II. GENOMIKA: TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "II. GENOMIKA: TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN"

Jakab Hajdu
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 II. GENOMIKA: TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN

2 Genomika Strukturális Funkcionális Integratív

3 Strukturális genomika Genomkönyvtárak DNS szekvenálás Genom programok Polimorfizmusok RFLP

4 DNS könyvtár készítés humán genom 1. Emésztés RE-kal Emberi duplaszálú (ds) DNS (genomi) DNS fragmensek milliói DNS fragment plazmidba építése Plazmidok baktériumba juttatása Rekombináns DNS molekulák Génkönyvtár

5 Genomkönyvtár készítés 2. 2.: 1.: ligálás emésztés plazmid restrikciós vektorba endonukleázzal

6 Genomkönyvtár készítés : 2.: transzformáció ligálás plazmid vektorba Escherichia coli-ba

7 Génkönyvtárak 4. Genom könyvtár: klóngyűjtemény, amelyben megtalálható egy adott organizmus genomjának minden darabja (genom projektek) Felhasználása: szekvenálás, gének izolálása cdns könyvtár: egy organizmus összes mrns-ének másolatait tartalmazza Felhasználás: génszerkezet megállapítása, cdns-ek izolálása (intron-mentes gének). A transzkriptomot hivatott reprezentálni. EST könyvtár: expressed sequence tag, a transzkriptomot reprezentálja, de a cdns-eknek csak valamelyik végét (5 vagy 3 ) tartalmazza. Felhasználás: egy sejttípus vagy szövettípus transzkriptom gyors meghatározása (értsd: Milyen gének fejeződnek ki ebben a sejtben?). Az aktív genom gyors szekvenálására is használták.

8 cdns-könyvtár készítés 5. Hogyan készítünk cdns-t? mrns cdns 5 GGGGG 5 második cdns 3 CCCCC 3 első szál szál AAAAAAAAA 3 3 TTTTTTTTT 5 1. RNS (mrns) tisztítás: használhatunk teljes, vagy mrns preparátumot 2. Reverz transzkripció: oligo-dt primerrel és reverz transzkriptázzal (RNS-függő DNS polimeráz) elkészítjük a cdns első szálát 3. RNáz kezelés 4. Linker szintézis: terminális dezoxinukleotidil transzferázzal (DNS polimeráz, amely nem igényel templátot) oligo G linkert szintetizálunk 5. Második szál szintézis: oligo dc primerrel és DNS polimerázzal készül el a cdns második szála.

9 DNS szekvenálás A Sanger módszer 6. v Didezoxi-nukleotid módszer Stop-nukleotid módszer Láncterminációs módszer AUTOMATIZÁLHATÓ

10 DNS szekvenálás A Sanger módszer 7. (A) A DNS szál szintézis kezdete Primer 5 3 Templát DNS (B) Didezoxinukleotid T T T Bázis T T T T T T 3 5 (D) Az autoradiogram eredménye A T G C DNS szekvencia GAATTGGCGCG GAATTGGCGC GAATTGGCG GAATTGGC GAATTGG GAATTG GAATT GAAT GAA GA G Az A család dda dda (C) Amikor egy ddntp (a példában ddatp) kapcsolódik, a szál szintézise leáll dda dda T T T dda T T T dda T T T

11 Templát: 3 DNS szekvenálás A Sanger módszer 8. CCGGTAGCAACT 5 Primer : 5 GG 3 datp + ddatp dctp dgtp dttp datp dctp + ddctp dgtp dttp datp dctp dgtp + ddgtp dttp datp dctp dgtp dttp + ddttp GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT n A C G T A3 G T T G C T A C C5 A templát DNS-sel komplementer szekvencia

12 9. Automatizált DNS szekvenálás fluoreszcens ddntp-kel (A) dda ddt ddc ddg ddntp-k mindegyik típus más-más színű fluoreszcens festékkel megjelölve Szekvenálási reakció, a termékek frakciói ddt dda dda ddg ddc ddc ddg Detektor Képalkotó rendszer (B) CACCGCATCGAAATTAACTTCCAAAGTTAAGCTTGG

Valódi egymolekulás szekvenálás tsms 100-200bp-os DNS szálak szekvenálása 100

13 Valódi egymolekulás szekvenálás tsms bp-os DNS szálak szekvenálása 100 milliós nagyságrendben, egyidőben Naponta több milliárd bázis megszekvenálása

14 Humán Genom Program 10.

15 A módszerek 11. Hierarchikus módszer vs. Shotgun szekvenálás Kromoszómák (HGP) (Celera) Nagy BAC klónok készítése, végeik megszekvenálása Teljes genom feldarabolás és azonnali szekvenálás BAC klónok darabolása, szubklónozás

16 Ki a megszekvenált genom gazdája? 2001 A humán genom program eredményeként a haploid humán genom nyers szekvenciája 50 férfi és nő etnikailag diverz csoportja (HGP) 8 ismeretlen etnikumú férfi 21 férfi és nő etnikailag diverz csoportja (Celera) 2 férfi, 3 nő, 1-1 ázsiai, afrikai, latin.-amerikai 2 kaukázusi Az első teljes emberi genom 2006 Az teljes genom kiegészítése az 1-es kromoszómával 2007 Az első 2 diploid genom: Venter & Watson 2008 Egy han kínai és egy yoruba férfi diploid genomja

17 Genom programok 13.

18 Polimorfizmusok/molekuláris markerek 14. a humán genomban Polimorfizmus SNP Single Nucleotide Polymorphisms Alap szekvencia (bp) 1 STR: mikroszatellit 2-20 (?) VNTR: miniszatellit RFLP - Polimorfizmus: többalakúság (görög) Polimorf DNS lokusz: amelyen két vagy több eltérő allél figyelhető meg egy adott népességben

19 VNTR és STR analízis Amplifikálás PCR-rel A PCR primerek azon DNS szekvenciáknak komplementerei, amelyek közvetlenül a ripít szomszédságában vannak. A PCR termék hossza függ: a ripítben ismétlődő egység hosszától a kópiák számától VNTRek: 3 személy 4 pár homológ kromoszómája A B C

alapján meghatározható a kópiák száma. Adott emberre jellemző mintázatot kapunk.

20 VNTR és STR analízis Gélelektroforézis Az egység DNS szakasz hosszának ismeretében és a PCR termék mérete alapján meghatározható a kópiák száma. Adott emberre jellemző mintázatot kapunk. Anya Apa Lányok Fiúk Apasági vizsgálat, személyazonosítás DNS ujjlenyomat Érzékeny technika: egyetlen hajhagyma vagy vércsepp alapján elvégezhető

21 SNP-k 17. Egyetlen nukleotid (A, T, G, vagy C) cseréje/változása a genomban ACGGCTAA Egy variáció SNP, ha a populáción belül valamennyi allélja minimum 1% gyakorisággal előfordul. Az SNP-k 66,6%-ban C--->T cserét jelentenek.

22 SNP-k 17. Egyetlen nukleotid (A, T, G, vagy C) cseréje/változása a genomban ATGGCTAA Egy variáció SNP, ha a populáción belül valamennyi allélja minimum 1% gyakorisággal előfordul. Az SNP-k 66,6%-ban C--->T cserét jelentenek.

23 SNP-k vizsgálata: ASA 18. PCR termékek Primerek Normál allél A polimorf specifikus oligo hosszabb Polimorf allél PCR reakció Közös primer 3 vége fluoreszcensen jelölt Homozigóta normál genotípus Heterozigóta genotípus Homozigóta polimorf genotípus Elektroforézis méret

24 RFLP 19. Restriction Fragment Length Polymorphism restrikciós fragment hosszúság-polimorfizmus Restrikciós emésztést követő PCR Agaróz gél elektroforézis Ha egy báziscsere létrehoz vagy megszüntet egy restrikciós enzim felismerési helyet, akkor a hasítás mintázata megváltozik: a PCR során felsokszorozott DNS szakaszok emésztése során keletkező fragmentumok száma és mérete alapján a genotípus meghatározható.

25 RFLP 20. RFLP markerek öröklődése Szülők Gyerekek Genotípusok

26 Funkcionális genomika 21. Microchip Microarray scanner

27 A Chip (microarray) technológia 22. Strukturális genomika GENOM - szekvencia megállapítása - mutációk felderítése - egy nukleotid eltérések (SNP) - deléció inszerció - metilációs mintázat DNS chip-ek CITOPLAZMA DNS Funkcionális genomika TRANSZKRIPTOM - gén expresszió megváltozása, - splice-variánsok kimutatása - szabályozó RNS-ek (mirns) kimutatása transzkripció SEJTMAG transzláció pre-mrns protein trns Fehérje chip-ek PROTEOM mrns riboszóma - kifejeződés - módosítások - kölcsönhatások

28 A DNS chip 23. DNS-chipen több ezer gén aktivitását nyomon tudjuk követni. Minden pont egy génre jellemző szekvenciát tartalmaz. A biológiai mintából kinyert, fluoreszcensen megjelölt RNS a gén aktivitásával arányos fluoreszcens jelet ad. - a működés alapja: DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció - nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározása - egy chip 6-10,000 gén vizsgálatára alkalmas. - cdns chipek - oligonukleotid chip-ek

29 1. Chip elkészítése: - nyomtatás kontrol 2. Szövetminták begyűjtése beteg RNS tisztítás 4. Reverz transzkripció (fluoreszcens jelölés) 5. Hibridizálás 6. Detektálás

30 1. RNS izolálás. cdns szintézis. Microarray analízis - összefoglalás 25. minta 4. Adatelemzés 2. Jelölt próbák és a microarray hibridizálása 8x4x2 2x4x8 3. Szkennelés

31 ChIP (kromatin immunprecipitáció) Az antitest a specifikus transzkripciós faktorhoz köt 26. Formaldehiddel kezelt sejtek DNS fragmentek kinyerése szonikálással Antitestekkel való tisztítás A kromatin/antitest komplex összegyűjtése DNS tisztítás A fragmentek és a transzkripciós faktorok között keresztkötések létesülnek Specifikus transzkripciós faktor kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia

32 Real-Time PCR 27. alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában A fluoreszcencia intenzitása arányos a PCR termék mennyiségével a reakció végén nincs szükség gél-alapú kiértékelésre analízis: szoftver alapú

33 28.

34 29. mrns expresszió vizsgálata lépések: RNS tisztítás (totál RNS, mrns; sejt, szövet) reverz transzkripció (RNS cdns) Real-Time PCR Fogalmak Real-Time PCR = qpcr (kvantitatív) RT2-PCR = qrt-pcr RT-PCR = reverz transzkripciót követő PCR

35 30. allél-specifikus Real-Time PCR TaqMan próbával az egyik primer 3 - vége az SNP-re kell, hogy essen a DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3 -vége az SNP-vel komplementer ebben az esetben detektálható a riporter fluoreszcenciája

36 fluoreszcencia 31. kezelt-kezeletlen egészséges-beteg érzékenyebb a DNS chipeknél kevesebb minta egyidejű analízise Relatív kópiaszám meghatározás: Ct tumor egészséges ciklusszám

37 Na-biszulfitos kezelés Met CpG CpG Na-Biszulfit Met CpG UpG 2a. MetilC-Seq PCR Klónozás Szekvenálás 2b. Real-Time PCR

38 33.

39 33.

40 33.

Hasonló dokumentumok

GENOMIKA TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN

GENOMIKA TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN Strukturális genomika Genomkönyvtárak DNS szekvenálás Genom programok Polimorfizmusok RFLP DNS könyvtár készítés humán genom 1. Emésztés RE-kal Emberi