusa, Needleman és Wunsch [J. Mol. Biol. 48, 443 (1970)] hasonlóságkeresõ algoritmusa, Pearson és Lipman [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)] hasonlóságkeresõ eljárása, valamint ezen algoritmusok komputerizált alkal- 4

5 1 HU T mazásai [például GAP, BESTFIT, FASTA és TFASTA szoftverek (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA)]. Szekvencia-összerendezés végezhetõ Altschul és munkatársai [J. Mol. Biol. 215, (1990)] által ismertetett BLAST algoritmussal (az ismertetett alapértelmezett beállítások alkalmazásával). BLAST analízis végzésére alkalmas szoftver hozzáférhetõ a National Center for Biotechnology Information központon keresztül (interneten keresztül A BLAST algoritmus elõször magas pontszámú szekvenciapárokat ( high score pairs, HSP-ket,) azonosít azáltal, hogy adott hosszúságú rövid szavakat (W) keres a vizsgált szekvenciában, amely egy adott adatbázis-szekvenciában található, azonos hosszúságú szekvenciarészlettel ( szóval ) illeszhetõ, vagy kielégít egy adott T ( treshlold ) pozitív küszöbértéket. A T a szó szomszédsági pontszámának a küszöbértéke. A kezdeti szomszédsági szótalálatok kiindulási pontként szolgálnak hosszabb HSP¹k keresésének elindításához. A program a szótalálatokat az egyes szekvenciák mentén mindkét irányba kiterjeszti, egészen addig, amíg a kumulatív összerendezési pontszám növelhetõ. A szótalálatok mindkét irányba történõ kiterjesztése leáll, ha az alábbi paraméterek teljesülnek: a kumulatív összerendezési pontszám X értékkel a maximálisan elért érték alá csökken; a kumulatív pontszám nullára vagy az alá esik, egy vagy több negatív pontszámú elem összerendezésének halmozódása miatt; vagy a mûvelet eléri az egyik szekvencia végét. A W, T és X BLAST algoritmus paraméterek meghatározzák az összerendezés érzékenységét és sebességét. A BLAST programok alapbeállításban a következõk alkalmazhatók: 11¹es szóhosszúság (W), 50¹es BLOSUM62 pontozásos mátrix összerendezés (B) [Henikoff és Henikoff: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, (1992)], 10¹es várható gyakoriság (E) (amely a különbözõ megvalósítási módokban 1¹re, 0,1¹re, 0,01¹re, 0,001¹re vagy 0,0001¹re változtatható; bár a 0,1-nél sokkal magasabb E értékek esetleg nem azonosítanak funkcionálisan hasonló szekvenciákat, alkalmasak kisebb jelentõségû találatok vizsgálatára, rövid hasonló régiók keresésére 0,1 és 10 közé esõ E értékek alkalmasak), M=5, N=4 értékek, nukleinsavak mindkét szálának összehasonlítására. Proteinek összehasonlítására a BLASTP algoritmus alkalmazható az alábbi alapbeállításokkal: G=11 (hézag nyitásának büntetése); E=1 (hézag kiterjesztésének a büntetése); E=10 (várható gyakoriság értéke, ennél a beállításnál, egy olyan méretû adatbázisban, mint amelyben keresünk, várhatóan 10 olyan találat fordul elõ véletlenszerûen, amelyek pontszáma azonos vagy nagyobb, mint az S definiált összerendezési pontszám; E értéke növelhetõ vagy csökkenthetõ a keresés sztringenciájának módosítása érdekében); és W=3 (szóméret, BLASTN esetében alapbeállításban 11, más blast programok esetében 3). A BLOSUM mátrix egy adott összerendezés minden egyes pozíciójához hozzárendel egy valószínûségi pontszámot, amelynek alapja a gyakoriság, amellyel a szubsztitúció ismereteink szerint elõfordul rokon proteinek konszenzus blokkjaiban. A BLAST 2,0 algoritmus a BLOSUM62 (hézag jelenlétének büntetése=11; hézag büntetése elemenként=1; lambda arány=0,85) helyettesítési mátrixot alkalmazza alapbeállításként. A BLO- SUM62 helyett számos más mátrix alkalmazható, ezek közé tartoznak: PAM30 (9, 1, 0,87); PAM70 (10, 1, 0,87); BLOSUM80 (10, 1, 0,87); BLOSUM62 (11, 1, 0,82)?5/28; és BLOSUM45 (14, 2, 0,87). A BLAST algoritmus szerint, két szekvencia statisztikai hasonlóságának egyik mérõszáma a legkisebb összesített valószínûség [P(N)], amely annak valószínûségét adja meg, hogy két nukleotid- vagy aminosavszekvencia véletlenszerûen egyezik. A találmány további megvalósítási módjai szerint, nukleotid- vagy aminosavszekvenciákat az esetben tekintünk azonosnak, ha tesztszekvenciák összehasonlításakor a legkisebb összesített valószínûség értéke kisebb, mint körülbelül 1, elõnyösen kisebb, mint körülbelül 0,1, elõnyösebben kisebb, mint körülbelül 0,01 és még elõnyösebben kisebb, mint 0,001. Módosítások Szakember számára jól ismert, hogy adott polipeptid szerkezetében létrehozható néhány módosítás és változtatás anélkül, hogy a polipeptid biológiai funkcióját lényegében megváltoztatnánk, annak érdekében, hogy biológiailag ekvivalens polipeptidet kapjunk. A találmány egyik szempontja szerint, az LPL-terapeutikumok lehetnek olyan peptidek, amelyek konzervatív aminosavszubsztitúciókban különböznek a vad típusú LPL-szekvencia egy részétõl. A leírásban konzervatív aminosavszubsztitúció kifejezésen egy aminosav szubsztitúcióját értjük egy másik aminosavval a peptid adott pozíciójában, ahol a szubsztitúció a funkció elvesztése nélkül elvégezhetõ. Ilyen változtatások végrehajtásakor hasonló aminosavak szubsztitúciója végezhetõ el, például oldallánc-szubsztituensek relatív hasonlósága alapján, például azok mérete, töltése, hidrofóbicitása, hidrofilitása és hasonlók alapján, és az ilyen szubsztitúcióknak a peptid funkciójára kifejtett hatása szokásos eljárásokkal vizsgálható. A találmány egyes megvalósítási módja szerint, konzervált aminosavszubsztitúciók hozhatók létre, ha egy aminosavcsoportot olyan más aminosavcsoporttal helyettesítünk, amely hasonló (azaz plusz vagy mínusz 2,0 értéken belüli) hidrofilitási értéket mutat, ahol az aminosavcsoportokhoz az alábbi hidrofilitási értékeket rendeljük hozzá (amint azt a számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi): Arg (+3,0); Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2); Gln (+0,2); Gly (0); Pro ( 0,5); Thr ( 0,4); Ala ( 0,5); His ( 0,5); Cys ( 1,0); Met ( 1,3); Val ( 1,5); Leu ( 1,8); Ile ( 1,8); Tyr ( 2,3); Phe ( 2,5); és Trp ( 3,4). A találmány további megvalósítási módjai szerint, konzervált aminosavszubsztitúciók hozhatók létre, ha egy aminosavcsoportot olyan más aminosavcsoporttal helyettesítünk, amely hasonló (azaz plusz vagy mínusz 2,0 értéken belüli) hidropátiás indexû. Az ilyen megvalósítási módok szerint, minden aminosavcsoporthoz 5

6 1 HU T2 2 hidropátiás index rendelhetõ hozzá, hidrofóbicitási és töltési jellemzõik alapján, az alábbiak szerint: Ile (+4,5); Val (+4,2); Leu (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8); Gly ( 0,4); Thr ( 0,7); Ser ( 0,8); Trp ( 0,9); Tyr ( 1,3); Pro ( 1,6); His ( 3,2); Glu ( 3,5); Gln ( 3,5); Asp ( 3,5); Asn ( 3,5); Lys ( 3,9); és Arg ( 4,5). Más megvalósítási módok szerint, konzervált aminosavszubsztitúciók hozhatók létre, ha egy aminosavat egy másik, azonos osztályba tartozó aminosavval helyettesítünk, ahol az aminosavakat nem poláris, savas, lúgos és semleges osztályokba soroljuk, az alábbiak szerint: nem poláris: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; savas: Asp, Glu; lúgos: Lys, Arg, His; semleges: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr. Génterápia A találmány egy megvalósítási módja szerint, az LPL-terapeutikumot génterápiás vektorban adjuk be arra rászoruló egyénnek. Vektorok különbözõ típusú vírusokból állíthatók elõ, beleértve adenovírusokat, adenoasszociált vírusokat ( adeno-associated viruses, AAV), herpeszvírusokat (HSV), lentivírusokat és retrovírusokat. A találmány egy megvalósítási módja szerint, az AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 és AAV8 szerotípusok közül választott AAV-szerotípust alkalmazunk. Szakmában járatos személy képes a legmegfelelõbb vírus vagy vírus-szubtípus kiválasztására. Bizonyos szövettípusok esetében néhány szubtípus inkább megfelelõ, mint mások. Például, az LPL izomspecifikus, nagymértékû expresszálódása elõnyösen indukálható izomsejtek AAV-közvetített transzdukciója révén. Az izom fogékony AAV-mediálta transzdukcióra, és különbözõ szerotípusok alkalmazhatók (AAV1, AAV6, AAV7, AAV8). Izmok transzdukciója AAV-LPL több helyre történõ, intramuszkuláris injektálásával végezhetõ. A több helyre történõ injektálás és alacsonyan tartott lokális vírusdózis segít az LPL által indukált miopátia vagy vektor által indukált immunválaszok megelõzésében. Ez hatásos eljárásnak bizonyult izom hosszú távú transzdukciójára az 1¹es szerotípus esetében, azonban más szerotípusokat alkalmazó, intravénás beadás szintén alkalmazható (AAV6, AAV8). Génterápiára alkalmas általános eljárások szakember számára jól ismertek. Lásd például Anderson és munkatársai: számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást (amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi). Genetikai anyag bevitelére alkalmas, biokompatibilis kapszulát ismertetnek Baetge és munkatársai a WO 95/ számú PCT közzétételi iratban. Hematopoetikus sejtekbe történõ géntranszferre alkalmas eljárásokat szintén leírtak a korábbiakban [lásd Clapp, D. W. és munkatársai: Blood 78, (1991); Anderson: Science 288, (2000); és Cavazzana-Calvo és munkatársai: Science 288, (2000)] Hatékony mennyiségek A találmány szerinti kezelés során, nem alkoholos eredetû stetohepatitist kezelünk úgy, hogy arra rászoruló egyénnek LPL-terapeutikum hatékony mennyiségét adjuk be. A leírásban nem alkoholos eredetû steatohepatitis alatt olyan szövettani elváltozások kialakulását értjük, amelyek hasonlók a túlzott alkoholfogyasztás által kiváltottakhoz, azonban túlzott alkoholbevitel nélkül alakulnak ki. Az LPL-terapeutikumot jellemzõen gyógyászati készítményben szereljük ki, elõnyösen gyógyászatilag elfogadható vivõanyaggal, hígítóanyaggal és/vagy adjuvánssal együtt. Az ilyen készítmény az LPL-terapeutikumot és a gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy vivõanyagot olyan hatékony mennyiségben tartalmazza, amely elegendõ a terápiás vagy profilaktikus hatás kiváltásához. A hatékony mennyiség kifejezésen terápiásan hatékony mennyiséget és profilaktikusan hatékony mennyiséget egyaránt értünk. Terápiásan hatékony mennyiségen olyan mennyiséget értük, amely a szükséges dózisokban és idõtartam mellett alkalmazva hatékony ahhoz, hogy kívánt terápiás eredményt érjünk el, például a lipid-anyagcsere paramétereinek megváltoztatását, például az LPLaktivitás fokozódását, a HDL-koleszterinszint emelkedését és a trigliceridszint mérséklését. Adott LPL-terapeutikum terápiásan hatékony mennyisége változó lehet olyan tényezõk függvényében, mint például a betegség stádiuma, az egyén életkora, neme és testtömege, valamint az LPL-terapeutikum azon képessége, hogy az egyénben kívánt választ váltson ki. Az adagolási rend beállítható úgy, hogy az optimális terápiás választ váltsa ki. Ezenfelül, a terápiásan hatékony mennyiség tipikusan olyan mennyiség, amely mellett az LPL-terapeutikum bármely toxikus vagy káros hatása elhanyagolható a terápiásan elõnyös hatásokhoz képest. Profilaktikusan hatékony mennyiségen olyan mennyiséget értük, amely a szükséges dózisokban és idõtartam mellett alkalmazva hatékony ahhoz, hogy kívánt profilaktikus eredményt érjünk el, például különbözõ olyan állapotok megelõzését és gátlását, mint például LPL¹re válaszoló állapotok, például koszorúér-eredetû szívbetegség, szív-keringési betegség, koszorúér-artéria betegség, magas triglicerid- és/vagy alacsony HDL-szint. Profilaktikus adag beadható egyéneknek betegségüket megelõzõen, vagy betegségük korai szakaszában, és a profilaktikusan hatékony mennyiség adott esetben lehet több, vagy kevesebb mint a terápiásan hatékony mennyiség. Közelebbi megvalósítási módok szerint, az LPL-terapeutikum terápiásan vagy profilaktikusan hatékony mennyiségei a következõ tartományokba eshetnek: 0,01 nm 0,1 M, 0,1 nm 0,1 M, 0,1 nm 0,05 M, 0,05 nm 15 M vagy 0,01 nm 10 M. Megjegyzendõ, hogy az adagok változhatnak a javítandó állapot súlyossága szerint. Adott egyén esetében, a specifikus adagolási rendet a készítményt beadó vagy a készítmény beadását felügyelõ személy szakmai megítélése alapján és az egyén szükséglete szerint idõvel módosíthatja. A fenti adagolási tartományok kizárólag példaként szolgálnak, és azok nem korlátozzák a gyakorló orvos által választható adagolási tartományokat. 6

7 1 HU T Génterápiás vektorok esetében, a beadható adagok nagymértékben függenek a kezelendõ egyén állapotától, testméreteitõl, valamint a terápiás készítménytõl, a kezelés gyakoriságától és a beadás módjától. A terápia folytatásának a rendjét, például a dózist, készítményt és gyakoriságot a kezdeti válasz és a klinikai állapot megítélése vezérelheti. Elõnyös lehet szövetek intersticiális üregeibe, parenterális úton történõ injektálás, bár specifikus beadás során más parenterális beadási út, például aeroszolkészítmény belélegeztetése lehet indokolt. Egyes beadási rendek szerint, a gént vagy génbeviteli rendszert vizes hordozóban tartalmazó készítmény megfelelõ mennyiségét injektáljuk szövetbe. A célszövet lehet specifikus, például izom- vagy májszövet, vagy lehet több szövet kombinációja, például izom- és májszövet. Célzott szövet lehet például a máj, vázizomzat, szívizom, zsírraktár, vese, tüdõ, erek endotheliuma, epithelialis és/vagy hemopoetikus sejtek. A találmány egy megvalósítási módja szerint, kis állatok (egerek) számára, intramuszkuláris injektálás esetén a hatékony dózistartomány és genom kópia ( genome copy, gc)/kg közé, és nagyobb állatok (macskák) és valószínûleg emberek esetében és gc/kg közé esik. Egerek esetében a transzgén-expresszálódás szintje, heparinos plazmából történõ LPL-meghatározás szerint, akár 300 ng/ml értéket érhet el (DaiNippon által forgalmazott, kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ ELISA-vizsgálattal meghatározva), és az egyszeri beadást követõen az expreszálódás hosszú ideig (> egy év) tart. A találmány szerinti készítményben az aktív hatóanyag mennyisége olyan tényezõk szerint változhat, mint például a betegség stádiuma, az egyén életkora, neme és testtömege. Az adagolási rend beállítható úgy, hogy az optimális terápiás választ váltsa ki. Például, beadható egyetlen bolus, beadható számos osztott adag adott idõtartam alatt, vagy az adag arányosan csökkenthetõ vagy fokozható a terápiás szituáció által diktált követelmények szerint. Elõnyös lehet parenterális készítmények adagolási egység formájában történõ kiszerelése, amelyek megkönnyítik a beadást, és egységessé teszik az adagolást. Adagolási egységforma alatt a leírásban fizikailag elkülönülõ egységeket értünk, amelyek kezelésre szoruló egyének számára egyedi adagokként szolgálnak; minden egység az aktív hatóanyag elõre meghatározott mennyiségét tartalmazza, amelyet úgy számoltak ki, hogy a szükséges, gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt a kívánt terápiás hatást váltsa ki. A találmány szerinti adagolási egység formájú készítmény specifikációját az aktív hatóanyag egyedi jellemzõi és az adott, elérendõ terápiás hatás, valamint egyénekben egy adott állapot kezelésére alkalmas hatóanyag elõállításának belsõ korlátai szabják meg. A leírásban gyógyászatilag elfogadható hordozó vagy vivõanyag kifejezések alatt minden olyan oldószert, diszperziós közeget, bevonóanyagot, baktériumvagy gombaellenes ágenst, izotóniát biztosító és felszívódást késleltetõ szert és hasonlókat értünk, amelyek fiziológiásan kompatibilisek. A találmány egy megvalósítási módja szerint, a hordozó alkalmas parenterális beadásra, amely lehet intravénás, intraperitoneális, vagy intramuszkuláris beadás. Más megoldás szerint, a hordozó alkalmas lehet nyelv alatti (szublingvális) vagy orális beadásra. Gyógyászatilag elfogadható hordozók közé tartoznak steril vizes oldatok vagy diszperziók és steril porok, amelyekbõl vényre készült, steril, injektálható oldatok vagy diszperziók állíthatók elõ. Az ilyen közegek és ágensek gyógyászatilag aktív készítményekben történõ alkalmazása szakember számára jól ismert. A találmány szerinti készítményekben bármely szokásos közeg vagy ágens alkalmazása mérlegelendõ, kivéve, ha azok nem kompatibilisek az aktív hatóanyaggal. A találmány szerinti gyógyhatású készítmények tartalmazhatnak kiegészítõ aktív hatóanyagokat. További terapeutikumok együtt történõ beadására vonatkozó irányelvek találhatók például a Kanadai Gyógyszerész Szövetség ( Canadian Pharmacists Asociation ) Compendium of Pharmaceutical and Specialties (CPS) kiadványában. Gyógyhatású készítmények általában sterilek és stabilak az elõállítás és tárolás során alkalmazott körülmények között. Gyógyhatású készítmények kiszerelhetõk oldat, mikroemulzió, liposzóma vagy más olyan rendezett struktúra formájában, amely képes magában foglalni magas hatóanyag-koncentrációt. A hordozó lehet oldószer vagy diszperziós közeg, amely például vizet, etanolt, poliolt (például glicerint, propilénglikolt, folyékony polietilénglikolt és hasonlókat) és azok megfelelõ elegyét tartalmazza. A megfelelõ fluiditás fenntartható például olyan bevonóanyag alkalmazásával, mint például lecitin, diszperzió esetében a kívánt részecskenagyság fenntartásával, és felületaktív anyagok alkalmazásával. Számos esetben elõnyös izotóniás komponensek, például cukrok, polialkoholok, például mannitol, szorbitol vagy nátrium-klorid alkalmazása a készítményben. Injektálható készítmények késleltetett felszívódása úgy oldható meg, hogy a készítményhez felszívódást késleltetõ ágenst, például monosztearátsókat és zselatint adunk. Az LPL-terapeutikum beadható idõben késleltetett vagy szabályozottan felszabaduló készítményben, például olyan készítményben, amely lassan felszabaduló polimert, vagy más olyan hordozót tartalmaz, amely meggátolja a hatóanyag gyors felszabadulását, például implantátumokban és mikrokapszulázott beviteli rendszerekben. Alkalmazhatók például biodegradálható és biokompatibilis polimerek, például etilén-vinil-acetát, polianhidridek, poliglikolsav, kollagén, poliortoészterek, politejsav és politejsav-poliglikol kopolimerek (PLG). Ilyen készítmények elõállítására alkalmas számos eljárás áll szabadalmi oltalom alatt, vagy szakember számára jól ismert. Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: A találmány egy megvalósítási módja szerinti LPL-terapeutikum, azaz az S447X-protein szekvenciája. 2. ábra: LPL mrns-szekvencia. A nukleotidok az érett, vad típusú LPL-peptidet kódolják. 7

8 1 HU T2 2 Példák 1. példa: LPL génterápia trigliceridek újraelosztását váltja ki Ebben a példában AAV1-LPLS447X transzgén étrenddel indukált hiperlipidémiára gyakorolt hatását vizsgáltuk hím APOE3-Leiden transzgenikus egerekben. Ebbõl a célból, hat egérbe gc/kg AAV1-LPL S447X transzgént, míg hat egérbe PBS¹t injektáltunk (intramuszkulárisan, 4 helyre elosztva). Egy hét elteltével az egereket Western típusú táplálékra állítottuk. Az étrend bevezetését követõ 28. napon az állatokat leöltük. Az eredmények azt mutatják, hogy az LPL génterápián átesett egerek a?8/4 heparinozás utáni LPL-koncentráció fokozatos emelkedett, amely 25 héttel az injektálást követõen akár 300 ng/ml koncentrációt ért el, azonban a teljes heparinozás utáni lipázaktivitás nem változott szignifikáns mértékben. Ezen túlmenõen, 4 óra éheztetést követõen nem tapasztaltunk hatást a plazma TG¹, HDL¹c és TC¹szintjére. Annak ellenére, hogy a keringõ lipoproteinkoncentrációra gyakorolt hatás nem volt kimutatható, az LPL-génterápia annyiban hatásosnak bizonyult, hogy a kezelt egerek Intralipid bolusban történõ intravénás beadását követõen gyorsabb TG¹ és FFA-clearencet mutattak (p<0,05). További jelentõs megfigyelés volt az AAV1-LPL S447X-kezelt egerek szignifikáns mértékben csökkent súlygyarapodása a kontrollokhoz képest (p<0,05), amely hatás nem volt hasi zsírtömeg különbségnek tulajdonítható. Az AAVl-S447X-kezelt egerek izomhomogenizátumai szignifikáns mértékben emelkedett trigliceridtartalomra utaltak (p<0,05), míg a májhomogenizátumok a trigliceridtartalom szignifikáns mértékû csökkenését mutatták a kontrollokhoz képest (p<0,05). Ez a példa azt szemlélteti, hogy éhezési lipidekre gyakorolt hatás hiánya mellett, a humán LPL expresszálódása az egér vázizomzatban trigliceridek újraelosztását és súlygyarapodás mérséklését váltja ki. 1. táblázat Humán LPL koncentrációja heparinozott plazmában, AAV1-S447X injektálását követõen 0. hét 1. hét 11. hét 25. hét Átlag (ng/ml) Standard deviáció táblázat Csúcs trigliceridek zsírtolerancia-vizsgálata, Intralipid injektálását követõ érték százalékában kifejezve Intralipid injektálása után eltelt idõ (perc) PBS csoport átlaga Standard deviáció AAV1-LPL csoport átlaga Standard deviáció p (t¹próba) <3 100,0 0,0 100,0 0, ,7 13,1 21,2 4,7 <0, ,3 5,3 5,1 2, ,6 1,1 2,5 0,9 3. táblázat Csúcs szabad zsírsavak zsírtolerancia-vizsgálata, Intralipid injektálását követõ érték százalékában kifejezve Intralipid-injektálás után eltelt idõ (perc) PBS csoport átlaga Standard deviáció AAV1-LPL csoport átlaga Standard deviáció p (t¹próba) <3 100,0 0,0 100,0 0, ,9 13,7 33,8 6,4 <0, ,0 5,9 12,8 4, ,3 2,8 11,5 3,1 SZEKVENCIALISTA <110> Amsterdams Medisch Centrum and Amsterdam Molecular Therapeutics <120> novel compounds for treatment of nonalcoholic steatotic hepatitis <130> P

9 HU T2 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Asp Gln Arg Arg Asp Phe Ile Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Glu Asp Thr Ala Glu Asp Thr Cys His Leu Ile Pro Gly Val Ala Glu Ser Val Ala Thr Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Met Val Ile His Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val Ala Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp Trp Leu Ser Arg Ala Gln Glu His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr Lys Leu Val Gly Gln Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Ala Ala Gly Ile Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val Asn Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala Glu Ala Pro Ser Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg Ser Ile Gly Ile Gln Lys Pro Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln Pro Gly Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val Ile Ala Glu Arg Gly Leu Gly Asp Val Asp Gln Leu Val Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile His Leu Phe Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu

10 HU T2 Asn Pro Ser Lys Ala Tyr Arg Cys Ser Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys Gly Leu Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Asn Leu Gly Tyr Glu Ile Asn Lys Val Arg Ala Lys Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ser Gln Met Pro Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile His Phe Ser Gly Thr Glu Ser Glu Thr His Thr Asn Gln Ala Phe Glu Ile Ser Leu Tyr Gly Thr Val Ala Glu Ser Glu Asn Ile Pro Phe Thr Leu Pro Glu Val Ser Thr Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr Glu Val Asp Ile Gly Glu Leu Leu Met Leu Lys Leu Lys Trp Lys Ser Asp Ser Tyr Phe Ser Trp Ser Asp Trp Trp Ser Ser Pro Gly Phe Ala Ile Gln Lys Ile Arg Val Lys Ala Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile Phe Cys Ser Arg Glu Lys Val Ser His Leu Gln Lys Gly Lys Ala Pro Ala Val Phe Val Lys Cys His Asp Lys Ser Leu Asn Lys Lys <210> 2 <211> 3549 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cccctcttcc tcctcctcaa gggaaagctg cccacttcta gctgccctgc catccccttt 60 aaagggcgac ttgctcagcg ccaaaccgcg gctccagccc tctccagcct ccggctcagc 120 cggctcatca gtcggtccgc gccttgcagc tcctccagag ggacgcgccc cgagatggag 180 agcaaagccc tgctcgtgct gactctggcc gtgtggctcc agagtctgac cgcctcccgc 240 ggaggggtgg ccgccgccga ccaaagaaga gattttatcg acatcgaaag taaatttgcc 300 ctaaggaccc ctgaagacac agctgaggac acttgccacc tcattcccgg agtagcagag 360 tccgtggcta cctgtcattt caatcacagc agcaaaacct tcatggtgat ccatggctgg 420 acggtaacag gaatgtatga gagttgggtg ccaaaacttg tggccgccct gtacaagaga 480 gaaccagact ccaatgtcat tgtggtggac tggctgtcac gggctcagga gcattaccca 540 gtgtccgcgg gctacaccaa actggtggga caggatgtgg cccggtttat caactggatg 600 gaggaggagt ttaactaccc tctggacaat gtccatctct tgggatacag ccttggagcc 660 catgctgctg gcattgcagg aagtctgacc aataagaaag tcaacagaat tactggcctc 720 gatccagctg gacctaactt tgagtatgca gaagccccga gtcgtctttc tcctgatgat 780 gcagattttg tagacgtctt acacacattc accagagggt cccctggtcg aagcattgga 840 atccagaaac cagttgggca tgttgacatt tacccgaatg gaggtacttt tcagccagga 900 tgtaacattg gagaagctat ccgcgtgatt gcagagagag gacttggaga tgtggaccag 960 ctagtgaagt gctcccacga gcgctccatt catctcttca tcgactctct gttgaatgaa

11 1 HU T2 2 gaaaatccaa gtaaggccta caggtgcagt tccaaggaag cctttgagaa agggctctgc 1080 ttgagttgta gaaagaaccg ctgcaacaat ctgggctatg agatcaataa agtcagagcc 1140 aaaagaagca gcaaaatgta cctgaagact cgttctcaga tgccctacaa agtcttccat 1200 taccaagtaa agattcattt ttctgggact gagagtgaaa cccataccaa tcaggccttt 1260 gagatttctc tgtatggcac cgtggccgag agtgagaaca tcccattcac tctgcctgaa 1320 gtttccacaa ataagaccta ctccttccta atttacacag aggtagatat tggagaacta 1380 ctcatgttga agctcaaatg gaagagtgat tcatacttta gctggtcaga ctggtggagc 1440 agtcccggct tcgccattca gaagatcaga gtaaaagcag gagagactca gaaaaaggtg 1500 atcttctgtt ctagggagaa agtgtctcat ttgcagaaag gaaaggcacc tgcggtattt 1560 gtgaaatgcc atgacaagtc tctgaataag aagtcaggct gaaactgggc gaatctacag 1620 aacaaagaac ggcatgtgaa ttctgtgaag aatgaagtgg aggaagtaac ttttacaaaa 1680 catacccagt gtttggggtg tttcaaaagt ggattttcct gaatattaat cccagcccta 1740 cccttgttag ttattttagg agacagtctc aagcactaaa aagtggctaa ttcaatttat 1800 ggggtatagt ggccaaatag cacatcctcc aacgttaaaa gacagtggat catgaaaagt 1860 gctgttttgt cctttgagaa agaaataatt gtttgagcgc agagtaaaat aaggctcctt 1920 catgtggcgt attgggccat agcctataat tggttagaac ctcctatttt aattggaatt 1980 ctggatcttt cggactgagg ccttctcaaa ctttactcta agtctccaag aatacagaaa 2040 atgcttttcc gcggcacgaa tcagactcat ctacacagca gtatgaatga tgttttagaa 2100 tgattccctc ttgctattgg aatgtggtcc agacgtcaac caggaacatg taacttggag 2160 agggacgaag aaagggtctg ataaacacag aggttttaaa cagtccctac cattggcctg 2220 catcatgaca aagttacaaa ttcaaggaga tataaaatct agatcaatta attcttaata 2280 ggctttatcg tttattgctt aatccctctc tcccccttct tttttgtctc aagattatat 2340 tataataatg ttctctgggt aggtgttgaa aatgagcctg taatcctcag ctgacacata 2400 atttgaatgg tgcagaaaaa aaaaagatac cgtaatttta ttattagatt ctccaaatga 2460 ttttcatcaa tttaaaatca ttcaatatct gacagttact cttcagtttt aggcttacct 2520 tggtcatgct tcagttgtac ttccagtgcg tctcttttgt tcctggcttt gacatgaaaa 2580 gataggtttg agttcaaatt ttgcattgtg tgagcttcta cagattttag acaaggaccg 2640 tttttactaa gtaaaagggt ggagaggttc ctggggtgga ttcctaagca gtgcttgtaa 2700 accatcgcgt gcaatgagcc agatggagta ccatgagggt tgttatttgt tgtttttaac 2760 aactaatcaa gagtgagtga acaactattt ataaactaga tctcctattt ttcagaatgc 2820 tcttctacgt ataaatatga aatgataaag atgtcaaata tctcagaggc tatagctggg 2880 aacccgactg tgaaagtatg tgatatctga acacatacta gaaagctctg catgtgtgtt 2940 gtccttcagc ataattcgga agggaaaaca gtcgatcaag ggatgtattg gaacatgtcg 3000 gagtagaaat tgttcctgat gtgccagaac ttcgaccctt tctctgagag agatgatcgt 3060 gcctataaat agtaggacca atgttgtgat taacatcatc aggcttggaa tgaattctct 3120 ctaaaaataa aatgatgtat gatttgttgt tggcatcccc tttattaatt cattaaattt 3180 ctggatttgg gttgtgaccc agggtgcatt aacttaaaag attcactaaa gcagcacata 3240 gcactgggaa ctctggctcc gaaaaacttt gttatatata tcaaggatgt tctggcttta 3300 cattttattt attagctgta aatacatgtg tggatgtgta aatggagctt gtacatattg 3360 gaaaggtcat tgtggctatc tgcatttata aatgtgtggt gctaactgta tgtgtcttta 3420 tcagtgatgg tctcacagag ccaactcact cttatgaaat gggctttaac aaaacaagaa 3480 agaaacgtac ttaactgtgt gaagaaatgg aatcagcttt taataaaatt gacaacattt 3540 tattaccac 3549 SZABADALMI IGÉNYPONTOK Lipoproteinlipáz (LPL) terapeutikum alkalmazása egy alanyban nem alkoholos eredetû steatohepatitis kezelésére alkalmas gyógyszer elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az LPLterapeutikum a következõk közül választott: a) az 1. azonosító számú aminosavszekvenciájú (SEQ ID NO: 1) S447X protein, vagy annak származéka; b) LPL-protein, amelynek aminosavszekvenciája az 1. azonosító számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1) optimális összerendezést követõen legalább 90%¹os szekvenciaazonosságot mutató összefüggõ szegmenset tartalmaz, és amely legalább azonos mértékû vagy nagyobb LPL-aktivitású, mint az a) pont szerinti protein, vagy annak származéka; vagy c) az a) vagy b) pontok bármelyike szerinti proteint vagy származékát kódoló nukleinsav. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az LPL-terapeutikum olyan nukleinsavat tartalmaz, amely a 2. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO: 2) szerinti nukleotidokkal legalább 90%¹os azonosságot mutató RNS¹t kódoló DNS-kódolószekvenciát tartalmaz. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az LPL-terapeutikum olyan nukleinsav, amely a 2. azonosító számú szekvencia szerinti

12 1 HU T2 2 nukleotidokkal sztringens körülmények között hibridizálódó DNS-kódolószekvenciát tartalmaz. 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az LPL-terapeutikum LPL S447X-protein, amely az 1. azonosító számú szekvenciával legalább 95%¹os szekvenciaazonosságot mutató, összefüggõ szegmenset tartalmaz. 6. Az 1 5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az LPL-terapeutikum génterápiás vektorban adandó be az alanynak A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a génterápiás vektor vírusvektort is magában foglal. 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vírusvektor magában foglalja az adenoasszociált vírust (AAV). 9. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az alany ember. 10. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az LPL-terapeutikum parenterálisan adandó be. 12

13 HU T2 Int. Cl.: A61K 38/46 13

14 HU T2 Int. Cl.: A61K 38/46 14

15 HU T2 Int. Cl.: A61K 38/46 15

16 HU T2 Int. Cl.: A61K 38/46 16

17 HU T2 Int. Cl.: A61K 38/46 17

18 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest