Molekuláris genetikai alkalmazások a klinikai laboratóriumi gyakorlatban

Átírás

1 Molekuláris genetikai alkalmazások a klinikai laboratóriumi gyakorlatban 1. Humán klinikai molekuláris genetika. 2. Állatorvosi molekuláris genetika. 3. Személyazonosság vizsgálata - igazságügyi orvostani alkalmazások. 4. Hisztokompatibilitási vizsgálatok.

2 Molekuláris genetikai diagnosztika 1. Monogénes betegségek analízise. 2. Kockázati tényezık meghatározása. 3. Prognosztika. 4. Terápiára adott válasz monitorozása. 5. Farmakogenetika. 6. Normál populáció tesztelés (szőrıprogramok).

3 Módszerek 1. Vizsgálati anyag: nukleinsav. 2. Minta: alvadásgátolt vér (fehérvérsejt), szájüreg mosó folyadék, tenyésztett sejt, stb. 3. Vizsgálati módszerek Nukleinsav izolálás (DNS szintézis RNS-bıl) DNS szakasz(ok) amplifikációja (PCR) Mutáció keresés - Mutáció szőrés (SSCP, HA, dhplc, HRM) - Mutáció detektálás (restrikciós emésztés, allélspecifikus PCR, OLA) Gold standard: DNS szekvenálás 4. Interpretáció.

4 Mutációk Különbözı mutációk a génben ugyanazt (hasonló) fenotípust okoznak. pl. haemophilia A Ugyanaz a mutáció figyelhetı meg újra és újra Mutációs forró pontok, instabil genomszakasz. pl. achondroplasia, FGFR3 mutáció (nt.1138) Founder

5

6 Mutációtípusok elıfordulási gyakorisága

7 Mutációk elıfordulási gyakorisága öröklıdés szerint

8 Súlyos, monogénes öröklött betegség genetikai hátterének kiderítése

9 Cystás fibrosis (mucoviscidosis, CF) A kaukázusi népcsoport egyik leggyakoribb, igen súlyos, autoszomális recesszív módon öröklıdı betegsége. A szervezet exocrin mirigyeket tartalmazó szerveit érinti, a betegség következtében kórosan megváltozik a verejték elektrolit-tartalma (verejtékteszt: >60 mm Cl - ), megváltozott ionösszetételő viszkózus secretumok jelennek meg és győlnek fel a pancreas, tüdı, máj állományában és az epeutakban. Születéskor várható élettartam 37 év (50 évvel ezelıtt 10 év).

10 A CFTR protein szerkezete - 12 transzmembrán domén (TM), amelyek a klorid csatornát alkotják - 2 NBD, 1 szabályozó domén Mőködésének szabályozása az NBD-hez kötıdı ATP hidrolízisén és a szerinek foszforilációján keresztül valósul meg - A leggyakoribb (50-70 %) CF mutáció az NBD1-ben található ( F508)

11 A CF genetikai háttere Autoszomális recesszív öröklıdésmenet ~ 1600 mutációt írtak le a CFTR génben (7q) Gyakori (~30), ritka (>1000) Incidencia: (kaukázusi), (ázsiai) Minden 27. kaukázusi eredető ember heterozigóta valamelyik CFTR gén mutációra nézve USA: újszülöttkori szőrés 40 államban kötelezı (IRT), az eredménye csökkenı incidencia American College of Obstetricians and Gynecologists: minden gyermeket vállalv llaló párnak ajánlott CF genetikai hordozó szőrésen sen részt r venni.

12 Magyarországi adatok a CF mutációk megoszlásáról 2 nemzetközi közlés. Nemeti M et al Nemeth K et al 1992 Hum Genet J Inher Metab D 84 család. 458 CF beteg. F508: 54 (64,4%) 49,9% R553X: 2 1,3% G542X: 1 3,0% G>A: 1 NA W1282X: 1 NA N1303K: 1 1,5% G551D: 0 0,0% 621+1G>T: 0 NA

13 A CFTRdele2,3(21kb) mutáció Hum Genet, országra kiterjedı kollaboráció -olyan betegekben találták, akiknél az e2 és e3 exonok amplifikálása sikertelen volt (homozigóta mutánsok a CFTRdele2,3(21kb) delécióra) - a 4. exonban korai terminációt eredményez - a mutáció súlyos CF fenotípussal jár - a mutáció elterjedése követi az elsı milleniumi szláv vándorlásokat

14 A CFTRdele2,3(21kb) mutáció CFTRdele2,3(21kb) deléció a 2-es és 3-as exonokat, mint funkcionális egységeket érinti ~21000 bp kiesése intron 1 e2 i2 e3 intron 3 6 kb 0,1 kb 4,7 kb 0,1 kb 10,3 kb

15 Betegek, anyagok és módszerek 1. Beteg kiválasztási kritériumok: - klinikailag súlyos CF - korábban multiplex mutáció detektálási módszerrel vizsgáltak - n=43 2. Kontrollok: - heterozigóta CFTRdele2,3(21kb) a Prágai Egyetemtıl 3. A deléció detektálása: - a deléciós pontra tervezett PCR primerekkel - DNS szekvenálás a deléciós pont kimutatására/ megerısítésére

16 Eredmények A CFTRdele2,3(21kb) mutáció detektálása: - 4/43 beteg - mind heterozigóta formában - minden esetben együtt a F508 mutációval - minden családban transz öröklıdést mutat a F508 mutációval - a családvizsgálatok minden esetben összetett heterozigótaságot bizonyítanak - a DNS szekvenálás igazolja a deléciós pont azonosságát az irodalmi adatokkal intron 1 intron 3

17 CFTR mutációk elıfordulása keletmagyarországi CF betegekben 9% 5% 2% 2% 2% 24% deltaf508 -/- deltaf508 +/-, CFTR dele2,3(21kb) deltaf508 +/-, N1303K deltaf508 +/-, G-A 7% 2% 2% G542X, N1303K G542X, R347P deltaf508 +/- G542X +/- N1303K +/- 45% no mutation

18 Konklúzió A szláv etnikai hátterő népességre jellemzı CFTRdele2,3(21kb) mutáció elıfordul a magyar CF betegekben is. A mutáció gyakorisága adataink szerint a F508 mutáció után következik, minden korábban detektált CF mutációnál (~30) gyakoribb. Fentiek alapján a CFTRdele2,3 mutáció részét kell hogy képezze a magyar CF molekuláris genetikai diagnosztikai vizsgálati panelnek.

19 Kockázati tényezık vizsgálata multifaktoriális betegségekben - gyakori SNP-k -

20 Idıskori macula degeneráció (AMD) I. A fejlett országokban a 65 év feletti vakság vezetı oka. A betegség a szem éleslátásért felelıs területét támadja meg. Magyarország: 6000 beteg évente (2800 késıi, nedves típus). Tünetek: - olvasás nehezítettsége, - színlátási képesség romlása, - centrális homályok, torzképek, - centrális vakság. Pathogenezis: a retinális pigment epithelium (RPE) romló funkciója. Kockázati tényezık: - UV expozíció, dohányzás, - hypertónia, oxidatív stressz, - kaukázusi rassz, - genetikai meghatározottság.

21 Stádiumok: AMD II. 1. Korai: - RPE egyenetlenségek, - soft drusenek száraz 2. Késıi: AMD - geographicus atrophia, - subretinális neovascularizációs membrán. - nedves AMD Arroyo, JAMA 2006 retina RPE Bruch-m. choroidea

22 AMD genetika 1. A komplement faktor H (CFH) a komplement rendszer alternatív útvonalának szabályozó molekulája. CFH Y402H: a 7. SCR doménben, a molekula egyik heparin-és CRP kötıhelyén. Következménye: megváltozott sejtfelszíni affinitás. Heparin kötıhelyek CRP kötıhelyek JEM LOC rs (vagy HTRA1 rs ). SNP-k. Erıs kapcsoltság, ismeretlen funkció.

23 Eredmények 1. Magyarországon a kockázati CFH allél homozigóta elıfordulása 7-8%, míg a LOC esetében ez 3-4%. 2. A polimorfizmusok inkább homozigóta formában jelentenek kockázatot, de az akár szeres is lehet. 3. A genotípus kombinációk további kockázatnövekedéssel járnak: CFH -/-, LOC +/- OR (95%CI): 15,0 (3,2-71,0) a késıi stádiumú betegekben.

24 Farmakogenetika

25 50 éve ismert a gyógyszerekre adott egyéni válasz. Farmakogenetika: hogy befolyásolja az öröklıdés a választ? Enzim aktivitás 100% 0% Arch Pharmacol 2004 CYP2D6

26 Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) A tiopurin gyógyszerek fı metabolizálója. 6-mercaptopurine, 6- thioguanine használata: AML, ALL. Azathioprine (AZA, Imuran): immunszuppresszáns. Gyulladásos bélbetegségek, RA, autoimmun hepatitis, szervtranszplantáltak. UK: 30-40,000 beteg évente. Az aktív metabolit a 6-TGN. A TPMT enzim a tiopurin gyógyszerek inaktív metabolittá történı konverziójáért felelıs. A TPMT aktivitás nagy populáción belüli variációt mutat. EJHG 2009

27 TPMT PM: dózis-asszociált mellékhatások. 90% magas (normál aktivitás), 10% közepes, 1:300 PM. TPMT*2: G238C, TPMT*3A: G460A és A719G, TPMT*3B: G460A, TPMT*3C: A719G együtt felelıs a PM és IM fenotípusért 80-95%-ban. Interetnikai variabilitás: TPMT*3A 4%-ban fordul elı kaukázusi populációban, hiányzik az orientálisban. Clin Pharmacol Ther 1997 PM: két null allél (homozigóta vagy összetett heterozigóta).

28 IM: egy mutáns allél, PM: két mutáns allél (homozigóta vagy összetett heterozigóta). TPMT hiány esetén a standard dózisú 6-merkaptopurin vagy AZA életveszélyes myeloszuppresszív mellékhatásokkal járhat. A TPMT PM betegekben a standard dózis 8-15-öd része elegendı lehet. n=101. Fı diagnózis: gyulladásos bélbetegség (67). Eredmények: *1*1 (vad típus): 90 beteg. Heterozigóta genotípus: 11 beteg. Genotípusok megoszlása: *1*2: 1 beteg, *1*3A: 6 beteg, *1*3C: 2 beteg, ritka allélek (*1*9, *1*20): 2 beteg. NEJM 2003

29 Közremőködık: CF. Gönczi Ferenc, Nagy Béla, Újhelyi Rita, Milan Macek, Dzsudzsák Erika, Ajzner Éva, Gombos Éva, Madar László, Ivády Gergely. AMD. Losonczy Gergely, Fekete Ágnes, Káldi Ildikó, Vokó Zoltán, Takács Lili, Ajzner Éva, Vajas Attila, Kasza Márta, Dzsudzsák Erika, Berta András. Kappelmayer János.

30

31 Milyen vizsgálatok segítségével lehet új kockázati tényezıket találni? - Teljes genom szőrés eset-kontroll keretek között Pl. NEJM 2007, Wellcome Trust Case Control Consortium (1926 beteg, 2938 kontroll) + Német MI study ( ) , ill SNP analízis WTCCC: 9 lókusz Német vizsgálat: ezek közül kettıben van szignifikáns különbség Mindkettıben egyértelmő: 9p21.3 (SNP, rs ) Kombinált analízis: még 4 lókusz lehet felelıs.

32 Mekkora a kockázat? Kockázat növekedés (esélyhányados) 1.08 (95%CI: )-tól 1.37 (95%CI: ), azaz 8-37% (!).

33 Akkor mire jó? "These estimates demonstrate the limited potential of the variants thus far identified (singly or in combination) to provide clinically useful prediction of disease." Wellcome Trust Case Control Consortium. Genomwide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature 2007;447: Patogenetikai utak felderítése. Az esetleges additív (sokszorozódó) hatások felmérése.

34 Prosztata tumor kockázat becslés - eset-kontroll, 2893 beteg, 1715 kontroll - 16 SNP-t teszteltek - 5 különbözı kromoszóma régió - a betegek 1,4%-a esett a legmagasabb kockázatú csoportba Zheng et al NEJM 2008