(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: A61K 39/39 (06.01) C12P 21/08 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0417 PCT/US 04/0139 () Elsõbbségi adatok: P US (72) Feltalálók: RIVERA, Daniel, S., Nonwell, MA 061 (US); PETERS, Robert, T., West Roxbury, MA (US); BITONTI, Alan, J., Acton, MA 017 (US) (73) Jogosult: SYNTONIX PHARMACEUTICALS, INC., Waltham, MA 0241 (US) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Alvadásifaktor-Fc kiméra proteinek hemofília kezelésére HU T2 A leírás terjedelme 36 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 A bejelentésben a 03. május 6¹án benyújtott, /468,837 számú USA-beli ideiglenes bejelentés elsõbbségét igényeljük. A találmány alkalmazási területe A találmány tárgyát képezik általában terapeutikumok hemosztatikus rendellenességekre. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi hemosztatikus rendellenességek kezelésére szolgáló kiméra protein A találmány háttere A hemosztatikus rendellenességeket fibrinalvadék képzõdésének a hiányából vagy csökkent mértékébõl eredõ, szabályozatlan vérzés jellemzi. A hemosztatikus rendellenességek lehetnek genetikai hiba eredetûek, vagy lehetnek szerzettek, össze nem függõ egészségbeli állapot eredményeképpen (például rák és azzal összefüggõ kemoterápia, autoimmun betegség) [Kasper: Hemophilia 6,(supp) 13 (00); Cohen és mtsai.: Bailiere s Clinical Hematology 9,(2) 331 (1996)]. Hemosztatikus rendellenességek jellemzõen valamely specifikus véralvadási faktor hiánya miatt alakulnak ki. A hemosztatikus rendellenességek klasszikus példái közé tartoznak az A típusú hemofília, amelyet a VIII¹as faktor hiánya okoz; a B típusú hemofília, amelyet a IX¹es faktor hiánya vált ki; és von Willebrand-betegség, amelyet a von Willebrand-faktor hiánya idéz elõ. A von Willebrand-faktor a VIII¹as faktorral asszociáltan kering és azt stabilizálja. Mediálja a vérlemezkék tapadását egymáshoz és a sérült érfalakhoz. További, kevésbé gyakori hemosztatikus rendellenességek közé tartoznak a XI¹es faktor hiánya (PTA deficiencia), XII¹es faktor hiánya, valamint a fibrinogén, protrombin, V¹ös faktor, VII¹es faktor, X¹es faktor vagy XIII¹as faktor deficienciái vagy szerkezeti rendellenességei [Kasper: Hemophilia 6,(supp) 13 (00)]. Az alvadási faktorok egymással összhangban hatnak egy koagulációs kaszkádban, amely végül fibrinalvadék képzõdéséhez vezet (1. ábra). Ezek a faktorok létezhetnek csendes állapotban, proenzim vagy zimogén formában, vagy aktivált enzim állapotban, amikor alvadékképzõdés céljából aktiválódnak. A faktorok stimulálódása két elkülönülõ úton, belsõ ( intrinsic ) úton és külsõ ( extrinsic ) úton történhet. A belsõ út azokra a reakciókra utal, amelyek kizárólag a plazmában jelen levõ faktorok felhasználásán át vezetnek alvadék képzõdéséhez. Ezzel szemben, a külsõ út azokra a reakciókra utal, amelyek az erek endotéliumának károsodása során, membránhoz kötött szöveti faktorok felszabadulása révén vezetnek alvadék képzõdéséhez. A VII¹es faktor mindkét útban részt vesz azáltal, hogy a szöveti faktorral összefüggésben a X¹es faktort aktivált Xa faktorrá hasítja a külsõ útban, vagy kölcsönhatásba lép a IXa faktorral a belsõ útban. Amikor a külsõ úton keresztül hat, a VII¹es faktor lefelé irányban ( downstream ) és a VIII¹as és IX¹es faktoroktól függetlenül hat, ezáltal elkerüli, hogy ezekre a faktorokra szükség legyen. A VII¹es faktor ezért ígéretes terápiás jelölt hemosztatikus rendellenességek, elsõsorban A és B típusú hemofília kezelésére [US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi irat]. A VII¹es faktor a májban szintetizálódó, K¹vitaminfüggõ protein, amely egyláncú glikoprotein formájában szekretálódik a vérbe, 3 kda molekulatömeggel [Broze és mtsai.: J Biol Chem 2, 1242 (1980)]. A zimogén VII¹es faktor egyetlen helyen, az Arg12-Ile13 helyen történõ hasítással konvertálódik aktivált formára (FVIIa), amely két láncot, nehéz (24 aminosavat) és könnyû láncot (14 aminosavat) eredményez, amelyeket egyetlen diszulfidkötés kapcsol össze [Hagen és mtsai.: Proc. Natl. Acad Sci. USA 83, 2412 (1986)]. A VII¹es faktor aktivált formája szöveti faktorhoz kötõdik, amely ezt követõen a X¹es faktort Xa faktorrá konvertálja. A Xa faktor szükséges a protrombin trombinná konvertálásához, amely utóbbi a fibrinogént konvertálja fibrinné, a fibrinalvadék képzõdésének a végsõ fázisaként. A VII¹es faktor transzlációt követõ módosulásokon esik át, beleértve K¹vitamin-függõ karboxilezést, amely tíz ¹karboxiglutaminsav-csoportot eredményez a molekula N¹terminális régiójában. További, transzlációt követõ módosítások közé tartozik cukorcsoport kapcsolása két, természetben elõforduló, N¹kapcsolt glikozilezési helyen, rendre a 14 és 322 pozíciókban, valamint két, természetben elõforduló, O¹kapcsolt glikozilezési helyen, rendre az 2 és pozíciókban (WO 01/893 számú nemzetközi közzétételi irat). Hemosztatikus rendellenességek szokásos terápiája hiányzó alvadási faktorok, például VII¹es faktor, VIII¹as faktor vagy IX¹es faktor parenterális pótlását javasolja (lásd például az US és számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). A kezelés gyakran egyaránt tartalmazza alvadási faktorok beadását a heveny vérzési epizódok kezelésére, valamint alvadási faktorok beadását a jövõbeni vérzési epizódok elõfordulásának a profilaktikus elhárítására. Azt tapasztalták, hogy a profilaxis csökkenti a gyakori vérzési epizódokkal összefüggõ ízületi problémák és ízületi gyulladások kialakulásának a kockázatát [Petrini: Hemophilia 7, 99 (01); Fischer és mtsai.: Blood 99,(7) 2337 (02)]. A szokásos terápiák azonban számos problémával járnak. Jelenleg az alvadási faktorokat parenterálisan kell beadni hatásos dózis fenntartása céljából, mivel napjainkban nem invazív eljárásokkal nem sikerül terápiás szintek fenntartása. Parenterális beadással járó problémák közé tartoznak az injektálási hely elzáródása, fájdalom és fertõzés. Bekötött katéter alkalmazása csak fokozza ilyen események kockázatát. Alvadási faktorok csecsemõknek és kisgyermekeknek történõ beadásával járó problémák közé tartozik a központi vénás megközelíthetõség. Ezen túlmenõen, alvadási faktorok parenterális beadása vérzési epizód kiváltásának a kockázatával jár. Ezek a problémák különösen relevánsak, ha a páciens alvadási faktor rendszeres profilaktikus beadására szorul. Olyan alvadási faktorokat, mint például a IX¹es és VIII¹as faktorokat, gyakran és nagy adagokban kell 2

3 1 HU T2 2 adni, ami a páciensek jelentõs hányadában az alvadási faktor elleni gátló ellenanyagok kialakulásához vezet [lásd például Nilsson: Transfasion Medicine Review 6,(4) 28 (1992); Cohen és mtsai.: Bailiere s Clinical Hematology 9,(2) 331 (1996)]. Egyik szempontból, a találmány biztonságosabb és hatásosabb kezelést nyújt hemosztatikus rendellenességek kezelésére. Egy további szempontból, a találmány hosszabb felezõdési idõt és fokozott biológiai hozzáférhetõséget biztosít a hemosztatikus rendellenesség kezelésére alkalmazott, nem invazív úton beadott terapeutikumok számára, ezáltal csökkenti a parenterális alkalmazással járó vérzési epizód kiváltásának, fertõzésnek és az injektálási hely elzáródásának a kockázatát. A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi terápia hemosztatikus rendellenességre, amely a jelenleg alkalmazott, szokásos terápiákkal összehasonlítva, az alvadási faktor elleni gátló ellenanyagok kialakulásának a csökkent kockázatával jár. A találmány további szempontja szerint, a találmány tárgyát képezi hemosztatikus rendellenesség profilaktikus kezelése. A találmány szempontjai szerint, a találmány tárgyát képezi kiméra protein, amely legalább egy alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazza, és amelyben az alvadási faktor képes véralvadást és/vagy fibrinalvadék képzõdését elõsegíteni. Immunglobulin Fc¹részét tartalmazó kiméra proteinek ismertek [lásd például az US , és számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat és az US/02/2133 számú nemzetközi bejelentést], és bár alvadási aktivitást nem mutató, mutáns alvadási faktorokat és immunglobulinokat tartalmazó kiméra proteineket korábban ismertettek (WO 01/02439 és WO 01/022 számú nemzetközi közzétételi iratok), alvadási faktort (azaz alvadási aktivitást mutató faktort és immunglobulin legalább egy részét tartalmazó kiméra proteint csak thromboplastin esetében ismertettek (EP számú európai szabadalmi bejelentés). Alvadási faktor alatt, amint azt alább definiáljuk és a leírásban alkalmazzuk, bármely, a leírásban definiált alvadási aktivitást mutató molekulát értünk A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezi az 1. és. igénypontban ismertetett, javított kiméra protein, hemosztatikus rendellenességek kezelésére. A találmány tárgyát képezi az 1. és. igénypontban ismertetett, javított kiméra protein, amely beadható parenterálisan, vagy nem invazív úton (például pulmonálisan, nazálisan vagy orálisan). Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi az 1. és. igénypontban ismertetett, legalább egy alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazó kiméra protein. A találmány tárgyát képezi eljárás hemosztatikus rendellenesség kezelésére, amely eljárás tartalmazza legalább egy, az 1. és. igénypontban ismertetett alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazó kiméra protein terápiásan hatékony mennyiségének a beadását. A találmány tárgyát képezi eljárás legalább egy alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazó, az 1. és. igénypont szerinti kiméra protein elõállítására, amely eljárás tartalmazza sejt transzfektálását legalább egy alvadási faktort kódoló, elsõ DNS-szekvenciát tartalmazó DNSkonstrukcióval, amely operatív módon kapcsolódik immunglobulin legalább egy részét kódoló, második DNS-szekvenciával, a sejt tenyésztését olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik a protein expresszálódását, és a kiméra protein izolálását a sejtbõl. A találmány tárgyát képezi nukleinsavmolekula, amely legalább egy, az 1. és. igénypont szerinti alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét kódoló szekvenciát tartalmaz. A találmány tárgyát képezi nukleinsavkonstrukció, amely legalább egy, az 1. és. igénypont szerinti alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a koagulációs kaszkád külsõ és belsõ útját mutatja. A 2. ábra a VIIa¹Fc faktor inaktív és aktív formáit mutatja. A 3A. ábra VIIa faktort és immunglobulin Fc¹fragmensét tartalmazó kiméra protein aminosavszekvenciáját mutatja (SEQ ID NO 1). A 3B. ábra immunglobulin Fc¹fragmense aminosavszekvenciáját mutatja (SEQ ID NO 2). A 3C. ábra immunglobulin Fc¹fragmense nukleinsavszekvenciáját mutatja (SEQ ID NO 3). A 3D. ábra VIIa faktort és immunglobulin Fc¹fragmensét tartalmazó kiméra protein nukleinsavszekvenciáját mutatja (SEQ ID NO 4). A 4. ábra STA-CLOT vizsgálat eredményét mutatja, amely a VII¹Fc faktor jelentõs alvadási aktivitását illusztrálja. Az. ábra azt mutatja, hogy a VIIa¹Fc faktor kötõdik a humán eredetû Fc neonatális receptorhoz ( human Fc neonatal receptor, shfcrn). A 6. ábra orálisan adagolt VIIa¹Fc faktor plazmaszintjeit mutatja az idõ függvényében, újszülött patkányokban. A 7. ábra összehasonlítja a VIIa¹Fc faktor két polipeptidláncot tartalmazó, monomer/dimer hibridjeit, ahol az egyes láncok immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazzák, és ahol a VII¹es faktor a két lánc közül csak az egyikhez kapcsolódik, versus olyan homodimerekkel, amelyek két olyan polipeptidláncot tartalmaznak, amelyekben 3

4 1 HU T2 2 mindkét lánc tartalmazza immunglobulin konstans régiójának legalább egy részét, valamint mindkét lánc tartalmazza a VII¹es faktort is. A 8A. ábra törpesertéseknek intravénásan beadott VIIa¹Fc faktor plazmaszintjeit mutatja az idõ függvényében, ahol az VIIa¹Fc faktor monomer/dimer hibrid, amely két polipeptidláncot tartalmaz, és mindkét lánc immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazza, és ahol a VII¹es faktor a két lánc közül csak az egyikhez kapcsolódik. A 8B. ábra törpesertéseknek intravénásan beadott VIIa¹Fc faktor alvadási aktivitását mutatja az idõ függvényében, ahol az VIIa¹Fc faktor monomer/dimer hibrid, amely két polipeptidláncot tartalmaz, és mindkét lánc immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazza, és ahol a VII¹es faktor a két lánc közül csak az egyikhez kapcsolódik. A 9A. ábra a IX¹Fc faktor kiméra protein aminosavszekvenciáját mutatja. A szekvencia tartalmazza a szignálpeptidet (aláhúzva), amelyet a sejt hasít, valamint a propeptidet (vastagon szedve), amelyet a K¹vitamin-függõ ¹karboxiláz felismer, amely a IX¹es faktort teljes aktivitásúra módosítja. A szekvenciát ezt követõen PACE hasítja IX¹Fc faktorrá. A 9B. ábra a IX¹Fc faktor kiméra protein nukleinsavszekvenciáját mutatja. A szekvencia tartalmazza a szignálpeptidet (aláhúzva), valamint a propeptidet (vastagon szedve), amelyet a K¹vitamin-függõ ¹karboxiláz felismer, amely a IX¹es faktort teljes aktivitásúra módosítja. Az átírt szekvenciát ezt követõen PACE hasítja érett IX¹es faktor¹fc proteinné. Szekvenciák összefoglalása SEQ ID NO Ábra Ismertetés 1. 3A. VIIa faktort és IgG Fc¹fragmensét tartalmazó kiméra protein aminosavszekvenciája 2. 3B. IgG Fc¹fragmensének aminosavszekvenciája 3. 3C. a SEQ ID NO 2 szerinti aminosavszekvenciának megfelelõ nukleinsavszekvencia 4. 3D. a SEQ ID NO 1 szerinti aminosavszekvenciának megfelelõ nukleinsavszekvencia A megvalósítási módok ismertetése A. Definíciók A leírásban affinitási toldalék kifejezés alatt egy második kívánt molekulához kapcsolt elsõ molekulát értünk, amely egy specifikus kötõpartnerhez képes kötõdni abból a célból, hogy a második molekulát izolálhassuk vagy azonosíthassuk. A leírásban a találmány szerinti kiméra proteinek analógjai vagy a találmány szerinti kiméra proteinekkel lényegében identikus proteinek vagy peptidek alatt azt értjük, hogy adott protein vagy peptid releváns aminosavszekvenciája legalább 70, 7, 80, 8, 90, 9, 97, 98, 99 vagy 0%-ban identikus az adott szekvenciával. Az ilyen szekvenciák lehetnek például eltérõ fajból származtatott szekvenciák, vagy származhatnak az adott szekvenciából csonkolással, deletálással, aminosav helyettesítésével vagy hozzáadásával. Két aminosavszekvencia közötti azonosság százalékos mértéke szokásos összerendezési algoritmusokkal határozható meg, amilyenek például az Altschul és mtsai. által ismertetett Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [J. Mol. Biol. 21, 3 4 (1990)], Needleman és mtsai. algoritmusa [J. Mol. Biol. 48, (1970)], Meyers és mtsai. [Comput. Appl. Biosci. 4, (1988)] vagy Tatusova algoritmusa [FEMS Microbiol. Lett. 174, 247 ] és hasonlók. Ilyen algoritmusokat tartalmaznak a BLASTN, BLASTP és BLAST 2 Sequence programok (lásd Ilyen programok alkalmazásakor használhatjuk az alapértelmezett paramétereket. Nukleotidszekvenciák esetében például az alábbi beállításokat alkalmazhatjuk BLAST 2 Sequences programhoz: program=blastn; reward for match (illeszkedésért jutalom)=2; penalty for mismatch (hibás illeszkedésért büntetés)= 2; open gap penalty (nyitott hézag büntetése)= és extension gap penalty (lánchosszabbításból eredõ hézag büntetése)=2; gap x_dropoff=0; expect (elvárás)=; word size (szóméret) 11; filter ON. A leírásban biológiai hozzáférhetõség kifejezés alatt annak mértékét és ütemét értjük, ahogy egy adott anyag élõ rendszerbe felszívódik és a fiziológiai aktivitás helyén hozzáférhetõvé válik. A leírásban kiméra protein kifejezés alatt bármely olyan proteint értünk, amely egy elsõ forrásból származó aminosavszekvenciát tartalmaz kovalens vagy nem kovalens módon hozzákötve egy második forrásból származó aminosavszekvenciához, ahol az elsõ és második forrás nem azonos. A nem azonos elsõ és második forrás lehet két eltérõ biológiai entitás, azonos biológiai entitásból származó, két eltérõ protein, vagy egy biológiai entitás és egy nem biológiai entitás. Adott kiméra protein lehet például 2 eltérõ biológiai forrásból származtatott protein. Biológiai forrás lehet bármely, nem szintetikusan elõállított nukleinsav- vagy aminosavszekvencia (például genomiális vagy cdns-szekvencia, plazmid vagy virális vektor, natív virion, vagy ezek bármelyikének a mutánsa vagy analógja, amint azt alább ismertetjük. Szintetikus forrás lehet például olyan protein vagy nukleinsavszekvencia, amelyet vegyi úton, és nem biológiai rendszerben állítottak elõ 4

5 1 HU T2 2 (például aminosavszekvenciák szilárd fázisú szintézisével). Adott kiméra protein tartalmazhat két eltérõ szintetikus forrásból származó proteint, vagy legalább egy biológiai és egy szintetikus forrásból származó proteint. A leírásban alvadási faktor kifejezés alatt bármely, természetben elõforduló vagy rekombináns eljárással elõállított molekulát értünk, amely hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alanyban megakadályozza vérzéses epizód kialakulását vagy annak idõtartamát csökkenti, amint azt a leírásban ismertetjük. A leírásban alvadási aktivitás kifejezés alatt biokémiai reakciók kaszkádjában való részvétel képességét értjük, amely biokémiai kaszkád fibrinalvadék képzõdésében és/vagy vérzés vagy vérzési epizódok súlyosságának, idõtartamának vagy gyakoriságának a csökkenésében nyilvánul meg. A leírásban DNS-konstrukció alatt olyan egyvagy kettõs szálú DNS-molekulát, vagy DNS-molekula klónját értünk, amelyet emberi beavatkozással módosítottak abból a célból, hogy olyan módon kombinált DNS-szegmenseket tartalmazzon, amelyek összességükben a természetben nem fordulnak elõ. A DNSkonstrukciók tartalmazzák kívánt polipeptidek expresszálódásának irányításához szükséges információt. A DNS-konstrukciók tartalmazhatnak promotereket, enhancereket és transzkripció terminátorokat. Olyan DNS-konstrukciók, amelyek polipeptid szekretálásának irányításához szükséges információt tartalmaznak, tartalmazniuk kell továbbá legalább egy szekréciós szignálszekvenciát. A leírásban fragmens kifejezés alatt peptidet vagy polipeptidet értünk, amely legalább 2 szomszédos aminosavcsoportot, legalább szomszédos aminosavcsoportot, legalább szomszédos aminosavcsoportot, legalább 1 szomszédos aminosavcsoportot, legalább szomszédos aminosavcsoportot, legalább 2 szomszédos aminosavcsoportot, legalább szomszédos aminosavcsoportot, legalább 0 szomszédos aminosavcsoportot, legalább 0 szomszédos aminosavcsoportot, vagy legalább 0 szomszédos aminosavcsoportot tartalmaz, vagy tartalmazza adott protein bármely deletált vagy csonkolt részét. A leírásban hemosztázis kifejezés alatt vérzés megállítását, vagy vérnek ereken vagy testrészeken át történõ áramlásának a megállítását értjük. A leírásban hemosztatikus rendellenesség kifejezés alatt genetikailag öröklött, vagy szerzett állapotot értünk, amelyet spontán vagy traumát követõ vérzési hajlam jellemez, amely fibrinalvadék elégtelen képzõdésének vagy képzõdése hiányának tulajdonítható. A leírásban kapcsolt kifejezés alatt azt értjük, hogy egy elsõ nukleinsavszekvencia kovalens módon kapcsolódik egy második nukleinsavszekvenciához. Az elsõ nukleinsavszekvencia kapcsolódhat közvetlenül vagy egymás mellé helyezve ( juxtaposed ) a második nukleinsavszekvenciához, vagy más megoldás szerint, egy közbeesõ szekvencia kapcsolhatja kovalens módon az elsõ nukleinsavszekvenciát a második nukleinsavszekvenciához. A leírásban kapcsolt kifejezés alatt azt is értjük, hogy egy elsõ aminosavszekvencia kovalens módon kapcsolódik egy második aminosavszekvenciához. Az elsõ aminosavszekvencia kapcsolódhat közvetlenül vagy egymás mellé helyezve ( juxtaposed ) a második aminosavszekvenciához, vagy más megoldás szerint, egy közbeesõ szekvencia kapcsolhatja kovalens módon az elsõ aminosavszekvenciát a második aminosavszekvenciához. A leírásban kapcsolt kifejezés alatt azt is értjük, hogy egy elsõ aminosavszekvencia nem kovalens módon kapcsolódik egy második aminosavszekvenciához. A leírásban kapcsolt kifejezés alatt azt is értjük, hogy egy elsõ aminosavszekvencia kovalens módon kapcsolódik egy nukleinsavszekvenciához vagy kisméretû szerves vagy szervetlen molekulához. A leírásban operatív módon kapcsolt kifejezés alatt azt értjük, hogy egy elsõ nukleinsavszekvencia úgy kapcsolódik egy második nukleinsavszekvenciával, hogy mindkét szekvencia képes biológiailag aktív polipeptidként expresszálódni. A leírásban kisméretû szervetlen molekula kifejezés alatt 0 kd molekulatömegûnél nem nagyobb, és szénatomot nem tartalmazó molekulát értünk. A leírásban kisméretû szerves molekula kifejezés alatt 0 kd molekulatömegûnél nem nagyobb, és legalább egy szénatomot tartalmazó molekulát értünk. A leírásban nagymértékben stringens körülmények közé olyan körülmények tartoznak, amelyeket szakember könnyen meghatározhat, például a DNS hossza alapján. Az ilyen körülményeket általában mint hibridizációs körülményeket határoznak meg a fentiek szerint, és körülbelül 68 C¹os mosásokkal (0,2 X SSC, 0,1% SDS). Szakember számára nyilvánvaló, hogy a hõmérséklet és a mosóoldat sókoncentrációja szükség szerint állítható olyan tényezõk szerint, mint a próba hossza. A leírásban mérsékelt stringens körülmények közé olyan körülmények tartoznak, amelyeket szakember könnyen meghatározhat, például a DNS hossza alapján. Az alapvetõ körülményeket Sambrook és mtsai. ismertetik [ Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. kiadás 1, 11 4 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], és idetartozik elõmosó oldat alkalmazása a nitrocellulóz filterekhez ( X SSC, 0,% SDS, 1,0 mmol/l EDTA ph=8,0), 0%¹os formamidot (6 X SSC, 42 C¹on) alkalmazó hibridizálási körülmények (vagy más hibridizálási oldat, például Stark oldat, 0%¹os formamidban, 42 C¹on), és C¹os mosási körülmények (0, X SSC, 0,1% SDS). A leírásban polipeptid kifejezés alatt aminosavak polimerét értjük, és az nem utal adott termék specifikus hosszára; ennek megfelelõen, a polipeptid definíciójába tartoznak peptidek, oligopeptidek és proteinek. A kifejezés nem zárja ki a polipeptid expresszálódást követõ módosulásait, például glikozilezést, acetilezést, foszforilezést, pegilezést, lipidrész hozzáadását, vagy bármely szerves vagy szervetlen molekula hozzáadását. A definícióba tartoznak például egy aminosav egy vagy több analógját (például nem természetes aminosavat) tartalmazó polipeptidek és helyettesített kötéseket tar-

6 1 HU T2 2 talmazó polipeptidek, továbbá szakember által ismert, természetben elõforduló és nem elõforduló további módosítások. A leírásban kezel, kezelni, kezelés kifejezés alatt az alábbiak közül bármelyiket értjük: hemosztatikus rendellenesség súlyosságának a mérséklését; hemosztatikus rendellenességgel összefüggõ egy vagy több tünet, például vérzési epizód megelõzését; hemosztatikus rendellenesség lefolyása idõtartamának a csökkentését; hemosztatikus rendellenességgel összefüggõ egy vagy több tünet enyhítését; hemosztatikus rendellenességgel összefüggõ vérzési epizód idõtartamának a csökkentését; alvadási faktor elleni gátló ellenanyag titerének a csökkentését; elõnyös hatás elérését hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alanynál anélkül, hogy a hemosztatikus rendellenességet feltétlenül meggyógyítanánk. B. Javított terapeutikumok hemosztatikus rendellenességekre Általánosságban, a találmány tárgyát képezik javított terapeutikumok hemosztatikus rendellenességekre. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi a leírás szerinti, legalább egy alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazó kiméra protein. A találmány szerinti kiméra proteinek alvadási tulajdonságú, ismert terápiás ágensekkel összehasonlítva fokozott stabilitást és más elõnyös tulajdonságokat mutatnak. Beadhatók továbbá parenterálisan vagy nem invazív módon. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezik javított eljárások alvadási aktivitású terápiás ágensek beadására. Míg jelenleg az alvadási faktorokat általában szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásan adják be, a találmány szerinti kiméra proteinek kevésbé invazív út alkalmazásával adhatók be, például szájon át történõ beadással, nazálisan történõ beadással vagy pulmonális beadással. Egy specifikus megvalósítási mód szerint, a találmány szerinti kiméra proteinek elõnyösen alkalmazhatók hemosztatikus rendellenességek megelõzõ kezelésére. Általánosságban, a találmány tárgyát képezik javított eljárások terápiás alvadási faktorok elõállítására. A találmány tárgyát képezik rekombináns eljárások fokozottan expresszálódó és javított hozamú terápiás alvadási faktorok elõállítására. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezik eljárások legalább egy alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazó kiméra proteinek elõállítására azáltal, hogy sejtet DNS-konstrukcióval transzfektálunk, amely konstrukció legalább egy alvadási faktort kódoló DNS¹t és immunglobulin konstans régió legalább egy részét kódoló DNS¹t tartalmaz; a sejt tenyésztésére olyan körülmények mellett, amelyek lehetõvé teszik a kiméra protein expresszálódását a fenti sejtben; és a fenti kiméra protein izolálására C. Kiméra proteinek Általánosságban a találmány tárgyát képezik kiméra proteinek, amelyek legalább egy, a leírás szerinti alvadási faktort, immunglobulin konstans régió legalább egy részét és adott esetben egy összekötõ (linker) részt tartalmaznak. Az alvadási faktor kapcsolódhat kovalens módon, vagy nem kovalens módon az immunglobulin konstans régiórészével. Az immunglobulin konstans régiórésznek N¹terminális, azaz amino-terminális vége és C¹terminális, azaz karboxi-terminális vége van. Az egyik megvalósítási mód szerint, a találmány szerinti kiméra protein az alvadási faktort az immunglobulin konstans régiórész N¹terminális végén hordozza. A kiméra protein adott esetben legalább egy összekötõ szekvenciát tartalmazhat, így az alvadási faktort nem kell közvetlenül az immunglobulin konstans régiórészhez kapcsolni. Az összekötõ szekvencia az alvadási faktor és az immunglobulin konstans régiórész között helyezkedhet el. Az összekötõ szekvencia kapcsolódhat az immunglobulin konstans régiórész N¹terminális végéhez, vagy az immunglobulin konstans régiórész C¹terminális végéhez. Az összekötõ szekvencia kapcsolódhat az alvadási faktor N¹terminális végéhez. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi kiméraprotein, amely a leírásban ismertetett, legalább egy alvadási faktort (X), adott esetben összekötõ szekvenciát ( linker, L), valamint immunglobulin konstans régió legalább egy részét (F) tartalmazza. Az egyik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát képezi az alábbi képlet szerinti kiméra protein: X-L a -F ahol X C¹terminális végénél kapcsolódik L N¹terminális végéhez, és L C¹terminális végén kapcsolódik F N¹terminális végéhez, és ahol a jelentése egész szám vagy nulla. Amikor a egyenlõ nullával, X C¹terminális végénél közvetlenül kapcsolódik F N¹terminális végéhez. Például, a korlátozás szándéka nélkül, a lehet 0, 1, 2, 3, 4,, vagy. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi kiméra protein, amely a 3A. ábra szerinti aminosavszekvenciát (SEQ ID NO 1) tartalmazza. A találmány szerinti kiméra proteinek közé tartoznak monomerek, dimerek, valamint magasabb rendû multimerek. Az egyik megvalósítási mód szerint, a kiméra protein monomer, amely egyetlen alvadási faktort és egyetlen immunglobulin konstans régiórészt tartalmaz. Egy további megvalósítási mód szerint, a kiméra protein dimer, amely két alvadási faktort és két immunglobulinrészt tartalmaz. Az egyik megvalósítási mód szerint, a két alvadási faktor azonos. Az egyik megvalósítási mód szerint, a két alvadási faktor eltérõ. Az egyik megvalósítási mód szerint, a két immunglobulinrész azonos. Az egyik megvalósítási mód szerint, a két immunglobulinrész eltérõ. Az egyik megvalósítási mód szerint, a kiméra protein monomer/dimer hibrid, ahol a kiméra protein dimer jellegû abban az értelemben, hogy két immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazza, és monomer jellegû abban az értelemben, hogy csak egyetlen alvadási faktort tartalmaz, amely a kétimmunglobulin közül csak az egyikhez kapcsolódik. A találmány tárgyát képezi kiméra protein, 6

7 1 HU T2 2 amely egy elsõ láncot és egy második láncot tartalmaz, ahol az elsõ lánc immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazza alvadási faktorhoz kapcsolva, és a fenti második lánc immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazza, hozzákapcsolt alvadási faktor nélkül. Ilyen kiméra proteinek az 1. táblázat szerinti képletekkel írhatók le, ahol X, L és F jelentése a fentiek szerinti, és ahol ( ) jelentése eltérõ molekula, mint a ( ) nélküli, és ahol (:) jelentése nempeptid kötés. 1. táblázat X¹F:F¹X X ¹F:F¹X X-L¹F:F¹X X-L¹F:F-L¹X X -L¹F:F-L¹X X-L ¹F:F-L¹X X -L ¹F:F-L¹X F:F¹X F:F-L¹X X¹F:F X-L¹F:F L¹F:F¹X X¹F:F¹L Szakember számára nyilvánvaló, hogy további kombinációk lehetségesek, beleértve további összekötõ szekvenciák alkalmazását Kiméra protein variánsok A találmány szerinti kiméra proteinek származékai és analógjai, a találmány szerinti kiméra proteinek elleni ellenanyagok, valamint a találmány szerinti kiméra proteinek kötõpartnerei elleni ellenanyagok mind a találmány oltalmi körébe tartoznak és elõállíthatók aminosavszekvenciájuk módosításával, helyettesítések, hozzáadások és/vagy deléciók/csonkolások révén, vagy kémiai módosulások bevitelével, ami funkcionálisan ekvivalens molekulákat eredményez. Szakember számára nyilvánvaló, hogy bármely protein szekvenciájában bizonyos aminosavak más aminosavakra cserélhetõk anélkül, hogy az hátrányosan befolyásolná a protein aktivitását. A találmány szerinti kiméra proteinekben és az azokat kódoló DNS-ben számos változtatás végezhetõ anélkül, hogy biológiai aktivitásukban, funkciójukban vagy alkalmazhatóságukban észrevehetõ veszteség következne be. Az ilyen változtatásokból származó származékok, analógok vagy mutánsok a találmány oltalmi körébe tartoznak. Egy specifikus megvalósítási mód szerint, a származék funkcionálisan aktív, azaz mutatja a találmány szerinti kiméra proteinnel összefüggõ egy vagy több aktivitást, például alvadék képzõdését és/vagy alvadási faktor aktiválását. Az aktivitás mérése szakmában járatos személy által ismert vizsgálatokkal lehetséges, például StaCLot FVIIa-fTF vizsgálattal [Johannessen és mtsai.: Blood Coagulation and Fibrinolysis 11,S 19 (00)], protrombin idõvel (PT-vizsgálat) vagy APTT vizsgálattal IX¹es faktor meghatározására. Aminosavak szekvencián belüli helyettesítõi kiválaszthatók abból az osztályból, amelybe az aminosav tartozik (lásd a 2. táblázatot). Ezen túlmenõen, számos aminosavat gyakran helyettesítenek neutrális aminosavak, például alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofán és metionin [lásd például MacLennan és mtsai.: Acta Physiol. Scand Suppl. 643, 67 (1998); Sasaki és mtsai.: Adv. Biophys. 3, 1 24 (1998)]. Eredeti csoport 2. táblázat Példák helyettesítésekre Jellemzõ helyettesítések Ala (A) Val, Leu, Ile Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Asn (N) Gln Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser, Ala Ser Gln (Q) Asn Asn Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Leu Phe, Norleucin Leu (L) Norleucin, Ile, Val, Ile Met, Ala, Phe Lys (K) Arg, 1,4-diaminovajsav, Arg Gln, Asn Met (M) Leu, Phe, Ile Leu Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Leu Tyr Pro (P) Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val (V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucin Leu 2. Alvadási faktorok A találmány szerinti kiméra proteinek legalább egy alvadási faktort tartalmaznak. Az alvadási faktorok közé tartozik bármely, alább felsorolt faktor, amely alvadási aktivitást mutat vagy alvadási aktivitást mutató molekulát aktivál. Az alvadási faktor tartalmazhat polipeptidet, kis szerves molekulát, vagy kis szervetlen molekulát. Az alvadási faktor lehet mutált alvadási faktor azzal a kikötéssel, hogy alvadási aktivitásának legalább egy részét megtartotta. Az alvadási faktor lehet VIII¹as faktor, beleértve deletált B¹doménú VIII¹as faktort, IX¹es faktor [US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás], XI¹es faktor, XII¹es faktor, 7

8 1 HU T2 2 fibrinogén, protrombin, V¹ös faktor, X¹es faktor vagy XIII¹as faktor. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az alvadási faktor VII¹es vagy VIIa faktor. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, az alvadási faktor mutált VII¹es vagy VIIa faktor [lásd például Persson és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, (01); US /9498 számú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]. A fentiek szerinti alvadási faktor lehet humán eredetû alvadási faktor vagy nemhumán eredetû alvadási faktor, például származhat emberszabású majomból, sertésbõl vagy bármely emlõsbõl. Az alvadási faktor lehet kiméra alvadási faktor, például az alvadási faktor tartalmazhatja humán eredetû alvadási faktor részét és sertéseredetû, vagy bármely más, nemhumán eredetû alvadási faktorrészét, vagy egy elsõ, nemhumán eredetû alvadási faktor részét és egy második, nemhumán eredetû alvadási faktor részét. Az alvadási faktor lehet aktivált alvadási faktor. Más megoldás szerint, az alvadási faktor lehet alvadási faktor inaktív formája, például zimogén. Az inaktív alvadási faktor átmehet aktiváláson azt követõen, hogy immunglobulin konstans régió legalább egy részéhez kapcsolódott. Az inaktív alvadási faktor aktiválható azt követõen, hogy az alanynak beadásra kerül. Más megoldás szerint az inaktív alvadási faktor aktiválható a beadást megelõzõen Immunglobulinok A találmány szerinti kiméra proteinek immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazzák. Az immunglobulinok négy proteinláncot, két nehéz láncot és két könnyû láncot tartalmaznak, amelyek kovalens kötéssel kapcsolódnak. Minden lánc tartalmaz továbbá egy variábilis és egy konstans régiót. Az immunglobulin izotípusától függõen, a nehéz lánc konstans régió három vagy négy konstans régió domént (például CH1, CH2, CH3, CH4) tartalmaz. Néhány izotípus tartalmazhat továbbá csuklórégiót ( hinge ). Az immunglobulin konstans régiórész lehet bármely emlõsbõl származó immunglobulin konstans régiórész. Az immunglobulin konstans régiórész, a korlátozás szándéka nélkül, lehet humán eredetû immunglobulin konstans régiórész, nemhumán eredetû immunglobulin konstans régiórész, szarvasmarha-eredetû immunglobulin konstans régiórész, sertéseredetû immunglobulin konstans régiórész, egéreredetû immunglobulin konstans régiórész, birkaeredetû immunglobulin konstans régiórész vagy patkányeredetû immunglobulin konstans régiórész. Az immunglobulin konstans régiórész tartalmazhatja a teljes nehéz lánc konstans régiót, vagy annak fragmensét vagy analógját. A nehéz lánc konstans régió tartalmazhat CH1-domént, CH2-domént, CH3-domént és/vagy csuklórégiót. A nehéz lánc konstans régió tartalmazhat CH1-domént, CH2-domént, CH3-domént és/vagy CH4-domént. Az immunglobulin elõállítható rekombináns vagy szintetikus eljárásokkal. Az immunglobulin izolálható cdns-könyvtárból. Az immunglobulin izolálható fágkönyvtárból [lásd például McCafferty és mtsai.: Nature 348, 2 (1990)]. Az immunglobulin elõállítható ismert szekvenciák génkeverésével [ gene shuffling, Mark és mtsai.: Bio/Technol., 779 (1992)]. Az immunglobulin izolálható in vivo rekombinációval [Waterhouse és mtsai.: Nucl. Acid Res. 21, 226 (1993)]. Az immunglobulin lehet humanizált immunglobulin [Jones és mtsai.: Nature 332, 323 (1986)]. Az immunglobulin konstans régió része tartalmazhatja IgG, IgA, IgM, IgD és IgE részét. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az immunglobulin IgG. A találmány további megvalósítási módja szerint, az immunglobulin IgG1. A találmány további megvalósítási módja szerint, az immunglobulin IgG2. Az immunglobulin konstans régió része tartalmazhat Fc¹fragmenst. Az Fc¹fragmens tartalmazhatja az immunglobulin CH2- és CH3-doménjait és az immunglobulin csuklórégióját. Az Fc¹fragmens lehet IgG1, IgG2, IgG3 vagy IgG4 Fc¹fragmense. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az immunglobulin IgG1 Fc¹fragmense. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az immunglobulin IgG2 Fc¹fragmense. A találmány további megvalósítási módja szerint, az immunglobulin konstans régiórész tartalmazza a SEQ ID NO 2 szerinti aminosavszekvenciát (3B. ábra) vagy annak analógját. A találmány további megvalósítási módja szerint, az immunglobulin konstans régió része tartalmazza a SEQ ID NO 3 szerinti nukleinsavszekvencia (3C. ábra) által kódolt proteint vagy annak fragmensét. Az immunglobulin konstans régió része tartalmazhat Fc¹variánst. Fc-variáns alatt olyan molekulát vagy szekvenciát értünk, amelyet natív Fc¹bõl módosítottak, azonban továbbra is tartalmaz kötõhelyet az FcRn kisegítõreceptor számára (WO 97/34631). Natív alatt olyan Fc¹t értünk, amely ember által nem módosított. A WO 96/32478 számú nemzetközi közzétételi irat példaként szolgáló Fc¹variánsokat ismertet, valamint kölcsönhatásukat a kisegítõreceptorral. Ennek megfelelõen, az Fc-variáns kifejezés alatt olyan molekulát vagy szekvenciát értünk, amelyet nemhumán eredetû, natív Fc¹bõl humanizáltak. Ezen túlmenõen, natív Fc olyan helyeket tartalmaz, amelyeket el lehet távolítani, mert olyan szerkezeti tulajdonságokat vagy biológiai aktivitást mutatnak, amelyekre nincs szükség a találmány szerinti fúziós molekulákban. Ennek megfelelõen, az Fc¹variáns olyan molekulát vagy szekvenciát tartalmaz, amelybõl hiányzik egy vagy több olyan Fc¹hely vagy ¹csoport, amely az alábbiakat befolyásolja vagy azokban részt vesz: (1) diszulfidkötés képzése, (2) inkompatibilitás kiválasztott gazdasejttel, (3) expresszálódást követõ N¹terminális heterogenitás kiválasztott gazdasejtben, (4) glikozilezés, () kölcsönhatás komplementummal, (6) kötõdés más Fc¹receptorhoz a kisegítõreceptoron kívül vagy (7) ellenanyagfüggõ sejtes citotoxicitás ( antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC). A találmány további megvalósítási módja szerint, az immunglobulin konstans régió része neonatális Fc¹receptor (FcRn) kötõpartner. FcRn kötõpartner lehet bármely molekula, amelyet az FcRn-receptor spe- 8

9 1 HU T2 2 cifikusan köt, és amelyet az FcRn-kötõpartner FcRn általi aktív transzportja követ. Az FcRn-receptort számos emlõsfajból izolálták, embert beleértve. A humán eredetû, patkányeredetû és egéreredetû FcRn szekvenciái ismertek [Story és mtsai.: J. Exp. Med. 180, 2377 (1994)]. Az FcRn-receptor IgG¹t köt (más immunglobulin osztályokat, például IgA¹t, IgM¹et, IgD¹t és IgE¹t azonban nem) viszonylag alacsony ph¹érték mellett, aktív módon szállítja az IgG¹t a sejten át a lumenbõl a savós hártya irányába, majd a sejtek közötti (intersticiális) folyadékban található, viszonylag magasabb ph¹érték mellett az IgG¹t felszabadítja. Expresszálódik felnõtt epitélszövetben (US és számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások) beleértve a tüdõ és bél epitéliumát [Israel és mtsai.: Immunology 92, 69 (1997)], a vese proximális tubulusainak epitéliumát [Kobayasi és mtsai.: Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282, F 38 (02)], valamint az orr epitéliumát, a hüvely felszínét és az epeutak felszínét. A találmány szerinti FcRn-kötõpartnerek közé tartozik bármely molekula, amelyet az FcRn-receptor specifikusan kötni képes, beleértve teljes IgG¹t, IgG Fc¹fragmensét, és más fragmenseket, amelyek tartalmazzák az FcRn-receptor teljes kötõrégióját. Az IgG Fc¹részének azt a régióját, amely az FcRn-receptorhoz kötõdik, röntgendiffrakciós krisztallográfia eljárással jellemezték [Burmeister és mtsai.: Nature 372, 379 (1994)]. Az Fc és FcRn fõ érintkezési területe közel esik a CH2- és CH3-doménok találkozási pontjához. Az Fc¹FcRn érintkezések mind egyetlen lg nehéz láncon mennek végbe. FcRn-kötõpartnerek közé tartoznak teljes IgG, IgG Fc¹fragmense és az IgG más olyan fragmensei, amelyek tartalmazzák az FcRn teljes kötõrégióját. A fõ érintkezési helyek közé tartoznak a CH2-domén 248, 27, 272, 28, 288, , és 314 aminosavcsoportjai, valamint a CH3-domén , 428 és aminosavcsoportjai. Immunglobulinok vagy immunglobulin-fragmensek aminosavjainak a számozására történõ utalások Kabat és mtsai.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Public Health, Bethesda, MD (1991) szakirodalmi hely alapján történtek. Az IgG Fc¹régiója módosítható jól ismert eljárásokkal, például helyspecifikus irányított mutagenezissel vagy hasonlókkal abból a célból, hogy olyan módosított IgG¹t vagy annak Fc¹fragmensét vagy részét állítsuk elõ, amelyet FcRn köt. Ilyen módosítások lehetnek az FcRn érintkezési helyektõl távoli módosítások, valamint az érintkezési helyen belüli olyan módosítások, amelyek megtartják vagy akár fokozzák az FcRn-hez kötõdést. Például, a humán eredetû IgG1 Fc (Fc 1) alábbi egyedi aminosavcsoportjai helyettesíthetõk anélkül, hogy az Fc kötõdési affinitása FcRn irányába jelentõsen csökkenne: P238A, S239A, K246A, K248, D249A, M22A, T26A, E28A, T2A, D26A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H28A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q29A, Y296F, N297A, S298A, Y0F, R1 A, V3A, VA, T7A, L9A, Q311A, D312A, N31A, K317A, E318A, K3A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A3Q, A3S, P331A, P331S, E333A, K334A, T33A, S337A, K338A, K3A. Q342A, R344A, E34A, Q347A, R3A, E36A, M38A, T39A, K3A, N361A, Q362A, Y373A, S37A D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391 F, K392A, L398A, S0A, D1A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E4A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S4A, S444A és K447A, ahol például P238A jelentése vad típusú prolin helyettesítése alaninnal a 238. pozícióban. A fent felsorolt pozíciókban a vad típusú aminosavak alaninon kívül más aminosavakkal is helyettesíthetõk. Mutációk egyenként bevihetõk az Fc¹régióba abból a célból, hogy több mint száz RcRn-kötõpartnert állítsunk elõ, amelyek eltérnek a natív Fc¹régiótól. Ezen túlmenõen, két, három vagy több egyedi mutáció is bevihetõ együtt, abból a célból, hogy FcRn-kötõpartnerek további százait állítsuk elõ. A fenti mutációk egy része új funkcionalitást vihet át az FcRn-kötõpartnerre. Például, a találmány egyik megvalósítási módja tartalmazza az N297A helyettesítést, amely eltávolít egy erõsen konzervált N¹glikozilezési helyet. Ezen mutáció hatása az immunogenitás csökkentése, ezáltal az FcRn-kötõpartner felezõdési idejének növelése a keringésben, valamint az FcRnkötõpartner Fc RI, Fc RIIA, Fc RIIB és Fc RIIIA molekulákhoz történõ kötõdésének a megakadályozása anélkül, hogy rontanánk az FcRn-receptor iránti affinitást [Routledge és mtsai.: Transplantation, 847 (199); Friend és mtsai.: Transplantation 68, 1632 (1999); Shields és mtsai.: J. Biol. Chem. 276, 691 (199)]. Ezen túlmenõen úgy tûnik, hogy legalább három humán eredetû Fc¹gammareceptor ismer fel kötõhelyet az IgG¹n az alsó kapocsrégióban, általában a aminosavakat. Ennek megfelelõen, új funkcionalitásra és lehetséges csökkentett immunogenitásra további példa merülhet fel az ebben a régióban végzett mutációk esetében, például a humán eredetû IgG ELLG aminosavaknak az IgG2 PVA megfelelõ szekvenciájára történõ kicserélésével (egy aminosav deletálásával). Kimutatták, hogy az Fc RI, Fc RIIA, Fc RIIB és Fc RIIIA, amelyek különbözõ effektorfunkciókat mediálnak, nem kötõdnek IgG1-hez, ha ilyen mutációkat hordoznak [Ward és Ghetie: Therapeutic Immunology 29, 2613 (199)]. A fent ismertetett mutációk esetében felmerülõ új funkcionalitásra további példa, hogy bizonyos esetekben az FcRn iránti affinitás meghaladhatja a vad típus affinitásának a mértékét. A fokozott affinitás tükrözhet fokozott be ( on ) sebességet, csökkent ki ( off) sebességet, vagy egyidejûleg tükrözhet fokozott be ( on ) és csökkent ki ( off) sebességet. A T26A, T7A, E380A és N434A mutációkról feltételezik, hogy olyan mutációk közé tartoznak, amelyek FcRn iránti fokozott affinitást visznek át [Shields és mtsai.: J. Biol. Chem. 276, 691 (01)]. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a kötõpartner polipeptid, amely tartalmazza a PKNSS- MISNTP szekvenciát, valamint adott esetben az alábbiak közül választott szekvenciát: HQSLGTQ, 9

10 1 HU T2 2 HQNLSDGK, HQNISDGK vagy VISSHLGQ (US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Két FcRn-receptor köthet egyetlen Fc¹molekulát. Krisztallográfiás adatok arra utalnak, hogy minden egyes FcRn-molekula az Fc¹homodimer egyetlen polipeptidjét köti. Ennek megfelelõen, RcRn-kötõpartner, például IgG Fc¹fragmens kapcsolása alvadási faktorral olyan eszközt biztosít, amely lehetõvé teszi az alvadási faktor aeroszol formájában, például nazális, okuláris vagy pulmonális úton történõ beadását. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti kiméra proteinben alkalmazható immunglobulin konstans régiórész lehet az immunglobulin mutánsa vagy analógja, vagy lehet kémiai úton módosított immunglobulin konstans régiórész vagy annak fragmense (például pegilezett) [lásd például Aslam és Dent: Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, Macmilan Reference, London (1998)]. Adott esetben a mutáns az FcRn-kötõpartner fokozott kötõdését biztosíthatja az FcRn-receptorhoz. A találmány szerinti kiméra proteinben történõ alkalmazásra megfontolandók immunglobulin konstans régió legalább egy részének peptidmimetikumai, például Fc¹fragmens peptidmimetikuma vagy FcRn-kötõpartner peptidmimetikuma. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a peptidmimetikumot fágbemutatás alkalmazásával azonosítjuk [lásd például McCafferty és mtsai.: Nature 348, 2 (1990); Kang és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991); EP B1 számú európai szabadalmi bejelentés]. 4. Választható összekötõk A találmány szerinti kiméra protein adott esetben tartalmazhat legalább egy összekötõ molekulát. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az összekötõ aminosavakat tartalmaz (aminosavszekvenciát). Az összekötõ szekvencia tartalmazhat 1 aminosavat, 1 aminosavat, 1 aminosavat, 0 aminosavat, 0 0 aminosavat vagy 0 0 aminosavat. Az összekötõ szekvencia tartalmazhat G n szekvenciát. Az összekötõ szekvencia tartalmazhat (GGS) n szekvenciát (SEQ ID NO ). Minden esetben, n jelentése lehet egész szám, például 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9 vagy. Összekötõ szekvenciákra példák, a korlátozás szándéka nélkül, a GGG (SEQ ID NO 6), SGGSGGS (SEQ ID NO 7), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO 8) és GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO 9) szekvenciák. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az összekötõ szekvencia nem eliminálja az alvadási faktor alvadási aktivitását. Adott esetben, az összekötõ szekvencia elõsegíti az alvadási faktor alvadási aktivitását, például a szferikus gátlás mérséklésével és azáltal, hogy jobban hozzáférhetõvé teszi az alvadási faktort a célkötõhely számára, például az alvadási kaszkád más faktora számára D. Nukleinsavkonstrukciók A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti kiméra proteineket kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmazó nukleinsavkonstrukció, amely nukleinsavszekvencia tartalmaz például legalább egy alvadási faktort kódoló, elsõ nukleinsavszekvenciát, operatív módon kapcsolva egy második, immunglobulin konstans régió legalább egy részét kódoló nukleinsavszekvenciával. A nukleinsavszekvencia tartalmazhat továbbá szakember számára ismert további szekvenciákat és elemeket (például promotereket, enhancereket, poli-a-szekvenciákat, szignálszekvenciát). Adott esetben, a nukleinsavszekvencia tartalmazhat a legalább egy alvadási faktort és az immunglobulin konstans régiórészt kódoló szekvenciák között elhelyezkedõ összekötõ részt kódoló szekvenciát. Adott esetben, a nukleinsavszekvencia az összekötõ szekvenciát tartalmazhatja a legalább egy alvadási faktort és az immunglobulin konstans régiórészt kódoló szekvenciák elõtt vagy mögött. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a nukleinsavkonstrukció DNS¹t tartalmaz. A találmány további megvalósítási módja szerint, a nukleinsavkonstrukció RNS¹t tartalmaz. A nukleinsavkonstrukció lehet vektor, például virális vektor vagy plazmid. Virális vektorok közé tartoznak, a korlátozás szándéka nélkül, adenovírusvektorok, adeno-asszociált vírusvektorok vagy egéreredetû leukémia vírusvektorok. Plazmidokra példák, a korlátozás szándéka nélkül, puc és pgex plazmidok. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a nukleinsavkonstrukció a 3D. ábra szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazza (SEQ ID NO 4). A genetikai kód ismert degenerációjának tulajdoníthatóan, amely szerint ugyanazt az aminosavat több mint egy kodon kódolhatja, adott DNS-szekvencia eltérhet a SEQ ID NO 3 és SEQ ID NO 4 szerinti szekvenciáktól, és mégis rendre kódolhatja a SEQ ID NO 2 és SEQ ID NO 1 szerinti aminosavszekvenciát. Ilyen variáns DNS-szekvenciák lehetnek csendes mutációk eredménye (például elõfordulhatnak PCR-amplifikálás alatt), vagy lehetnek a natív szekvencia szándékolt mutagenezisének az eredménye. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti polipeptideket kódoló, izolált DNS-szekvenciák, amelyek az alábbiak közül választottak: (a) a SEQ ID NO 3 vagy SEQ ID NO 4 szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS; (b) a SEQ ID NO 1 vagy SEQ ID NO 2 szerinti polipeptidet kódoló DNS; (c) DNS, amely hibridizálni képes az (a) vagy (b) szerinti DNS-hez mérsékelten stringens körülmények mellett, és amely a találmány szerinti polipeptideket kódolja; (d) DNS, amely hibridizálni képes az (a) vagy (b) szerinti DNS-hez erõsen stringens körülmények mellett, és amely a találmány szerinti polipeptideket kódolja; (e) DNS, amelynek genetikai kódja az (a), (b), (c) vagy (d) szerinti DNS¹re degenerálódott, és amely a találmány szerinti polipeptideket kódolja. Az ilyen DNS-szekvenciák által kódolt polipeptidek természetesen szintén a találmány tárgyát képezik. A találmány további megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti nukleinsavmolekulák közé tartoznak olyan nukleotidszekvenciák is, amelyek legalább 80%¹os azonosságot mutatnak a natív szekvenciával. Ide tartoznak továbbá olyan megvalósítási módok,

11 1 HU T2 2 amelyekben a nukleinsavmolekula olyan szekvenciát tartalmaz, amely legalább 90%¹os, legalább 9%¹os, legalább 98%¹os, legalább 99%¹os vagy legalább 99,9%¹os azonosságot mutat a natív szekvenciával. Az azonosság százalékos mértéke meghatározható vizuális ellenõrzéssel és matematikai számítással. Más megoldás szerint, két nukleinsavszekvencia közötti azonosság százalékos mértéke meghatározható a szekvenciáról kapott információ összehasonlításával GAP számítógépes program 6.0 verziójának az alkalmazásával, amelyet Devereux és mtsai. ismertettek [Nucl. Acids Res. 12, 387 (1984)], és amely hozzáférhetõ az University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) honlapján. A GAP program elõnyös alapértelmezett paraméterei közé tartoznak: (1) egyalkotós összehasonlító mátrixnukleotidok számára (amely egyezésért l¹es értéket, nem egyezésért 0 értéket tartalmaz), és Gribskov és Burgess súlyozott összehasonlítási mátrixa [Nucl. Acids Res. 14, 674 (1986)], amint azt Schwartz és Dayhoff ismertette [ Atlas of Protein Sequence and Structure National Biomedical Research Foundation, (1979)]; (2) minden hézagért 3,0 büntetõpont és további 0, büntetõpont az egyes hézagokban található szimbólumokért; és (3) nincs büntetõpont a szélsõ hézagokért. Szekvenciák összehasonlításában jártas szakember által ismert további programok is alkalmazhatók. E. Kiméra proteinek szintézise Immunglobulin konstans régió legalább egy részét és alvadási faktort tartalmazó kiméra proteinek szakember számára ismert eljárásokkal szintetizálhatók. Például, a találmány szerinti kiméra proteinek szintetizálhatók sejtekben, rekombináns eljárással [lásd például Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989), valamint Ausbel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Associates and Wiley Interscience N. Y. (1989)]. Immunglobulinokat vagy fragmenseiket, vagy alvadási faktorokat vagy fragmenseiket kódoló DNS¹ek szakember számára ismert, számos genomiális vagy cdns-könyvtárból klónozhatók. Ilyen DNS-szekvenciák próbán alapuló eljárások alkalmazásával történõ izolálására alkalmas eljárások szakember számára jól ismertek. Ilyen DNS-szekvenciák izolálására szolgáló próbák alapulhatnak ismertetett DNS-szekvenciákon [lásd például Hieter és mtsai.: Cell 22, (1980)]. Alkalmazható a Mullis és mtsai. [US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás] és Mullis [US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás] által ismertetett polimeráz-láncreakció (PCR) eljárás. A könyvtár kiválasztása és az ilyen DNS-szekvenciák izolálására szolgáló próbák kiválasztása szakember számára megoldható. Más megoldás szerint, immunglobulinokat vagy fragmenseit, vagy alvadási faktorokat kódoló DNS-szekvenciák hozzáférhetõk olyan vektorokból, amelyekrõl ismert, hogy immunglobulinokat vagy fragmenseit, vagy alvadási faktorokat tartalmaznak Rekombinánsok elõállítása céljából, a kiméra proteint kódoló polinukleotidszekvenciát megfelelõ expressziós hordozóba inszertáljuk, például olyan vektorba, amely tartalmazza az inszertált kódolószekvencia átíródásához és transzlációjához szükséges elemeket, vagy RNS virális vektor esetében, a replikációhoz és transzlációhoz szükséges elemeket. A kiméra proteint kódoló nukleinsavat megfelelõ leolvasási keretbe inszertáljuk. A találmány egyes megvalósítási módjai szerint, a nukleinsav kódolhat továbbá propeptid alvadási faktort, amelyet a sejt módosít, hogy a találmány szerinti, érett kiméra proteint állítsa elõ. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a propeptid alvadási faktort K¹vitamin-függõ ¹karboxiláz ismeri fel, amely módosítja a propeptid alvadási faktort a teljes aktivitás eléréséhez (például VII¹es faktor, IX¹es faktor, X¹es faktor és protrombin esetében). Abból a célból, hogy a találmány szerinti, érett kiméra proteint megkapjuk, a propeptidszekvenciát ezt követõen endoproteázzal hasítjuk, például bázikus aminosavpárnál hasító enzimmel ( paired basic amino acid cleaving enzyme, párosított, bázikus aminosavat hasító enzim, PACE), vagy a PACE család bármely tagjával, például PCSK1 9 enzimekkel, beleértve azok csonkolt változatait, vagy S. cerevisiae organizmusból származó, élesztõben elõforduló Kex2 ekvivalensével, vagy a Kex2 csonkolt változataival [lásd például az US 077 4, 162 2, 234 8, és számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat (Kex2 1 67)]. Ezt követõen, az expressziós hordozót megfelelõ célsejtbe transzfektáljuk, amely a proteint, például a kiméra proteint expresszálja. A technika állása szerint ismert transzfekciós eljárások közé tartoznak, a korlátozás szándéka nélkül, kalcium-foszfát precipitáció [Wigler és mtsai.: Cell 14, 72 (1978)] és elektroporálás [Neumann és mtsai.: EMBO, J. 1, 841 (1982)]. Gazdaexpressziós vektorrendszerek széles köre alkalmazható a találmány szerinti kiméra proteinek expresszáltatására eukarióta sejtekben. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az eukarióta sejt állati eredetû sejt, például emlõseredetû sejt (például CHO, BHK, Cos vagy HeLa sejt). Amikor a kiméra proteint eukarióta sejtekben expresszáltatjuk, a kiméra proteint kódoló DNS egyúttal szignálszekvenciát is kódol, amely lehetõvé teszi a kiméra protein szekretálódását. Szakember számára világos, hogy a protein átíródása során a sejt a szignálszekvenciát lehasítja és ezáltal érett kiméra proteint állít elõ. A technika állása szerint számos szignálszekvencia ismert, például natív VII¹es faktor szignálszekvencia, natív IX¹es faktor szignálszekvencia és egéreredetû Ig könnyû lánc szignálszekvencia. Más megoldás szerint, ahol nem alkalmazunk szignálszekvenciát, a kiméra protein a sejtek lizálásával állítható elõ. A találmány szerinti kiméra protein elõállítható transzgenikus állatban, például rágcsálóban, kecskében, birkában, sertésben vagy szarvasmarhában. Transzgenikus állat alatt nemhumán állatot értünk, amelynek genomja idegen gént hordoz. Mivel a gén je- 11

12 1 HU T len van csíravonal-szövetekben, azt a szülõ átadja utódainak. Az exogén gént egysejtû embriókba viszik be [Brinster és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438 (198)]. Eljárások transzgenikus állatok elõállítására a technika állása szerint ismertek, beleértve immunglobulin-molekulákat produkáló transzgenikus állatokat [Wagner és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6376 (1981); McKnight és mtsai.: Cell 34, 33 (1983); Brinster és mtsai.: Nature 6, 332 (1983); Ritchie és mtsai.: Nature 312, 17 (1984); Baldassarre és mtsai.: Theriogenology 9, 831 (03); Robi és mtsai.: Theriogenology 9, 7 (03); Malassagne és mtsai.: Xenotransplantation,(3) 267 (03)]. Az expressziós vektor kódolhat olyan toldalékot, amely lehetõvé teszi a rekombináns eljárással elõállított protein tisztítását vagy azonosítását. Erre példák, a korlátozás szándéka nélkül, a pur278 vektor [Ruther és mtsai.: EMBO, J. 2, 1791 (1983)], amelyben a találmány szerinti, kiméra proteint kódoló szekvenciát keretbe ligálhatjuk a lac z gént kódoló régióval abból a célból, hogy hibrid proteint állítsunk elõ; pgex vektorokat alkalmazhatunk abból a célból, hogy glutation-stranszferáz (GST) toldalékot hordozó proteineket expresszáltassunk. Ezek a proteinek általában oldhatók, és a sejtekbõl könnyen tisztíthatók azáltal, hogy glutation-agaróz-gyöngyökhöz adszorbeálódnak, majd azokról szabad glutation jelenlétében eluálhatók. A vektorok hasítási helyeket tartalmaznak [például PreCission Protease (Pharmacia, Peapack, N. J.)] a toldalék egyszerû eltávolítására. Az elõállítás hatékonyságának a fokozása érdekében, a polinukleotid tervezhetõ úgy, hogy a találmány szerinti kiméra protein több egységét kódolja, amely egységeket enzimatikus hasítási helyek választják el egymástól. Az így kapott polipeptid hasítható (például a megfelelõ enzimmel történõ kezeléssel) abból a célból, hogy visszakapjuk a polipeptidegységeket. Ez az eljárás fokozhatja az egyetlen promoter által irányított polipeptid hozamát. Megfelelõ virális expressziós rendszerekben az RNS által kódolt, minden egyes polipeptid transzlációja az átiratban belsõleg irányított, például belsõ riboszóma-belépési hely ( internal ribosome entry site, IRES) által. Ennek megfelelõen, a policisztron konstrukció egyetlen, nagyméretû policisztron mrns átíródását irányítja, amely viszont több, egyedi polipeptid átíródását irányítja. Ez a megközelítés fölöslegessé teszi poliproteinek elõállítását és feldolgozását, valamint jelentõsen fokozza egyetlen promoter által irányított polipeptid hozamát. A transzformálásra alkalmazott vektorok általában tartalmaznak szelektálható markert, amelyet a transzformáns azonosítása céljára alkalmazunk. Bakteriális rendszerekben ez lehet antibiotikum-rezisztenciagén, például ampicillin¹, blaszticidin- vagy kanamicingén. Tenyésztett emlõseredetû sejtekben alkalmazott szelektálható markerek lehetnek olyan gének, amelyek droggal, például neomicinnel, higromicinnel vagy metotrexáttal szembeni reszisztenciát visznek át. Az egyik ilyen amplifikálható szelektálható marker a dihidrofolátreduktáz gén ( dihydrofolate reductase gene, DHFR gene). További amplifikálható marker a DHFRr cdns-marker [Simonsen és Levinson: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 249 (1983)]. Amplifikálható markereket foglal össze Thilly a Mammalian Cell Technology szakirodalmi helyen [Butterworth Publishers, Stoneham, Mass], és szelektálható markerek kiválasztása szakmában járatos személy számára nem okoz nehézséget. Szelektálható markerek bevihetõk a sejtbe külön plazmidon, a kívánt génnel egyidejûleg, vagy bevihetõk ugyanazon a plazmidon. Ugyanazon a plazmidon, a szelektálható marker és a kívánt gén lehet különbözõ promoterek vagy egyazon promoter irányítása alatt, ez utóbbi bicisztronos üzenetet eredményez. Ilyen konstrukciók a szakirodalomban jól ismertek [lásd például az US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást]. Az expressziós rendszerek expressziós elemeinek ereje és specificitása változó. Az alkalmazott gazda/vektor rendszertõl függõen, az expressziós vektorban számos, arra alkalmas transzkripciós és transzlációs elem bármelyike alkalmazható, beleértve konstitutív és indukálható promotereket. Például, bakteriális rendszerekben történõ klónozáshoz alkalmazhatók olyan indukálható promoterek, mint például a bakteriofág pl promotere, vagy a piac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibrid promoter) promoterek és hasonlók; rovarsejtrendszerekben történõ klónozáshoz alkalmazhatók olyan promoterek, mint például a bakulovírus-eredetû poliéder-promoter; növényi sejtben történõ klónozáshoz alkalmazhatók például növényi sejt genomjából (például hõsokk promoterek; RUBISCO kis alegységének a promotere) vagy növényi vírusokból (például a CaMV 3S RNS promotere; a TMV burokprotein promotere) származó promoterek; emlõssejtrendszerekben történõ klónozáskor alkalmazhatók például emlõseredetû sejtekbõl származtatott promoterek (például metallotionein promoter) vagy emlõseredetû vírusokból származtatott promoterek (például adenovírus késõi promoter; vakcíniavírus 7, K promoter, CMV promoter); az expressziós termék több kópiáját tartalmazó sejtvonalak elõállításához SV¹, BPV- és EBV-alapú vektorok alkalmazhatók, megfelelõ szelektálható markerrel. Olyan esetekben, ahol növényi expressziós vektorokat alkalmazunk, a találmány szerinti kiméra protein lineáris vagy nem ciklikus formáit kódoló szekvenciák expresszálódását számos promoter bármelyike irányíthatja. Alkalmazhatók például virális promoterek, mint például a CaMV 3S és 19S promoterei [Brisson és mtsai.: Nature 3, (1984)], vagy a TMV burokprotein promotere [Takamatsu és mtsai.: EMBO J. 6, (1987)]; más megoldás szerint, alkalmazhatók növényi promoterek, például a RUBISCO kis alegysége [Coruzzi és mtsai.: EMBO J. 3, (1984); Broglie és mtsai.: Science 224, (1984)], vagy hõsokk-proteinek, például a szójababeredetû hsp17.¹e vagy 17.3¹B [Gurley és mtsai.: Mol. Cell. Biol. 6, 9 6 (1989)]. Ezek a konstrukciók bevihetõk növényi sejtekbe Ti plazmidokkal, Ri plazmidokkal, növényi vírusvektorokkal, közvetlen DNS- 12

13 1 HU T2 2 transzformálással, mikroinjektálással, elektroporálással és hasonló eljárásokkal. Ilyen eljárások összefoglaló ismertetését [lásd például Weissbach és Weissbach: Methods for Plant Molecular Biology Academic Press, NY, VIII. fejezet, (1988); és Gierson és Corey Plant Molecular Biology, 2. kiadás, 7 9. fejezet, Blackie, London, (1988)]. A találmány szerinti kiméra proteinek elõállítására alkalmazható egyik rovareredetû expressziós rendszerben, Autographa californica nukleáris polihedrózis vírust ( nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) alkalmazunk vektorként idegen gének expresszáltatására. A vírus Spodoptera frugiperda eredetû sejtekben szaporodik. Kódolószekvenciát klónozhatunk a vírus nem esszenciális régióiba (például a polihidron-génbe) és azt AcNPV promoter (például a polihedron promoter) irányítása alá helyezzük. A kódolószekvencia sikeres inszertálása a polihedron gén inaktiválását és nem zárt (azaz a polihedron gén által kódolt proteinszerû burok nélküli) rekombináns vírus elõállítását eredményezi. Ezeket a rekombináns vírusokat alkalmazzuk ezt követõen Spodoptera frugiperda eredetû sejtek fertõzésére, amelyekben az inszertált gén expresszálódik [lásd például Smith és mtsai.: J. Virol. 46, 84 (1983); US számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Az expressziós rendszerrõl további példákat ismertetnek [Ausubel és mtsai.: szerk. Current Protocols in Molecular Biology, 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience (1989)]. Emlõseredetû gazdasejtekben számos, virális alapú expressziós rendszer alkalmazható. Olyan esetekben, ahol expressziós vektorként adenovírust alkalmazunk, a kódolószekvenciát adenovírus transzkripciós és/vagy transzlációs irányító komplexhez ligálhatjuk, például a késõi promoterhez és három részbõl álló vezetõszekvenciához. Ez a kiméra gén ezt követõen in vitro vagy in vivo rekombinációval inszertálható az adenovírus genomba. A virális genom nem esszenciális régiójába (például az E1 vagy E3 régiókba) történõ inszertálás olyan vírust eredményez, amely életképes és expresszálni képes polipeptid peptidet fertõzött gazdában [lásd például Logan és Shenk: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, (1984)]. Más megoldás szerint, alkalmazható a vakcínia 7, K promoter [lásd például Mackett és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 741 (1982); Mackett és mtsai.: J. Virol. 49, 87 (1984); Panicali és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927 (1982)]. Olyan esetekben, ahol expressziós vektorként adenovírust alkalmazunk, a kódolószekvenciát adenovírus transzkripciós és/vagy transzlációs irányító komplexhez ligálhatjuk, például a késõi promoterhez és három részbõl álló vezetõszekvenciához. Ez a kiméra gén ezt követõen in vitro vagy in vivo rekombinációval inszertálható az adenovírus genomba. A virális genom nem esszenciális régiójába (például az E1 vagy E3 régiókba) történõ inszertálás olyan vírust eredményez, amely életképes és expresszálni képes polipeptid peptidet fertõzött gazdában [lásd például Logan és Shenk: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, (1984)] Más megoldás szerint, alkalmazható a vakcínia 7, K promoter [lásd például Mackett és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 741 (1982); Mackett és mtsai.: J. Virol. 49, 87 (1984); Panicali és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927 (1982)]. A kiméra protein DNS-konstrukcióit tartalmazó gazdasejteket arra alkalmas tápközegben szaporítjuk. A leírásban arra alkalmas tápközeg alatt olyan közeget értünk, amely tartalmazza a sejtek szaporodásához szükséges tápanyagokat. A sejtek szaporodásához szükséges tápanyagok közé tartoznak szénforrás, nitrogénforrás, esszenciális aminosavak, vitaminok, ásványi sók és növekedési faktorok. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a tápközeg K¹vitamint tartalmaz, amelyre a celluláris ¹karboxiláznak szüksége van ahhoz, hogy rekombináns eljárással elõállított alvadási faktort, például a VII¹es faktort aktiválja. Más megoldás szerint, a tápközeg tartalmazhat szarvasmarha-eredetû borjúszérumot vagy magzati borjúszérumot. A tápközeg általában szelektál a DNS-konstrukciót hordozó sejtekre, például drog-szelekció vagy esszenciális tápanyag-összetevõ révén, amelyet a DNS-konstrukción található szelekciós marker komplementál, vagy a DNS-konstrukcióval kotranszfektálható. A tenyésztett emlõseredetû sejteket általában kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ, szérumot tartalmazó vagy szérummentes tápközegben tenyésztjük (például MEM, DMEM). Adott sejtvonal számára megfelelõ tápközeg kiválasztása szakember köteles tudásához tartozik. A rekombináns eljárással elõállított, találmány szerinti kiméra protein a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal izolálható a tápközegbõl (például affinitáskromatográfia, gélszûréses kromatográfia vagy ioncserélõ kromatográfia alkalmazásával). A találmány szerinti kiméra protein izolálható a tápközegbõl oszlopkromatográfiás eljárásokkal, például protein-a-oszlopon vagy ioncserélõ oszlopon. Abban az esetben, ha protein-a-oszlopot vagy ioncserélõ oszlopot alkalmazunk a találmány szerinti kiméra protein elválasztásához, a kromatográfiás elválasztás hozzájárulhat a találmány szerinti kiméra protein aktiválásához, például úgy, hogy a VII¹es faktort VIIa faktorrá konvertálja. A megfelelõen szaporított, transzformált vagy transzfektált gazdasejtek tápközegét elválasztjuk a sejtektõl, és detektáljuk a kiméra proteinek jelenlétét. A kiméra proteinek detektálásának egyik módja például, hogy a kiméra proteineket vagy a kiméra proteinek részeit a találmány szerinti kiméra proteint felismerõ, specifikus ellenanyaggal (például Fc elleni ellenanyaggal) kötjük. A kiméra protein elleni ellenanyag lehet a kívánt kiméra protein ellen elõállított monoklonális vagy poliklonális ellenanyag. A kiméra protein tartalmazhatja például immunglobulin konstans régiórészét. Számos immunglobulin konstans részét felismerõ ellenanyagok a technika állása szerint jól ismertek és kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõk. Ellenanyag alkalmazható ELISA vagy western-blot eljárások végzéséhez abból a célból, hogy a találmány szerinti kiméra protein jelenlétét detektáljuk. 13

14 1 HU T2 2 F. Eljárások kiméra proteinek alkalmazására A találmány szerinti kiméra proteinek számos területen alkalmazhatók, amint az szakember számára nyilvánvaló, például, a korlátozás szándéka nélkül, hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alany kezelésére szolgáló eljárásban, valamint általános hemosztatikus ágensre szoruló alany kezelésére szolgáló eljárásban. 1. Hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alany kezelésére szolgáló eljárások A találmány tárgyát képezi eljárás hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alany kezelésére, amelyben legalább egy kiméra protein terápiásan hatásos mennyiségét adjuk be, ahol a kiméra protein immunglobulin konstans régió legalább egy részét, valamint legalább egy alvadási faktort tartalmaz. A találmány szerinti kiméra protein azáltal kezel vagy elõz meg hemosztatikus rendellenességet, hogy elõsegíti fibrinalvadék képzõdését. A találmány szerinti kiméra protein a koagulációs kaszkád bármely tagját aktiválhatja. Az alvadási faktor részt vehet a külsõ (extrinsic) anyagcsereútban, a belsõ (intrinsic) anyagcsereútban vagy mindkettõben. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az alvadási faktor a VII¹es faktor vagy a VIIa faktor. A VIIa faktor aktiválhatja a X¹es faktort, amely kölcsönhatásba lép a Va faktorral, hogy a protrombint trombinná hasítsa, amely viszont a fibrinogént fibrinné hasítja a. Állapotok, amelyek kezelhetõk A találmány szerinti kiméra protein bármely hemosztatikus rendellenesség kezelésére alkalmas. A találmány szerinti kiméra protein beadásával kezelhetõ hemosztatikus rendellenességek közé tartoznak, a korlátozás szándéka nélkül, az A típusú hemofília, B típusú hemofília, von Willebrand-betegség, XI¹es faktor deficiencia (PTA deficiencia), XII¹es faktor deficiencia, valamint a fibrinogén, protrombin, V¹ös faktor, VII¹es faktor, X¹es faktor vagy XIII¹as faktor deficienciái vagy strukturális rendellenességei. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a hemosztatikus rendellenesség öröklött rendellenesség. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az alany A típusú hemofíliában szenved és a kiméra protein VIII¹as faktort vagy VIIIa faktort tartalmaz. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, az alany A típusú hemofíliában szenved és a kiméra protein VII¹es faktort vagy VIIa faktort tartalmaz. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, az alany B típusú hemofíliában szenved és a kiméra protein IX¹es faktort vagy IXa faktort tartalmaz. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, az alany B típusú hemofíliában szenved és a kiméra protein VII¹es faktort vagy VIIa faktort tartalmaz. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, az alany a VIII¹as faktor vagy VIIIa faktor elleni gátló ellenanyagokat hordoz és a kiméra protein VII¹es faktort vagy VIIa faktort tartalmaz. Egy további megvalósítási mód szerint, az alany a IX¹es faktor vagy IXa faktor elleni gátló ellenanyagokat hordoz és a kiméra protein VII¹es faktort vagy VIIa faktort tartalmaz. A találmány szerinti kiméra protein alkalmazható hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alany profilaktikus kezelésére. A találmány szerinti kiméra protein alkalmazható akut vérzési epizód kezelésére hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alanyban. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a hemosztatikus rendellenesség alvadási faktor, például IX¹es faktor, VIII¹as faktor, VII¹es faktor deficienciájának az eredménye. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a hemosztatikus rendellenesség lehet hibás alvadási faktor, például hibás von Willebrand faktor eredménye. A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a hemosztatikus rendellenesség lehet szerzett rendellenesség. A szerzett rendellenesség lehet másodlagos háttérbetegség vagy állapot eredménye. Nem összefüggõ állapot lehet például, a korlátozás szándéka nélkül, rák, autoimmun betegség, vagy terhesség. A szerzett rendellenesség lehet idõs életkor eredménye, vagy lehet másodlagos rendellenességre kapott gyógyszeres kezelés (például rákkemoterápia) eredménye. 2. Általános hemosztatikus ágensre szoruló alany kezelésére szolgáló eljárások A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások hemosztatikus rendellenességben, vagy hemosztatikus rendellenesség kialakulását eredményezõ másodlagos betegségben vagy állapotban nem szenvedõ alany kezelésére. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi eljárás általános hemosztatikus ágensre szoruló alany kezelésére, amely tartalmazza legalább egy kiméra protein terápiásan hatásos mennyiségének a beadását, ahol a kiméra protein immunglobulin konstans régió legalább egy részét, továbbá legalább egy alvadási faktort tartalmaz. a. Kezelhetõ állapotok A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az általános hemosztatikus ágensre szoruló alanyon sebészeti beavatkozást végeznek, vagy arra készülnek. A találmány szerinti kiméra proteint beadhatják a sebészeti beavatkozás elõtt, közben vagy után, profilaxis céljából. A találmány szerinti kiméra proteint beadhatják a sebészeti beavatkozás elõtt, közben vagy után, akut vérzési epizód megállítása céljából. A sebészeti beavatkozás, a korlátozás szándéka nélkül, lehet májtranszplantáció, máj reszekciója, vagy õssejt-transzplantáció. A találmány szerinti kiméra protein alkalmazható akut vérzési epizódban szenvedõ olyan alany kezelésére, aki nem szenved hemosztatikus rendellenességben. Az akut vérzési epizód oka lehet súlyos trauma (például sebészeti beavatkozás, gépjármûbaleset, seb, roncsoló puskalövés, vagy bármely más traumás esemény, amely szabályozatlan vérzést vált ki. b. A kezelés módozatai A találmány szerinti kiméra protein beadható intravénásan, szubkután, intramuszkulárisan, vagy bármely 14

15 1 HU T nyálkahártya-felületen keresztül, például orális, szublingvális, bukkális, nazális, rektális, vaginális vagy pulmonális úton. A kiméra protein szilárd biopolimer hordozóba implantálható vagy ahhoz kapcsolható, ami lehetõvé teszi a kiméra protein lassú felszabadulását a vérzés helyére, vagy pólyába/kötszerbe történõ implantálását. A találmány szerinti kiméra protein dózisa az adott alanytól és az adott beadási módtól függõen változik. A dózisok testtömegre vonatkoztatva 0, g/kg tartományba esnek. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a dozírozási tartomány 0,1 00 g/kg. A protein adagolható folyamatosan vagy meghatározott idõközönként. Az optimális dózistartomány és/vagy beadási rend meghatározása céljából in vitro vizsgálatok végezhetõk. Alvadási faktorok aktivitását mérõ in vitro vizsgálatok szakember számára ismertek, például STA-CLOT VIIa-rTF alvadási vizsgálat. Ezen túlmenõen, hatékony dózisok extrapolálhatók állatmodellekben kapott dózis-hatás görbékbõl, például hemofíliás kutyamodellbõl [Mount és mtsai.: Blood 99,(8) 2670 (02)]. A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény, amely alvadási faktort, immunglobulin konstans régió legalább egy részét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy vivõanyagokat (excipienseket) tartalmaz. Gyógyászatilag elfogadható hordozókra példákat ismertet a Martin E. W. által szerkesztett Remington s Pharmaceutical Sciences kézikönyv. Vivõanyagokra példák a keményítõ, glükóz, laktóz, szacharóz, zselatin, maláta, rizs, liszt, krétapor, szilikagél, nátrium-sztearát, glicerin-monosztearát, talkum, nátrium-klorid, sovány tejpor, glicerin, propilén, glikol, víz, etanol, és hasonlók. A készítmény tartalmazhat továbbá ph¹értéket pufferezõ reagenseket, továbbá nedvesítõ vagy emulgeáló ágenseket. Szájon át történõ beadás céljából, a gyógyászati készítmény lehet szokásos eljárással elõállított tabletta vagy kapszula. A készítmény elõállítható továbbá folyadék, például szirup vagy szuszpenzió formájában. A folyadék tartalmazhat szuszpendáló ágenseket (például szorbitolszirupot, cellulózszármazékokat vagy hidrogénezett étkezési zsírokat), emulgeáló ágenseket (például lecitint vagy akáciát), nem vízszerû hordozókat (például mandulaolajat, olajésztereket, etil-alkoholt vagy frakcionált növényi olajokat) és tartósítószereket (például metil- vagy propil-p-hidroxi-benzoátokat vagy aszkorbinsavat). A készítmények tartalmazhatnak továbbá ízesítõ¹, színezõ- és édesítõágenseket. Más megoldás szerint, a készítmény prezentálható száraz por formájában, amely vízzel vagy más megfelelõ hordozóval rekonstituálható. Bukkális alkalmazás céljára, a készítmény szokásos eljárással elõállítható tabletta vagy rombusz alakú gyógyszer formájában. Inhalációs alkalmazás esetén, a készítmény a találmány szerinti alkalmazás céljából kiszerelhetõ nebulizált aeroszol formájában, vivõanyagokkal vagy azok nélkül, vagy aeroszol spray formájában túlnyomásos tartályból vagy nebulizáló eszközbõl, adott esetben hajtógázzal, amilyen például a diklór-difluor-metán, triklórfluor-metán, diklór-tetrafluor-metán, szén-dioxid vagy más megfelelõ gázok. Túlnyomásos aeroszol esetében a dózis egysége szelep beépítésével szabályozható, amely mért mennyiséget bocsát ki. Inhaláló vagy inszufflátor készülékben történõ alkalmazás céljára a készítmény és megfelelõ poralap, például laktóz vagy keményítõ porított elegyét tartalmazó, például zselatint tartalmazó kapszulák és patronok szerelhetõk ki. A gyógyászati készítmény kiszerelhetõ bolus injektálással történõ parenterális beadás céljára (azaz intravénás vagy intramuszkuláris beadás céljára). Az injekciós készítmények kiszerelhetõk dózisegység, például ampullák formájában, vagy többadagos tárolókban, hozzáadott tartósítóval. A készítmények lehetnek például szuszpenziók, oldatok vagy olajos vagy vizes vivõanyagban képzett emulziók, és tartalmazhatnak például szuszpendáló, stabilizáló és/vagy diszpergáló kiszerelési ágenseket. Más megoldás szerint, a hatóanyag lehet por formájú, amely megfelelõ vivõanyaggal, például pirogénmentes vízzel rekonstituálható. A gyógyászati készítmény kiszerelhetõ továbbá rektális beadás céljára, végbélkúp vagy retenciós beöntés formájában, amely például olyan végbélkúpalapokat tartalmazhat, amilyen például a kakaóvaj vagy más gliceridek. c. Kombinációs terápia A találmány egyik további megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás hemosztatikus rendellenességben szenvedõ alany kezelésére, amely eljárás tartalmazza legalább egy alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazó kiméra protein beadását, legalább egy, további olyan alvadási faktorral vagy ágenssel kombinálva, amely elõsegíti a hemosztázist. A hemosztázist elõsegítõ, további alvadási faktor lehet bármely, bizonyított alvadási aktivitást mutató terapeutikum. Példaként, a korlátozás szándéka nélkül, az alvadási faktor vagy hemosztatikus ágens lehet V¹ös faktor, VII¹es faktor, VIII¹as faktor, IX¹es faktor, X¹es faktor, XI¹es faktor, XII¹es faktor, XIII¹as faktor, protrombin, fibrinogén, von Willebrand faktor vagy rekombináns oldható szöveti faktor ( recombinant soluble tissue factor, rstf), vagy a fentiek aktivált formája. Az alvadási faktor vagy hemosztatikus ágens lehet továbbá antifibrinolitikus drog, például epszilon-aminokapronsav vagy tranexámsav. G. Vizsgálókészletek A találmány tárgyát képezi vizsgálókészlet hemosztatikus rendellenesség diagnosztizálására. A vizsgálókészlet tartalmazhat tárolót és legalább egy alvadási faktort és immunglobulin konstans régió legalább egy részét tartalmazó kiméra proteint. A kiméra protein megfelelõ pufferben vagy oldószerben szállítható. A puffer lehet vizes puffer, például PBS, vagy más megoldás szerint, a kiméra protein lehet liofilezett állapotban. A vizsgálókészlet tartalmazhat továbbá használati útmutatót alvadási faktor jelenlétének a kimutatására adott mintából, például minta kis adagjának a ta- 1

16 1 HU T2 2 lálmány szerinti kiméra proteinnel történõ érintkeztetésével, és az alvadék kimutatásával. A detektálás lehet láthatóságon alapuló. A vizsgálókészlet adott esetben tartalmazhat valamely ismert alvadási faktortól mentes vért. Példák 1. példa: pcdna 3.1-Flag¹Fc klónozása Proteinek azonosítására vagy tisztítására gyakran alkalmazott affinitástoldalék FLAG peptidet (Asp-Tyr- Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (SEQ ID NO 23) klónoztuk a pcdna3.1¹fc plazmidba, amely egéreredetû Ig szignálszekvenciát és folytatólagosan humán eredetû IgG1 Fc fragmenst (EU számozás szerint aminosavakat) tartalmaz, a konstrukciót átfedõ PCReljárással állítottuk elõ, az alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: FlagFc¹F1: ¹GCTGGCTAGCCACCATGGA¹3 (SEQ ID NO ) FlagFc¹R1: ¹CTTGTCATCGTCGTCCTTGTAG- TCGTCA CCAGTGGAACCTGGAAC¹3 (SEQ ID NO ) FlagFc¹F2: ¹GACTACAAGGACGACGATGA- CAAGGACAAA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCG- GAACTCC¹3 (SEQ ID NO 12) FlagFc¹R2: ¹TAGTGGATCCTCATTTACCCG¹3 (SEQ ID NO 13) Ezt követõen, a pcdna 3.1¹Fc templátot két különbözõ PCR-reakcióhoz adtuk, amelyek a FlagFc- F1/R1 vagy FlagFc-F2/R2 láncindító párok mindegyikének 0 pm mennyiségét tartalmazták 0 l reakció-térfogatban, Pfu Ultra DNA polimeráz (Stratagene, CA) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint, MJ Thermocycler berendezésen, az alábbi ciklusok mellett: 9 C¹on 2 percen át; majd 9 C¹on másodpercen át, 2 C¹on másodpercen át 72 C¹on 4 másodpercen át, ez utóbbi három paramétert cikluson keresztül ismételtük; majd 72 C¹on percen át. A két reakció termékeit (egyenként 2 l) ezt követõen egy következõ PCR-reakcióban FlagFc¹F1 és FlagFc¹R2 láncindítók 0 pm mennyiségével elegyítettük, 0 l reakciótérfogatban, Pfu Ultra DNA polimeráz (Stratagene, CA) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint, MJ Thermocycler készülékben, az alábbi ciklusok mellett: 9 C¹on 2 percen át; majd 9 C¹on másodpercen át, 2 C¹on másodpercen át 72 C¹on 4 másodpercen át, ez utóbbi három paramétert cikluson keresztül ismételtük; majd 72 C¹on percen át. Az így kapott fragmenst gélen tisztítottuk, emésztettük, majd a pcdna3.1¹fc plazmid Nhel-Bam¹HI helyére inszertáltuk. Az így kapott plazmid FlagFc proteint elõállító, egéreredetû Ig szignálszekvenciát tartalmaz. 2. példa: PACE konstrukció klónozása Humáneredetû PACE ( paired basic amino acid cleaving enzyme ) endoproteázt kódoló szekvenciát RT¹PCR eljárással állítottuk elõ. Az alábbi láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk: PACE¹F1: ¹GGTAAGCTTGCCATGGAGCT- GAGGCCCTGGTTGC¹3 (SEQ ID NO 1) PACE¹R1: ¹GTTTTCAATCTCTAGGACCCACT- CGCC¹3 (SEQ ID NO 16) PACE¹F2: ¹GCCAGGCCACATGACTACTC- CGC¹3 (SEQ ID NO 17) PACE¹R2: ¹GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGT- GTGAGGGCAGC¹3 (SEQ ID NO 18) A PACE¹F1 láncindító egy HindlII helyet visz be a startkodont megelõzõ 3. nukleotiddal kezdõdõ PACEszekvencia oldalához, míg a PACE-R2-láncindító egy stopkodont visz be a 71. aminosav után, amely a PACE extracelluláris domén végén található, valamint egy EcoRI-helyet ad hozzá a stopkodon 3 végéhez. A temperálás ( anneal ) során a PACE-R1-láncindító egy belsõ BamHI-hely 3 végéhez, a PACE-R2-láncindító pedig annak végéhez illeszkedik. Két RT¹PCRreakciót terveztünk, PACE-F1/R1 vagy PACE- F2/R2 láncindító párok mindegyikének 2 pm mennyiségével és ng humán felnõtteredetû májból származó RNS-sel (Clontech, Palo Alto, CA), 0 l RT¹PCRreakcióelegyben, SuperScript One Step RT¹PCR és PLATINUM Taq rendszer (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. A reakciót MJ Thermocycler készülékben végeztük, az alábbi ciklusok mellett: 0 C¹on percen át; 94 C¹on 2 percen át; 94 C¹on másodpercen át, 8 C¹on másodpercen át, 72 C¹on 2 percen át, ez utóbbi három paramétert cikluson keresztül ismételtük; majd 72 C¹on percen át. Az egyes fragmenseket pgem T¹Easy vektorba (Promega, Madison, W) ligáltuk és teljes hosszukban megszekvenáltuk. Az F2¹R2-fragmenst ezt követõen pcdna6 V/His plazmidba (Invitrogen, Carlsbad, CA) szubklónoztuk a BamHI/EcoRI-helyek alkalmazásával, majd az F1¹R1-fragmenst ebbe a konstrukcióba klónoztuk a HindlII/BamHI-helyek alkalmazásával. A pcdna6-pace végsõ plazmid a PACE oldható formáját állítja elõ, mivel transzmembrán régióját (1 71 aminosavakat) deletáltuk. A pcdna6-pace plazmidban a PACE szekvenciáját lényegében ismertetik Harrison és mtsai. [Seminars in Hematology 3, 4 (1998)]. 3. példa: Fc¹VII¹es faktor konstrukció klónozása A VII¹es faktor kódolószekvenciáját RT¹PCR-eljárással kaptuk meg humán magzati eredetû májból (Clontech, Palo Alto, CA). A klónozott régió a cdns-szekvenciát tartalmazta, amely éppen a stopkodon elõtt végzõdött. Az N¹terminális végre egy Sbfl-helyet vittünk be. A C¹terminális végre egy BspEIhelyet vittünk be. A konstrukciót PCR-eljárással klónoztuk, az alábbi láncindítók alkalmazásával: 3 irányban: ¹GCTACCTGCAGGCCACCATGG- TCTCCCAGGCCCTCAGG¹3 (SEQ ID NO 19) irányban: ¹CAGTTCCGGAGCTGGGCACGG- CGGGCACGTGTGAGTTTTGTCGGGAAAT GG¹3 (SEQ ID NO ), és az alábbi körülmények mellett: 9 C¹on percen át; 9 C¹on másodpercen át, C¹on másodpercen át, 72 C¹on 1 percen át, ez utóbbi három 16

17 1 HU T2 2 paramétert cikluson keresztül ismételtük; majd egy végsõ extenziós ciklus 72 C¹on percen át. A fragmenst Sbfl-BspEI enzimekkel emésztettük, majd IgG1 Fc¹fragmensét kódoló ped.dc¹fc plazmidba inszertáltuk példa: VII¹es faktor¹fc monomer-dimer hibrid expresszálása és tisztítása VII¹es faktor¹fc fúziós proteint expresszáló CHO DG¹44 sejteket állítottunk elõ. A transzfektálásig a CHO DG¹44 sejteket 37 C¹on, % parciális CO 2 -nyomás mellett, nukleoziddal, ribonukleoziddal és % hõinaktivált magzati borjúszérummal kiegészített, MEM Alpha tápközegben tenyésztettük. DG¹44 sejteket helyeztünk ki 0 mm¹es szövettenyésztõ Petri-csészékbe és azokat 0 %¹os benõttségig tenyésztettük. Összesen g DNS¹t alkalmaztunk egyetlen, mm¹es Petri-csésze tartalmának a transzferálásához: dimer transzfektálása esetében 9 g ped.dc.fvii¹fc plusz 1 g pcdna6-pace DNS¹t, vagy monomer transzfektálása esetében 7, g ped.dc.fvii¹fc plusz 1, g pcdna3/flag¹fc plusz 1 g pcdna6-pace DNS¹t. A sejteket a Superfect transfection reagent használati útmutatóban (Qiagen, Valencia, CA) ismertetettek szerint transzfektáltuk. A tápközeget 48 óra múlva eltávolítottuk és mindkét transzfektálás esetében % dializált magzati borjúszérummal és g/ml blasticidin reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) kiegészített, nukleozidok nélküli MEM Alpha tápközegre cseréltük, míg a monomer-dimer hibriddel transzfektált sejtek tápközegét 0,2 mg/ml geneticin reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) is kiegészítettük. Tíz nap múlva, a sejteket 0,2%¹os tripszinnel leválasztottuk a lemezrõl és T2 szövettenyésztõ flaskába helyeztük át, és a szelekciót további 14 napon át folytattuk, amíg a sejtek jól kezdtek szaporodni, jelezve, hogy stabil sejtvonalak alakultak ki. Ezt követõen, az expressziót 2 nmol/l metotrexát hozzáadásával fokoztuk. Körülbelül 2 7 sejttel oltottunk be g/l K 3 -vitaminnal (menadion-nátrium-biszulfit, Sigma, St Louis, MO) kiegészített tápközeg 0 ml¹ét, 1700 cm 2 ¹es görgõflaskában (Corning, Corning, NY). A görgõflaskát %¹os parciális CO 2 -nyomás mellett, 37 C¹on, 72 órán át inkubáltuk. A tápközeget ezt követõen g/ml K 3 -vitaminnal kiegészített, 0 ml szérummentes produkciós tápközegre (DMEM/F12 tápközeg, g/ml szarvasmarha-eredetû inzulinnal és g/ml gentamicinnel) cseréltük. A produkciós tápközeget (kondicionált tápközeget) napon át mindennap összegyûjtöttük, és 4 C¹on tároltuk. Minden egyes gyûjtést követõen a görgõflaskákhoz friss produkciós tápközeget adtunk, és a flaskákat visszahelyeztük az inkubátorba. Az összegyûjtött tápközeget elõször Sartoclean üvegrost szûrõn (3,0 m+0,2 m, Sartorius Corp., Göttingen, Németország), ezt követõen Acropack 00 szûrõn (0,8 m + 0,2 m, Pall Corp., East Hills, NY) derítettük. A derített tápközeget ezután körülbelül húszszorosára koncentráltuk Pellicon Biomax tangens irányú átfolyású szûrõkazetták alkalmazásával ( kda MWCO, Millipore Corp., Billerica, MA). Ezt követõen, az Fc¹kimérákat úgy fogtuk be a koncentrált tápközegbõl, hogy a tápközeget Protein¹A Sepharose 4 Fast Flow oszlopon (AP Biotech, Piscataway, NJ) engedtük át. Száz ml¹es ( cm) oszlopra, az oszlop térfogatának egy ml¹ére vonatkoztatva mg Fc¹proteint vittünk fel, 0 cm/óra lineáris átfolyási sebesség mellett abból a célból, hogy 3 perc tartózkodási idõt érjünk el. Ezt követõen, az oszlopot több mint oszloptérfogat mennyiségû 1 DPBS-sel mostuk, hogy eltávolítsuk a nemspecifikusan kötõdött proteineket. A specifikusan kötõdött proteineket 0 mmol/l koncentrációjú glicinnel (ph=3,0) eluáltuk. A proteincsúcsot tartalmazó elúciós frakciókat ezt követõen úgy neutralizáltuk, hogy egy rész 1 mol/l Tris-HCl puffert (ph=8,0) adtunk rész eluált frakcióhoz. A kiméra proteinnek Protein¹A oszlopon történõ átengedése az inaktív VII¹es faktort aktivált VIIa faktorrá konvertálta (2. ábra). További aktiválás érhetõ el a proteinnek anioncserélõ oszlopon történõ átengedésével [Peders és mtsai.: Biochemistry 28, (1989)]. A monomer-dimer hibrid transzfekciós proteinmintát további tisztításnak vetettük alá, mivel az FVIIFc:FVII¹Fc homodimer, FVII¹Fc:Flag¹Fc monomerdimer hibrid és Flag¹Fc:Flag¹Fc homodimerek elegyét tartalmazta. Abból a célból, hogy a preparátumból eltávolítsuk a Flag¹Fc homodimereket, a Protein¹A Sepharose Fast Flow oszlopról gyûjtött elegyet elõször mmol/l MES, mmol/l NaCl (ph=6,1) oldattal szemben dializáltuk, majd ezt követõen Unosphere S kationcserélõ oszlopon (BioRad Corp., Richmond, CA) engedtük át. Az oszlop üzemelési körülményei mellett, a Flag¹Fc monomer-dimer hibrid összesített töltése neutrális, és átfolyik az oszlopon, míg a hfvii¹fc konstrukciók pozitív töltésûek, ezért az oszlophoz kötõdnek és csak magasabb ionerõsség mellett eluálódnak. A dializált preparátumot ezt követõen 1,1 11 cm¹es (9,9 ml¹es) oszlopra vittük, 10 cm/óra átfolyási sebesség mellett. A mosás és eluálás alatt az átfolyási sebességet 00 cm/óra értékre emeltük. Az oszlopot egymást követõen mostuk 8 oszloptérfogatnyi mmol/l MES, mmol/l NaCl (ph=6,1) oldattal és 8 oszloptérfogatnyi mmol/l MES, mmol/l NaCl (ph=6,1) oldattal. A kötõdött proteint mmol/l MES, 70 mmol/l NaCl (ph=6,1) oldattal eluáltuk. A proteincsúcsot tartalmazó, eluált frakciókat összegyûjtöttük, 0,2 m pórusú szûrõkorongon sterilre szûrtük és 80 C¹on tároltuk. FLAG elleni MAB affinitás oszlopot alkalmaztunk mindkét Fc¹molekulához fuzionált hfvii-proteint tartalmazó kiméra Fc¹dimerek elválasztására olyan kiméra Fc¹dimerektõl, amelyek egyetlen FLAG-peptidet és egyetlen hfvii fúzióját tartalmazták. Az Unosphere S eluátum elegyet 1:1 arányban hígítottuk mmol/l Tris, 0 mmol/l NaCl, mmol/l CaCl 2 (ph=8,0) összetételû oldattal és 1,6 cm¹es FLAG elleni M2 sepharose oszlopra (Sigma Corp., St. Louis, MO) vittük fel, cm/óra egyenletes átfolyási sebesség mellett. A terheléssel a <2, mg monomer-dimer hibrid koncentrációt céloztuk 17

18 1 HU T2 2 meg, az oszlop térfogatának egy ml¹ére vonatkoztatva. A terhelést követõen az oszlopot oszloptérfogatnyi, mmol/l Tris, 0 mmol/l NaCl, mmol/l CaCl 2 (ph=8,0) összetételû pufferrel mostuk. Ezt követõen, a monomer-dimer hibrideket 0 mmol/l glicinnel (ph=3,0) eluáltuk. A proteincsúcsot tartalmazó, eluált frakciókat úgy neutralizáltuk, hogy 1 rész 1 mol/l Tris- HCl puffert (ph=8,0) adtunk rész eluált frakcióhoz. Az összegyûjtött mintákat 80 C¹on tároltuk.. példa: VII¹es faktor¹fc homodimer és monomer/dimer hibridek olvadási aktivitásának a vizsgálata StaClot FVIIa-rTF vizsgálókészletet (Parsippany, NJ) szereztünk be és a vizsgálatot úgy módosítottuk, amint azt Johannessen és mtsai. ismertették [Blood Coagulation and Fibrinolysis 11,S 19 (00)]. Standard görbét készítettünk az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 89/688 számú FVIIa standardjával. A vizsgálattal két VII¹es faktor molekulát és két Fc¹molekulát tartalmazó homodimer alvadási aktivitását hasonlítottuk össze egyetlen VII¹es faktor molekulát és két Fc¹molekulát tartalmazó monomer/dimer hibrid alvadási aktivitásával. Mind a homodimer, mind a monomer/dimer hibrid esetében jelentõs alvadási aktivitást tapasztaltunk. A monomer/dimer hibrid alvadási aktivitása a homodimerhez hasonlítva majdnem négyszeres volt (4. ábra). 6. példa: VII¹es faktor¹fc kötõdése shfcrnreceptorhoz VII¹es faktor¹fc kötõdését vizsgáltuk oldható, humán eredetû neonatális Fc¹receptorhoz (shfcrn) Biacore 00 készülékkel (Biacore, Uppsala, Svédország). CM-csipet (Biacore, Uppsala, Svédország) vontunk be 0 rezonanciaegység ( resonance units, RU) shfcrn-receptorral, aminkémia alkalmazásával. A VII¹es faktor¹fc fúziós proteint tízszeresére vagy százszorosára hígítottuk 0 mmol/l PO 4, 0 mmol/l NaCl és 0,01% Tween¹ (ph=6,0) összetételû oldatban és (két párhuzamossal) a felszínre injektáltuk percen át, l/perc sebességgel. A mintákat utánzott bevonatú felszínre is injektáltuk, amely kontrollreferenciaként szolgált. A csipet 0 mmol/l PO 4 oldattal (ph=8,0) regeneráltuk. A válasz, amelyet az injektálás befejezése elõtt másodperccel jegyeztünk fel, specifikus kötõdésre utalt (. ábra) példa: VII¹es faktor¹fc fúziós protein orális felvétele újszülött patkányokban Huszonöt gramm testtömegû, 9 napos újszülött patkányokat szereztünk be (Charles River, Wilmington, MA) és hagytunk akklimatizálódni 24 órán át. A patkányoknak orálisan FVIIa¹Fc homodimert vagy monomer/dimer hibridet (amely két Fc¹láncot tartalmazott, és ezek közül az egyik Fc¹VII fúziós proteinhez kapcsolt) adtunk be. Kétszáz l FVIIa¹Fc oldatot alkalmaztunk 1 mg/kg dózis eléréséhez. Az oldat mg/ml szójabab-eredetû tripszin-inhibitorral kiegészített Tris- HCl puffert (ph=7,4) tartalmazott. A patkányokat különbözõ idõpontokban CO 2 -belégzéssel eutanizáltuk, és szívpunkcióval 0 l vért vettünk. Plazmát úgy állítottunk elõ, hogy a vérhez egytized térfogat 3,8%¹os nátrium-citrátot adtunk, és szobahõmérsékleten, 1268 g mellett centrifugáltuk. A vizsgálatok során a plazmákat frissen vagy C¹on történõ tárolást követõen alkalmaztuk. Ezt követõen, a mintákat ELISA-eljárással vizsgáltuk. Az újszülött patkányeredetû plazmamintákon Asserachrom Factor VII:Ag ELISA vizsgálatot végeztünk. Factor VII:Ag ELISA vizsgálókészletet (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) szereztünk be, és alkalmaztunk a készlet használati útmutatója szerint, egyetlen változtatással. A standard görbéhez való standardot tisztított VIIa faktor¹fc fúziós proteinnel helyettesítettük. Az in vivo vizsgálatok esetében a standardot ugyanolyan százalékos normál állati plazmában végeztük, mint amilyet vizsgáltunk. A vizsgálatok azt mutatták, hogy mind a monomer/dimer hibridek, mind a dimerek orális adagolása sikeres volt (7. ábra). Monomer/dimer hibrideket alkalmazó, idõ függvényében végzett vizsgálat az orálisan beadott VIIa faktor¹fc tartós plazmaszintjeit mutatta az idõ függvényében, 18 órás felezõdési idõ (T 1/2 ) mellett (6. ábra). 8. példa: VII¹es faktor¹fc intravénás adagolása törpesertéseknek Kifejlett törpesertéseket (6 kg) szereztünk be (Marshall Farms) és hagytunk akklimatizálódni két héten át. A sertéseket 12 mg/kg telazollal és 8 mg/kg xilazinnal anesztetizáltuk, és a juguláris vénába Tris-HCl pufferben (ph=7,4) VIIa faktor¹fc oldatának 3 ml¹ét adagoltuk intravénásan. Három ml vért gyûjtöttünk vacutainer csövekbe (BD Sciences, Franklin Lakes, NJ) különbözõ idõpontokban, vénapunkcióval. Plazmát úgy állítottunk elõ, hogy a vért szobahõmérsékleten, 1268 g mellett centrifugáltuk. A plazmamintákat C¹ra hûtöttük, majd ezt követõen ELISA-eljárással vizsgáltuk. A törpesertésekbõl származó mintákon Asserachrom Factor VII:Ag ELISA vizsgálatot végeztünk. A Factor VII:Ag ELISA vizsgálókészletet a Diagnostica Stago cégtõl (Parsippany, NJ) szereztük be és a vizsgálókészlet használati útmutatója szerint alkalmaztuk, egyetlen változtatással. A standard görbéhez való standardot tisztított VIIa faktor¹fc fúziós proteinnel helyettesítettük. Az in vivo vizsgálatok esetében a standardot ugyanolyan százalékos normál állati plazmában végeztük, mint amilyet vizsgáltunk. Intravénásan beadott monomer/dimer hibrid plazmaszintjeit mutatja a 8A. ábra. A felezõdési idõt 9,4 órában határoztuk meg. Monomer/dimer hibrid kiméra proteint alkalmazó, idõ függvényében végzett vizsgálat az intravénásan beadott VIIa faktor¹fc tartós plazmaszintjeit mutatta az idõ függvényében, 22 órás felezõdési idõ (T 1/2 ) mellett (8A. ábra). Az alvadási aktivitást StaClot FVIIa-rTF vizsgálókészlettel mértük (8B. ábra). Az alvadás felezõdési ideje (T 1/2 ) az egyik sertés esetében 6,4 óra, a másik sertés esetében,7 óra volt. 18

19 1 HU T példa: Fc¹IX¹es faktor konstrukció klónozása Humáneredetû IX¹es faktor kódolószekvenciát, beleértve a prepropeptidszekvenciát, RT¹PCR-eljárással kaptunk, felnõtt emberi májeredetû RNS-bõl, az alábbi láncindítók alkalmazásával: natfix¹f: -TTACTGCAGAAGGTTATG- CAGCGCGTGAACATG¹3 (SEQ ID NO 21) F9¹R: ¹TTTTTCGAATTCAGTGAGCTTTGTTTT- TTCCTTAATCC¹3 (SEQ ID NO 22) Húsz ng felnõtt emberi máj eredetû RNS¹t (Clontech, Palo Alto, CA) és a láncindítók mindegyikének 2 pm mennyiségét adtuk RT¹PCR-reakcióhoz, SuperScript One-Step RT¹PCR és Platinum Taq rendszer (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. A reakciót MJ Thermocycler készüléken végeztük, az alábbi ciklusok mellett: 0 C¹on percen át; 94 C¹on 2 percen át; 94 C¹on másodpercen át, 8 C¹on másodpercen át, és 72 C¹on 1 percen át, ez utóbbi három paramétert 3 cikluson át ismételtük; és végül 72 C¹on 1 percen át. A fragmenst gélen tisztítottuk Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával, Pstl-EcoRI enzimekkel emésztettük, gélen tisztítottuk, majd ped.dc.xfc plazmid megfelelõ emésztési helyére klónoztuk. A IX¹es faktor¹fc aminosavszekvenciáját és DNS-szekvenciáját a 9. ábra mutatja.. példa: IX¹es faktor¹fc homodimer és monomerdimer hibrid expresszálódása és tisztítása IX¹es faktor¹fc fúziós proteint expresszáló CHO DG¹44 sejteket állítottunk elõ. DG¹44 sejteket helyeztünk ki 0 mm¹es szövettenyésztõ Petri-csészékbe és azokat 0 %¹os benõttségig tenyésztettük. Összesen g DNS¹t alkalmaztunk egyetlen, mm¹es Petri-csésze tartalmának a transzfektálásához: homodimer transzfektálása esetében 8 g ped.dc.factorlx¹fc plusz 2 g pcdna6-pace DNS¹t alkalmaztunk, monomer-dimer hibrid transzfektálása esetében 8 g ped.dc.factorlx¹fc plusz 1 g pcdna3/flag¹fc plusz 1 g pcdna6-pace DNS¹t alkalmaztunk. A sejteket a Superfect transfection reagent használati útmutatóban (Qiagen, Valencia, CA) ismertetettek szerint transzfektáltuk. A tápközeget 48 óra múlva eltávolítottuk és mindkét transzfektálás esetében % dializált magzati borjúszérummal és g/ml blasticidin reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) kiegészített, nukleozidok nélküli MEM Alpha tápközegre cseréltük, míg a monomer-dimer hibriddel transzfektált sejtek tápközegét 0,2 mg/ml geneticin reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA) is kiegészítettük. Három nap múlva, a sejteket 0,2%¹os tripszinnel leválasztottuk a lemezrõl és T2 szövettenyésztõ-flaskába helyeztük át, és a szelekciót további 14 napon át folytattuk, amíg a sejtek jól kezdtek szaporodni, jelezve, hogy stabil sejtvonalak alakultak ki. Ezt követõen, az expresszálódást homodimer esetében nmol/l, monomer-dimer hibrid esetében 0 nmol/l metotrexát hozzáadásával fokoztuk. Mindkét sejtvonal esetében körülbelül 2 7 sejttel oltottunk be g/l K 3 -vitaminnal (menadion-nátrium-biszulfit, Sigma, St Louis, MO) kiegészített tápközeg ml¹ét, 1700 cm 2 ¹es görgõflaskában (Corning, Corning, NY). A görgõflaskát %¹os parciális CO 2 -nyomás mellett, 37 C¹on, 72 órán át inkubáltuk. A tápközeget ezt követõen g/ml K 3 -vitaminnal kiegészített, 0 ml szérummentes produkciós tápközegre ( g/ml szarvasmarha-eredetû inzulinnal és g/ml gentamicinnel kiegészített DMEM/F12 tápközegre) cseréltük. A produkciós tápközeget (kondicionált tápközeget) napon át mindennap összegyûjtöttük, és 4 C¹on tároltuk. Minden egyes gyûjtést követõen a görgõflaskákhoz friss produkciós tápközeget adtunk, és a flaskákat visszahelyeztük az inkubátorba. Kromatográfiás vizsgálatot megelõzõen, a tápközeget SuporCap-0 szûrõn (0,8/0,2 m, Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) derítettük. Az alábbi lépések mindegyikét 4 C¹on végeztük. A derített tápközeget Protein¹A Sepharose oszlopra vittük, oszloptérfogatnyi PBS-sel mostuk [ mmol/l foszfát (ph=7,4), 2,7 mmol/l KCl és 137 mmol/l NaCl], 0,1 mol/l glicinnel (ph=2,7) eluáltuk, majd 1: térfogatnyi 1 mol/l Tris-HCl pufferrel (ph=9,0) neutralizáltuk. Ezt követõen, a proteint PBSsel szemben dializáltuk. A monomer-dimer hibrid transzfekciós proteinmintát további tisztításnak vetettük alá, mivel az FIX¹Fc:FIX¹Fc homodimer, FlX¹Fc:Flag¹Fc monomer-dimer hibrid és Flag¹Fc:FIag¹Fc homodimerek elegyét tartalmazta. A preparátumot koncentráltuk, és 4 ml/óra (36 cm/óra) átfolyási sebesség mellett, 2,6 cm¹es (318 ml¹es) Superdex 0 Prep Grade oszlopra vittük, majd 3 oszloptérfogatnyi 1 PBS-sel eluáltuk. Az UV¹detektor által jelzett két csúcsnak megfelelõ frakciókat összegyûjtöttük és SDS-PAGE-eljárással megvizsgáltuk. Az elsõ csúcsnak megfelelõ frakciók vagy FIX¹Fc:FIX¹Fc homodimert, vagy FIX¹Fc:FlagFc monomer-dimer hibridet tartalmaztak, míg a második csúcs FlagFc:FlagFc homodimert tartalmazott. A monomer-dimer hibridet tartalmazó, de FlagFc homodimertõl mentes, minden frakciót összegyûjtöttünk, és közvetlenül egy 1,6 cm¹es FLAG elleni M2 sepharose oszlopra vittük (Sigma Corp., St. Louis, MO), cm/óra lineáris átfolyási sebesség mellett. A terhelést követõen, az oszlopot oszloptérfogatnyi PBS-sel mostuk. Ezt követõen, a monomer-dimer hibrideket 0 mmol/l glicinnel (ph=3,0) eluáltuk. A proteincsúcsot tartalmazó, eluált frakciókat ezt követõen 1: térfogatnyi, 1 mol/l Tris-HCl pufferrel neutralizáltuk, majd SDS-PAGE-eljárással vizsgáltuk, redukáló és nem redukáló körülmények mellett. A frakciókat PBS-sel szemben dializáltuk, 1 mg/ml koncentrációig koncentráltuk és 80 C¹on tároltuk. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Kiméra protein, amely immunglobulin konstans régió legalább egy részét, továbbá a VIII¹as faktor, VIIIa faktor, V¹ös faktor, Va faktor, IX¹es faktor, X¹es faktor, XI¹es faktor, XII¹es faktor, XIII¹as faktor és von Willebrand faktor közül választott, legalább egyetlen alvadási faktort és adott esetben legalább egyetlen összekötõ szekvenciát tartalmaz. 19

20 1 HU T Az 1. igénypont szerinti kiméra protein, ahol az immunglobulin IgG. 3. A 2. igénypont szerinti kiméra protein, ahol az immunglobulin konstans régió része Fc¹fragmens. 4. A 2. igénypont szerinti kiméra protein, ahol az immunglobulin konstans régió FcRn kötõpartner.. A 2. igénypont szerinti kiméra protein, ahol az Fc¹fragmens a SEQ ID NO 2 szerinti szekvenciával legalább 80%¹os azonosságot mutató aminosavszekvenciát tartalmaz. 6. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti kiméra protein, ahol az alvadási faktor a IX¹es faktor. 7. Gyógyászati készítmény, amely 1. igénypont szerinti kiméra proteint és gyógyászatilag elfogadható vivõanyagot tartalmaz. 8. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti kiméra protein, ahol a kiméra protein dimer. 9. A 8. igénypont szerinti kiméra protein, ahol a dimer homodimer.. Kiméra protein, amely dimert tartalmaz, amely elsõ és második láncot tartalmaz, ahol az elsõ lánc immunglobulin-fc-fragmenst, valamint VII¹es faktort vagy VIIa faktort tartalmaz, és a második lánc immunglobulin-fc-fragmenst tartalmaz VII¹es faktor és/vagy VIIa faktor nélkül. 11. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti kiméra protein, amely az alábbi képletet foglalja magában: X-L-F, ahol F jelentése immunglobulin Fc¹fragmense, L jelentése összekötõ szekvencia vagy közvetlen kötés és X az alábbiakból álló csoportból választott: VIII¹as faktor, VIIIa faktor, V¹ös faktor, Va faktor, IX¹es faktor, X¹es faktor, XI¹es faktor, XII¹es faktor, XIII¹as faktor és von Willebrand faktor. 12. A 11. igénypont szerinti kiméra protein, ahol F olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely legalább 80%¹os azonosságot mutat a SEQ ID NO 2 szerinti aminosavszekvenciával. 13. A 11. igénypont szerinti kiméra protein, ahol L jelentése olyan összekötõ szekvencia, amely körülbelül 1 aminosavat tartalmaz. 14. A 11. igénypont szerinti kiméra protein, ahol L jelentése olyan összekötõ szekvencia, amely körülbelül 1 aminosavat tartalmaz. 1. A 11. igénypont szerinti kiméra protein, ahol L jelentése olyan összekötõ szekvencia, amely körülbelül 1 aminosavat tartalmaz. 16. A 11. igénypont szerinti kiméra protein, ahol L jelentése (Gly) n szekvenciát tartalmazó összekötõ szekvencia, ahol n jelentése körülbelül 1¹tõl körülbelül ¹ig bármely egész szám. 17. A 11. igénypont szerinti kiméra protein, ahol L jelentése (GGS) n vagy (GGGGS) n szekvenciát tartalmazó összekötõ szekvencia, ahol n jelentése körülbelül 1¹tõl körülbelül ¹ig bármely egész szám. 18. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti kiméra protein, ahol a kiméra protein elõsegíti a hemosztázist. 19. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti kiméra protein terápiásan hatásos mennyiségének az alkalmazása hemosztatikus rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására.. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a hemosztatikus rendellenesség A típusú vagy B típusú hemofília. 21. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az alvadási faktor IX¹es faktor. 22. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer intravénásan, szubkután, intramuszkulárisan vagy nyálkahártyafelszínen át történõ beadásra lett kiszerelve. 23. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer orális, nazális, rektális, vaginális vagy bukkális úton történõ beadásra lett kiszerelve. 24. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer pulmonális úton történõ beadásra lett kiszerelve. 2. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer nem parenterális alkalmazásra lett kiszerelve. 26. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer 0,1 00 g/kg dózisban történõ alkalmazásra lett kiszerelve. 27. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer naponta történõ alkalmazásra lett kiszerelve. 28. Eljárás az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti kiméra protein elõállítására, amely eljárás tartalmazza: a) sejt transzfektálását olyan DNS-konstrukcióval, amely immunglobulin konstans régió legalább egy részét kódoló DNS-szekvenciát, amely alvadási faktort kódoló második DNS-szekvenciához mûködõképesen kapcsolt, valamint adott esetben endoproteázt kódoló harmadik DNS-szekvenciát tartalmaz; b) a sejt tenyésztését olyan körülmények mellett, hogy a kiméra protein expresszálódjon; és c) a kiméra protein izolálását a sejtbõl. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, ahol K¹vitamin jelenléte a tenyésztési körülményekhez tartozik.. A 29. igénypont szerinti eljárás, ahol az endoproteáz PACE. 31. A 28. igénypont szerinti eljárás, ahol a sejt eukarióta sejt. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, ahol a sejt CHO-sejt vagy BHK-sejt. 33. A 28. igénypont szerinti eljárás, amely tartalmazza továbbá sejt transzfektálását olyan második DNS-konstrukcióval, amely immunglobulin konstans régió legalább egy részét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz az alvadási faktort kódoló, második szekvencia nélkül. 34. A 28. vagy 33. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunglobulin konstans régió része Fc¹fragmens. 3. A 28. vagy 33. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunglobulin konstans régió része IgG Fc¹fragmens. 36. A 28. vagy 33. igénypont szerinti eljárás, ahol az immunglobulin konstans régió legalább egy része FcRn-kötõpartner.