Új molekuláris biológiai módszerek

Átírás

1 Wunderlich Lívius előadásában: Új molekuláris biológiai módszerek 2012/13 tavasz

2 Központi jegyzet hiányában készült, tisztázatlan jogállású hallgatói jegyzet. Nyomokban elgépeléseket, valamint tartalmi és helyesírási hibákat tartalmazhat, felhasználás csak saját felelősségre! Ha végig olvastad, kérlek töltsd ki, mert a véleményed valóban fontos! Köszönöm! Tartalom: Alapvetően Ctrl + F Biológiai anyagok elválasztása Organizmusok a molekuláris biológiában.. 8 Makromolekulák izolálása Nukleinsav-módosító enzimek...13 PCR...19 Szekvenciaanalízis...26 Vektorok..34 Könyvtárak..41 Mutagenezis Fehérjekimutatás 61 Fehérje interakciók.63 13QD1Zs9T6Z89G3y7pg9XHr1MmV9zBqZhg 2

3 Minden kísérletnél kell egy minta, amit kezeltünk és egy, amit nem, vagyis negatív kontroll nélkül nincs kísérlet! Egyes esetekben pozitív kontrollt is alkalmazunk, ez azt jelenti, hogy egy másik mintát is előkészítünk ugyanúgy, mint a vizsgált DNS-t/fehérjét, erre sem nem szabad ugyanazt az eredményt kapni, mint a kezelt anyagra. Biológiai anyagok elválasztása Elválasztás lehetséges hajtóerői: nyomás, gravitációs erő, elektromos erőtér. Legegyszerűbb elválasztás a szűrés, vagy koncentrálás, ez a kettő nem ugyanaz, de azonos elven működnek: egy rácson a kis molekula átjut, a nagy viszont nem. A pórusméret kritikus dolog, pontosan tudnunk kell, hogy mit akarunk elválasztani mitől. Leggyakoribb elválasztandó dolgok: vírus partikumok, makromolekulák, szennyeződések. Koncentrálás: a szűrés alternatív használata. A koncentrátorok centrifugacsövek. A 25 kdas szűrő csak kb. akkora: kda-ra jó, de a 30 kda-s részben marad 20 kda-s, ezért csak az egyik oldal lesz tiszta. Dialízis: a mintát olyan zsákba tesszük, aminek a lyukain kimennek a kis részecskék, mert belerakjuk egy nagy térfogatú vizes tálba, így, főleg vízcsere után nagyon kihígul a zsák tartalma (pl. só eltávolítás fehérje mellől). Centrifugálás A nagy nehézségi erő gyorsítja az ülepedést (szilárd-folyadék elválasztás). Az egyes sejtalkotóknak különböző a szedimentációs állandója. A különböző igényeknek (mennyiség és elválasztási minőség) megfelelő centrifugák: Mikrocentrifuga: 0,2-2 ml g Asztali- vagy benchtop centrifuga: ml g Ultracentrifuga: g Ez utóbbinál alacsony hőmérsékletet, és vákuumot alkalmaznak, a légellenállás következtében fellépő melegedés elkerülése miatt. A centrifugálásnál nagyon fontos, hogy a két szemben lévő csőben pontosan egyforma tömeg legyen (század grammra), kiegyensúlyozás nélkül elgörbül a tengely. Folyadékfázisok elválasztása: Két féle rotort használnak: Szögrotor vagy kilendülő fejes rotor: utóbbit főleg folyadékhoz, ha nem jó, hogy ferde marad az ülepített dolog. 3

4 Kromatográfia: Kizárásos kromatográfia: Egy csőben üreges gyöngyöket tesznek, ezekben szűk labirintusok vannak, a kisméretű lassabban jön le, mert elveszik benne, ezzel szemben a nagyok nem vesznek el a részletekben. Megoszlási kromatográfia: Az anyag, a komponensei különböző oldhatósága alapján megoszlik a szilárd és a folyadék fázis között, miközben az egész keverék a hajszálcsövesség miatt felfelé megy a lapon. Adszorpciós kromatográfia: Egy csőbe töltött mátrixhoz való kötődés alapján válnak el a komponensek. Ioncserés kromatográfia: a töltetnek van elektromos töltése. Ha pozitív, akkor a negatív köt hozzá megváltoztatjuk a ph-t, ledisszociálnak akik tudnak, aztán tovább növeljük a ph-t. Affinitás kromatográfia: enzimes lét folyatok át a szubsztráttal töltött oszlopon, így izolálni tudom az enzimet, pl. ph váltással vagy fölös S adagolással. Mechanizmus szerint lehet folyadék- vagy gázkromatográfia illetve elektroforézis. Detektálás: látható, UV, infra, fluoreszcens, radioaktív, MS. Gélelektroforézis: Az elválasztás alapja, hogy a nagyobb méretű molekulák lassabban haladnak előre a térhálós szerkezetű gélben. DNS-eket, RNS-eket általában vízszintesen, fehérjéket általában függőlegesen futtatnak. Míg a nukleinsavak töltése a méretükkel arányos (így vízben futtatva nem különülne el a kicsi és nagyméretű), addig a fehérjéknek eltérők az oldalláncaik, mások az izoelektromos-pontjaik, ezért ha méret szerinti elválasztást akarunk elérni, akkor pl. SDS-sel szét tudjuk tekerni a láncot és azonos fajlagos töltést adhatunk nekik. Kétdimenziós futtatás esetén először az IP-ig futnak a fehérjék (ph-gradiens), innen egy másik dimenzióban indulnak el az elektromos feszültség hatására, ez nagyobb differenciálást tesz lehetővé. Gél típusa: agaróz vagy akrilamid. Agaróz: DNS, RNS elválasztására, mert 1-20 kbp közt választ szét (nagy range), de kis felbontással, míg az akrilamid ennek pont az ellentéte. Óriási molekulák nem férnek át az agarózgél hálóján, ilyenkor ide-oda kell rángatni őket, ezt csinálja a pulse-field gél elektroforézis (PFE). Gyakorlata: Zsebbe töltés, feszültség rákapcsolás: általában a pozitív fele futnak: a kicsi és negatív megy gyorsan. Festés: Etídium-bromiddal, ami a DNS kettős láncába interkalálódik, UV alá kell tenni, hogy lássuk az eredményt. A fehérjék kötik az ezüstöt, ez legjobb festésük. 4

5 Agar (= agaróz + agaropektin): hiszteretikus: 85 C-fokon megolvad, de 40 C-fokon is úgy marad, kényelmesen lehet vele dolgozni. Kádba öntés előtt le kell hűteni, mert megrepedne az edény és víztisztának kell lennie, ne legyenek bene kis gömbök, amiben futás közben megakadhatna a minta. Öntés után belerakjuk a fésűt (műanyag, Teflon 1 ), ami kis zsebeket hagy. Kihúzásához pufferrel kell locsolni, hogy a keletkező vákuum ne szakítsa fel a gélt. Pulse-field (PFE): leggyakoribb a TFE: 45 -ban jobbra-le és balra-le váltakozik a feszültség iránya, a módszer 1500 kbp-os darabok elválasztására is jó. PAGE: Akrilamid mérgező, poliakrilamid (PAA) már nem, de azt is kesztyűvel kell megfogni, mert nyomokban azért maradhat benne akrilamid. PAA-gél = AA + metilén-bisz-aa (keresztkötő komponens). A gélben kovalens kötések alakulnak ki, így a folyamat visszafordíthatatlan. Natív gél: semmit nem teszünk bele, viszont van, hogy beletesznek ureát (menő szó a karbamidra), ami megváltoztatja a fehérje térszerkezetét, de a töltést nem befolyásolja vagy SDS-t, ami erős ionos detergens: kitekeri a fehérjéket, hogy csak a mérettől függjön a futás, ez nem olyan tökéletes, mint a DNS futtatásnál, de majdnem. Van még két olyan dolog, amit használni szoktak, az egyik a merkaptoetanol, ez redukálja a diszulfidhidakat, hogy minél inkább lineáris legyen a fehérjelánc. A másik a katalizátorok: ammónium-perszulfát: katalizálja a térhálósodást, 5-20% kell belőle, illetve a TEMED (tetrametil-etiléndiamin): ez is katalizátor, végén kell beletenni, mert gyorsan köti. Átlátszó folyadék, % kell belőle. A futást befolyásolja az AA-BAA arány, meg hogy az egészet mennyire hígítom. A PAGE szemben az agarral függőleges állású, benne vékony üveglapok (spacerek) vannak, ezek tökéletesen egyenesek, leggyakoribb térközük: 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2 mm. Minél vékonyabb a gél, annál jobb az elválasztás, de minél vastagabb, annál könnyebb utána preparálni. A kész gél tetejére érdemes alkoholt önteni, hogy szép vízszintes legyen a gél, mire megdermed (megszünteti a felületi feszültséget). Ha megdermed, akkor kiszorul egy kis víz, így hármas réteg lesz a tetején, kb. 20 perc múlva. 1 A DuPont (E. I. du Pont de Nemours and Company) védjegye. 5

6 A függőleges gélbe sajnos nagyobb zsebeket kell vágni, mint a vízszintesbe, ezért, hogy egybe maradjon a minta, kell egy tömörítő gél a szeparáló gélre, ebben a minta hajszálvékonyra tömörödik, így pont egyszerre indulnak el. DNS mintáknál általában nem kell ilyen tömörítő gél. A tömörítő gél hígabb, mint a szeparáló: 4%-os és kisebb a ph-ja is: 6.8 vs A pufferben glicin van, ami ikerionos, más ph-n más töltést vesz fel, ezért a ph-határon tömörödik (Lívius se érti miért ). Gradiens gél: készen lehet kapni, szép eredményt ad, de drága. Alul tömény a gél, itt a kis fehérjéket választja el jól, míg a felső híg részen a nagyobbakat: A puffernek alul és felül is érni kell a gélt, így azon át folyik az áram. Ha kettes kamrában egyet akarok futtatni, akkor is be kell rakni a másik slotba az üveglapot, hogy ne üresben fusson az áram. Mindig fel kell tenni molekulamarkert, hogy tudjuk, hogy hol vannak azok a DNSdarabok, amihez majd viszonyítani akarunk. Jelölés: Festés: Coomassie 2 : fehérjéhez jól kötődő sötétkék festék, amiben pár percig kell lötyögtetni a gélt, majd perc után egy másik folyadékkal ki lehet mosni a hátteret, így csak ott marad festék, ahol fehérje volt. A módszer előnye, hogy többször lehet elvégezni, ha túl fakó, vagy túl erős lett a háttér. Az ezüstfestés érzékenyebb, de oda kell figyelni az időre, nem lehet közben ebédelni menni, különben az egész gél fekete lesz. Ponceau: a membránt festjük, amire átvisszük az eredményt, nem érzékeny, rózsaszín. Nincs mindig szükség festésre, a futtatott fehérjét lehet eleve radioaktívan termeltetni, és ez alapján detektálni, röntgenfilmmel. Western-blot esetén cellulóz membránra szívatjuk át és antitestekkel jelölünk, ilyenkor egyáltalán nincs festés (bővebben később). A molekula mozgási sebessége bizonyos határon belül fordítottan arányos a tömegének logaritmusával, de ezzel nem érdemes igazán számolgatni, azért van a molekulamarker létra. A 2 Coomassie Brilliant Blue: a brit Imperial Chemical Industries védjegye, ami ma a holland AkzoNobel tulajdona. Nevét Kumasiról, Ghána második legnagyobb városáról kapta. 6

7 futás függ az alábbiaktól: fehérje tisztasága, vannak-e fehérjék komplexek (ezek együtt futnak, vagy denaturálni kell), fehérje összetétel, under/overexpressziók. Fehérjék nem örökre teremtődnek, folyamatos lebontás van, dinamikus egyensúly, a fehérjéknek féléletidejük van. Ha több kell, megnöveljük a termelést vagy megszűntetjük a lebontást, ha kevesebb, akkor a termelést állítjuk le. 2D-elektrorézis esetében egy gélen egy minta van. Az első elektroforézis natív vagy ureás gélen fut, ezért töltések alapján szeparálódnak a fehérjék, odáig megy a ph-gradiensen, ahol az iep-ja (izoelektromos pontja) van, itt a fehérjének nincs töltése. Hogy lehet ilyen ph-gradienst kialakítani? Ún. amfolitokat kapcsolnak össze random módon, így olyan sok féle lesz, hogy folyamatos lesz a gradiens, majd rögzítik őket. Az iep-futás után SDS-sel locsoljuk, hogy a második dimenzióban méret szerint váljanak el. Szinte nincs két olyan fehérje, ami mindkét szempont szerint egyformán fut. Kapilláris-elektroforézis (CE): a kapilláris belső pereme negatív, a benne lévő folyadék viszkózus, külseje pozitív. Feszültség hatására, az egész folyadékkábel elindul a negatív irányba. A pozitívak sietnek, a negatívok igyekeznek lemaradni, ezen belül a nagyok még lassabbak. A módszer előnye, hogy rengeteg mintát tud egyszerre mérni és mennyiségi adatot is ad, pl. fluoreszcencia alapján. 7

8 Organizmusok a molekuláris biológiában E. coli: A leggyakoribb, amibe szinte mindig belefutunk, az az Escherichia coli. Egy picit patogén, tehát alapvetően békésen él bennünk, csak betegség esetén termelhet toxinokat. Baktériumoknál a törzs az alfajokat jelenti. Különböző E.coli mutánsokat használunk, amit ben meghatároztak, ezek kiszabadulva nem élnek meg, mert enzimhiányosak, szökés után éhen halnak. Ezeket a törzseket úgy alakították ki, hogy könnyen lehessen velük dolgozni: a beültetett DNS-t ez életük során szaporítsák fel, majd a vágóhídra küldés után azonos formában ki tudjuk nyerni. Ennek érdekében bizonyos enzimeket kilőttek, pl. endonukleázokat, hogy az idegen DNS ellen ne tudjanak védekezni. A metilázokat is gyakran kilövik, ezek különböző helyeken metilálják a DNS-t. A rekombináz-aktivitás szintén nem kívánatos, ezért kilövik a rekombinázokat, hogy ne integrálják magukba a plazmidokat, mert ezt utána ki akarjuk nyerni. Ahhoz, hogy csak a kívánatos baktériumok éljenek túl, szelektív táptalajra van szükség, pl. antibiotikumos vagy színes mesterséges szubsztrátos. Az E.coli törzsek legszívesebben 37 Con nőnek, akár 20 perc alatt is képes duplázódni. Munka előtt meg kell ismerni, hogy mivel dolgozunk; a genotípusuk leírja, hogy milyen gének vannak bennük, ez alapján el tudjuk dönteni, hogy a célunkra melyik megfelelő. Tárolás: Folyadékkultúrában nem lehet tárolni, fel kell használni. -70 fokon lehet hosszútávon eltartani, 10-15% glicerinnel, ami megtöri a jég szerkezetét. Kivétel: elég csak egy fogpiszkálóval lekaparni egy kicsit, mert az olvasztgatás nem tesz jót. Transzformálás: Átváltoztatjuk a baktériumot, úgy, hogy kívülről viszünk be DNS-t, általában kis cirkuláris plazmidot. Kis eséllyel magától is be megy, ezt meg kell növelni, tehát kezelni kell a bacit: receptívvé, szenzitívvé teszik. Először (OD@600nm) optikai denzitásig növelik (itt még log-fázisban vannak), majd centrifugálás után azonnal jégre kell tenni, a médiumot pedig pl. kalcium-klorid oldatra cserélni, így lesznek kompetensek a sejtek. Ezt a sűrű szuszpenziót le szokták fagyasztani DMSO hozzáadásával, hogy ne kelljen mindig megcsinálni az egész folyamatot. Transzformálás: Az egészet jégen csinálják, fognak kb. 200 µl kompetens sejtet és hozzáadnak 1-2, de akár 7 µg plazmidot is. Hagyjuk egy fél órát, majd 42 C fokos vízfürdőbe tesszük másfél percre, hogy kis pórusok nyíljanak a sejteken. Visszarakjuk jégre, hozzáadunk 800 µl tápoldatot és szélesztjük: a szelektív táptalajon csak az a baci nő ki, amiben a plazmid benne van, mert ezek antibiotikum-rezisztensek. A kinőtt telepek számából kiszámíthatjuk a transzformációs hatékonyságot, ha könyvtárat akarok készíteni, amihez sok telep kell, akkor fontos ez a hatékonyság. Lizálás: Ha a plazmidra van szükségem, akkor lúgos oldatba teszem + SDS: a fehérjét ez kicsapná, ha azokat akarjuk kinyerni, akkor ultrahangos kezelést alkalmazunk (szonikáljuk). 8

9 Milyen oldatban növesztik a baktériumokat? A legegyszerűbb az Lb-médium 3 : NaCl, tripton (tripszinnel emésztett kazein), élesztő kivonat (sok vitamin és nukleotid van benne), antibiotikumot csak a hőkezelés után szabad hozzáadni Élesztő: egysejtű gombák, a baktériumokkal szemben ők eukarióták, egyik fajtája a sörélesztő, ezeknek még vastagabb a sejtfaluk, emiatt nehezebb őket transzformálni, a kémiai transzformálás az egyetlen módja. Kell hozzá polietilén-glikol (PEG), lítium-acetát, ssdns (egyszálú DNS) és plazmid. Beteszik 100 C-os vízbe 5 percre, majd jégre. Az élesztő 30 C-t szereti, de a több már árt neki. Lassabban nő, 0.1-ről 0.6-ra 5-6 óra. Bizonyos kísérletekhez szinkronizálni kell a sejteket, ehhez legegyszerűbb a végső fázisban átoltani őket friss médiumba. Lizálás: a vastag sejtfal miatt nehéz őket széttörni, ehhez kis üveggyöngyökkel rázatják, vagy az ún. French-presst 4 alkalmazzák: nagy nyomású edényből kis lyukon kifolynak, és a nyomásesés miatt szétdurrannak. Lizozimos emésztés is jó, csak drága és vigyázni kell, hogy ne eméssze el teljesen, valamint a végén el is kell távolítani. Az élesztők, amiket használunk ugyanúgy enzimhiányosak, alig tudnak egy-két aminosavat szintetizálni. Folyékony táptalajon ON (overnight), szilárd táptalajon 3-4 nap, mire látható telepek lesznek (amik eltérő méretűek). YPED-médiumon (Yeast Extract Peptone Dextrose) nő, feloldásából kiderül, hogy mi van benne (+adenin). Leggyakrabban az uracilra, triptofánra, leucinra, hisztidinre szelektálunk, ez azt jelenti, hogy csak az tud megélni, amelyik pl. egy plazmiddal megszerzi a hiányzó aminosavat szintetizáló enzimet. Eukarióta sejtek állatokból: 37 C-os termosztátban nőnek, magas szén-dioxid koncentráció mellett: 5% vs. 0.3% a levegőben, + 100%-os páratartalom van a flaskában, hogy a folyadék ne párologjon el, amiben a sejtek vannak. Az edény alját gyakran érdesítik, hogy jól tapadjanak sejtek, azt higgyék, hogy benne vannak a testszövetben. Milyen sejteket használunk? Immortalizált rákos sejteket, ezek korlátlanul szaporodnak vagy vannak ún. primer sejtvonalak, amik többnyire nem osztódnak, de túlélnek egy pár napig. Mivel más patkányból más sejteket tudunk kinyerni, ezért nagy a szórása a primer sejtvonalas kísérleteknek, kényelmesebb tumorsejtekkel dolgozni. Mi van a tápfolyadékban? Vitaminok, aminosavak, sók, glutamin, cukor, piruvát, bikarbonát, indikátorok, ez utóbbi mutatja, hogy, jó-e a médium (a sejtek szén-dioxidot termelnek, amitől elsárgul az indikátor). Teszünk 3 Lysogeny broth (broth=húsleves), gyakran tévesen Luria-Bertrani-ként oldják fel. Kitalálója és névadója az olasz Giuseppe Bertani. 4 Nevét amerikai feltalálójáról, Charles Stacy French-ről kapta. 9

10 még a médiumba borjú magzat szérumot (FBS), hogy a sejt ne érezze, hogy egyedül van, ne legyen öngyilkos (túlélési szignál). Teszünk a tápoldatba antibiotikumokat és antimikotikumokat, mert a sok kaja másokat is vonz. Műveletek: Ezekkel a sejtekkel olyan steril fülke alatt dolgoznak, amikben felülről lefelé menő légáramlás van (ezért nem szabad a nyitott edények fölé rakni a kezünket). Passzálás: ha a sejtek benőtték az egész edényt, akkor (folyadékkultúra estén) le kell centrifugálni és egy kis részét új médiumban felhígítani, egy plateről pedig tripszinnel szedjük le (mobilizáljuk) őket. Fagyasztás: lassan kell! 30% FBS, 10% DMSO, 60% médium 4 C-on 2 óra -20 C estig, aztán -70 C másnap folyékony nitrogén. Olvasztani viszont nagyon gyorsan kell, 37 C (1-2 perc), aztán lecentrifugáljuk és kiszívjuk a fagyasztólét. Éheztetés: nem adnak neki szérumot, nem kap növekedési jelet, ilyenkor egy napig lehet vele kísérletezni, utána megdöglik. Transzfektálás: magas rendű élőlényeknél a transzformálást így hívják. Emlős sejteknél előny, hogy nincs sejtfal, ezért nagyságrenddel könnyebb transzfektálni. Legegyszerűbb módszer: Kalcium-foszfátban áll a sejt, a DNS meg kalcium-klorid oldatban, a kettőt összeöntve csapadék keletkezik, valamiért a sejtek így könnyen felveszik a DNS-t. Egy másik lehetőség az ún. dendrimer (fa alakú polimer) molekulákkal való bejuttatás, aztán vannak a liposzómák, amik kettős membránok: közepébe helyezzük a DNS-t, és amikor a liposzóma fuzionál a sejtmembránnal, a DNS bejut a sejtbe (ez a leggyakoribb mód). Elektroporáció: elektromos árammal sokkoljuk a sejtet, amitől jobban áteresztő lesz a membrán, ezt a baktériumok esetében is lehet alkalmazni. Génpuska: nanorészecskére rögzítve lövik be az idegen gén. A lizálás nagyon egyszerű, elég valamilyen detergenst hozzáadni. Növényi sejtkultúrák, nagy előnyük, hogy vannak olyan sejtek, amiből bármit ki tudunk növeszteni, akár az egész növényt, hátrányuk, hogy sejtfaluk van. Totipotens sejtekből ún. kalluszt, egy amorf kultúrát növesztenek. A sejtkultúrába kell tennünk szervetlen sókat, szacharózt (mert sötétben nem tud fotoszintetizálni), vitaminokat és hormonokat. Lassan nőnek, ezért jól be kell lőni az átoltás mennyiségét. Tartási hőmérséklet: C. Transzfekció: A sejtfal miatt a nem működnek a baktériumoknál ismertetett módszerek, ezért az alábbiakat használják: vírusok, Agrobacterium, génpuska, elektroporáció. Vírusok: nem szoktuk élőlényeknek tekinteni, génátvitelre használják őket. Bakulovirus: rovarsejtkultúrába, λ-fág: baktériumokba nagy hatékonysággal. Lentivirus: retrovírus, nem mindig tudni hova juttatja be a gént, de hatékonyan fertőz. Adenovirus: nem ül be a genomba, ezért nem osztódik a sejttel. Mindig átalakított vírusokkal dolgoznak, egy korcs- és egy helpervírust visznek be, hogy ne keletkezhessen emberekre veszélyes fertőző forma. 10

11 Makromolekulák izolálása Fehérjékre, DNS-re és RNS-re koncentrálunk. Az elkülönítéskor mire kell figyelni? Fizikai érzékenység: centrifugáláskor vagy vortexeléskor törik-e. Genomi DNS könnyen törik, az RNS meg a fehérje stabilak. Kémiai érzékenység: a DNS stabil, az RNS kicsit reaktívabb, mert egyszálú és van egy plusz hidroxil-csoportja, de azért kb. stabil. A fehérjéket viszont ki lehet sózni, csapni: nagyon reaktívak, sejtszerű körülményeket kell fenntartani a munka során. Biológiai érzékenység: enzimes bontásra mindegyik érzékeny, mindig gátolni kell az RNázokat, DN-ázokat, proteázokat. A fehérjék nagyon érzékenyek. Az RNS extrém érzékeny, minden tele van RN-ázzal, ami ráadásul ellenálló. A DNS lehet genomi vagy extrakromoszomális, pl. plazmid. Az RNS lehet rrns, mrns, trns, mikrorns. DNS izolálása viszonylag egyszerű, ezzel szemben az RNS sokkal nehezebb. A nukleinsavak izolálásához először a sejteket lizálni kell, inaktiválni a nukleázokat, ezután el kell különíteni a nukleinsavakat, ehhez az extrakció a legegyszerűbb, pl. fenollal, de ki is csaphatjuk őket, vagy el tudjuk választani kromatográfiával illetve centrifugálással. Az új módszer alapja, hogy a DNS és az RNS elég specifikusan kötnek üveggyöngyökhöz, amiket aztán le lehet mosni. A körülmények megfelelő beállításával el is lehet különíteni egymástól ezt a kettőt. DNS izolálás céljai: DN-áz-mentes, törés elkerülése, megfelelő tisztaság. Ez utóbbi eléréséhez proteináz-k-t tesznek az oldatba, ez kisebb darabokra vágja a fehérjéket, hisztonokat. A szennyeződéseket eltávolítják fenollal (nem kívánatos anyagok a szerves fázisba kerülnek). Kicsapás pl. alkohollal. Genomi DNS izolálásához használt puffer tartalmaz EDTA-t (megköti a Mg-t), SDS-t és Trist. Az alkoholos kicsapás után az oldószert el kell párologtatni, de nem szabad túlszárítani, különben az életbe nem lehet újraoldani. A DNS kinyerése történhet dialízissel is. A sűrűség gradiens centrifugálás CsCl-dal (cézium-kloriddal) nagyon ép és tiszta DNS-t ad, de macerás és utána természetesen dializálni kell, mert a CsCl-ot el kell távolítani. Plazmid DNS-t úgy kell izolálni, hogy ne jöjjön vele a bacié. Az SDS szétveri a sejtfalat, hozzáadunk lúgot (szétnyitja a DNS-t) és gyorsan semlegesítjük (újra összezáródik a DNS) azért, mert plazmid DNS pici gyorsan újra tud párosodni, oldatban marad, míg a genomi DNS a fehérjékkel együtt egy takonyszerű csapadékot alkot (ehhez persze előtte a genomi DNS-t nem szabad összetörni kis darabokra). DNS tisztítása: DEAE-oszlop (dietil-etanolamin) adja a legtisztább eredményt. 11

12 DNS-fragmenteket hogy szedem ki az agarból? Preparatív UV alatt kicsit bevágjuk a gélt a csík alatt és beteszünk egy DEAE papírdarabkát a résbe, visszakapcsoljuk a feszültséget, így ráköt a lapra. A papírt kivesszük és betesszük egy Eppendorf-csőbe, hozzáadunk egy magas sókoncentrációjú oldatot, ez leoldja a géldarabkákat, aztán alacsonyabbat, ez pedig a DNS-t szedi le. Low melt agarose: már 60 C olvad, kivágom a darabot, Eppendorfba teszem, melegen fenollal eltávolítom a gélt, vagy üveggyöngyökkel szedem ki a DNS-t. Jó minőségű agarhoz lehet agarázt adni, ez is elfolyósítja. RNS izolálás: RN-ázt nagyon nehéz inaktiválni. Gyorsan, hidegen, tisztán kell dolgozni. Fontosak a tiszta pipettahegyek, kesztyű használata, asztal tisztítása és a nyitott edénybe sem tüsszentünk bele! RN-áz eltüntetése: magas koncentrációjú guanidin sóval, pl. guanidinizotiocianáttal. Ahhoz, hogy a felülúszóban csak az RNS legyen, 4-es ph kell, így a DNS a fehérjékhez kötve marad. A vízbe, amit használunk, DEPC-et (dietil-pirokarbonát) teszünk, ez tönkreteszi az RN-ázt (ami mindenhol ott van!), autoklávozás során elbomlik. Ha mrns-t izolálunk, akkor oligo-dt oszlopkromatográfiát alkalmazunk, ami megköti az mrns-ek poli-a farkát. Fehérjék izolálása: Nem szabad erős savakat vagy sókat használni. A proteázokat (lizoszómák tele vannak velük) és foszfatázokat inhibiálni kell. Különböző erősségű detergenseket használhatunk, pl. olyat, ami a sejtmembránt szétszedi, de a sejtmagot már nem. Kell még hozzá EDTA, ez megköti azokat az ionokat, amiket a proteázok használnak, és NaCl, ami a megfelelő ionerősséget biztosítja. 12

13 Nukleinsav-módosító enzimek Típusok: Polimerázok: DNS ill. RNS, tulajdonságok: sebesség, hibajavítás megléte, hőstabilitás, extra nukleotidok hozzákapcsolása lehetséges-e templát szál nélkül. Nukleázok: DNS és RNS láncokat emésztik. Hol: exo- és endonukleáz, 5 vagy 3. RNSt vagy DNS-t emészt (esetleg mindkettőt): dezoxiriobo- ill. ribonukleázok. Adott szekvenciát felismerő és annak környékén hasítás: restrikció. Ligázok: Két DNS/RNS darabot összeillesztenek. Másodlagos módosítók: Metilázok, foszfatázok (mindig az 5 végén vannak a foszfátok). Térszerkezet módosítók: Topoizomerázok, helikáz. A DNS szemikonzervatív útón szintetizálódik, antiparalell módon: ha 3 5 irányban olvassa, akkor 5 3 irányban írja az újat, ehhez nem kell plusz energia; a nukleotid trifoszfátban van 2 db nagyenergiájú foszfo-anhidrid kötés (pirofoszfát lehasad). A szintézis elindításához kell egy 6-8 bp-s szakasz, ezt a DNS-primáz csinálja. A replikáció mindig 5 3 irányú, ezért az egyik szál kiegészítése laggol, szaggatottan szintetizálódik. DNS-polimeráz működése: Be kell tenni mind a négy nulkeotid-trifoszfátot (4dNTP) és kellenek enzimek: DNS-polimeráz I, Klenow-enzim, T4- és T7-polimeráz, Taq- és Pfupolimeráz, reverz transzkriptáz (RNS-t használ templátnak). 13

14 A DNS-polimeráz I egy része a Klenow-fragment: 3 doménből áll és 3 enzimaktivitása van. Az enzimrészletet az E. coli DNS-polimeráz I enzimének részleges proteolízisével állítják elő, természetben nem fordul elő. 3 5 exonukleáz aktivitása van, le tudja hasítani a végéről a nukleotidokat, de polimerizáció irányába sokkal gyorsabb. Kétszálú DNS (dsdns) szintézisre, jelölt próbákhoz valamint 3 ragadós végek feltöltésére vagy visszaemésztésére használjuk. T4-polimeráznak a 3 5 exonukleáz aktivitása 200-szor jobb, mint a Klenow-nak, ezért 3 visszaemésztésére kiváló. Nem szedi le az útjába kerülő oligonukleotidot. T7-polimeráz ugyanezt tudja csinálni, csak sokkal tovább marad a szálon, exonukleáz aktivitását megszüntetve (hogy ne nézzen folyton hátra) szekvenálásra alkalmas. DNS-polimeráz I: Olyan, mint a Klenow, csak van 5 3 aktivitása (és csak ennek van!), ami azt jelenti, hogy amikor az orra előtt lát valamit, akkor azzal nem békél meg, lehasítja és beépít egy ugyanolyat, ezért azért jó, mert leszedi az RNS-primereket és DNS-sel pótolja. Használható jelölt szálak készítésére is. Reverz transzkriptáz: megtörte a centrális dogmát, ez RNS-ről ír a DNS-re, elsősorban retrovírusokban fordul elő. RN-áz aktivitása is van: Ha berakok egy RNS-darabot és a 4 dntpt, akkor nem elég, hogy megszintetizálja a DNS-szálat, még le is bontja az RNS-templátot, így ssdns-t kapunk. RNS-polimeráz: DNS-ről történik az RNS átírása, promóter régió kell az RNS-polimeráz bekötéséhez. A néma szál a kódoló szál, mert a DNS-sel tökéletesen azonos bázissorrend keletkezik, persze azzal a különbséggel, hogy a timin helyett uracil lesz. Gyakran használt RNSpolimerázok: T7, T3, SP6 (Salmonella). Templát független polimerázok: DNS-nél: terminális-dezoxiribonukleotidil-transzferáz, 3 -végtől random sorrendben nyomja a semmibe a láncot, ez nem jó sok mindenre, de ha csak egyféle dntp-vel etetjük, akkor homopolimer farka lesz a szálnak. Eukariótáknál az RNS-ek poli-a farkat kapnak, ezt a poli-a-polimeráz csinálja, a farok hossza szabályozza az mrns életét (a farok jelölhető). 14

15 Nukleinsavbontó enzimek: vagy mono- vagy di- vagy oligonukleotidokra bontanak. Kettőt emelünk ki, amit használunk a molekuláris biológiában. DN-áz I: Akkor használjuk, ha van egy nukleinsav mintánk és RNS-t akarunk izolálni. A mintához hozzáadva a DN-áz (endonukleáz) a DNS-t kis darabokra hasítja. Vigyázni kell, hogy RN-áz mentes legyen! 65 C-on 10 perc alatt inkativálódik (pl. reverz transzkripció során). RN-áz: Elsősorban RNS vírusok elleni védelem céljából termelődnek, nagyon hőstabilak. Kis főzéssel inaktiválható a DN-áz, ha esetleg van mellette. Bal 31 nukleáz: dsdns exonukleáz, 5 és 3 végen egyaránt. Nick, gap és ssdns/ssrns endonukleáz. S1 nukleáz: Nukleotid láncokat bont, egyszálút szer gyorsabban, mint kettős szálút, a DNS-t ötször gyorsabban, mint az RNS-t. Nem a szélétől, hanem a közepétől bont, mononukleotidokig. Egyszálú, kiugró DNS/RNS szál bontására jó. Nagy előnye, hogy rezisztens egy csomó kemény vegyszerre. Exonukleáz VII: Csak ssdns-t hasít a széléről 2-25 oligonukleotidokat. El tudjuk távolítani a primereket és az 5 /3 végeket. Másodlagos módosítók: Foszfatáz: Eltávolítja a foszfátcsoportot az 5 végről. Pl. CIP (calf-intestinal phosphatase). Ha elvágjuk a plazmidot és nem akarjuk, hogy utána újra összeragadjon, akkor CIP-eljük. Polinukletid kináz: Rápakol egy foszfátot, ATP-t felhasználva. Linkerek, adaptorok, PCR-termékek foszforilációja ligálás előtt. Radioaktív végjelzésre jó. Metilázok: Egy metilcsoportot raknak rá magára a nukleotidnak a bázisára, tehát nem a szálra. A baktériumoknak ez a saját DNS-ük felismerésében játszik szerepet, metilálják őket, míg a bejutott vírusnak nincs ilyen, ezért ezeket elemészti. Ha viszont a baciban kiütjük ezeket a metilázokat, akkor fel tudjuk használni a DNS-üket különböző célokra (így már nem áll ellen az emésztgetéseknek). Restrikciós endonukleázok: A nukleázokhoz tartozik, de ez egy viszonylag nagyobb rész ezért maradt a végére Gyakorlatilag ez a baktériumok immunrendszere. Többnyire kettősszálú DNS-t ismernek fel, és valahol elemésztik. Az, hogy hol, az vagy meghatározott pontosan vagy nem, de az biztos, hogy egy nukleotid sorrendet ismernek fel, ám ha ezek a restrikciós helyek metilálva vannak, akkor ott többnyire nem tudják hasítani. I. típusú: Több alegységből áll, hasítás ill. metilálás egy komplexben (természetesen a hasítás gyorsabban megy, mint a metilálás). Felismerő helytől messze, random hasítanak, ezért nem tudjuk őket használni. 15

16 III. típusú: Több alegységből áll, hasítás ill. metilálás egy komplexben. Két felismerő helyük van, egymással szimmetrikus, tőlük messze, random hasítanak, ezért nem tudjuk őket használni. II. típusú: A felismerő hely szekvenciájában, vagy közvetlen közelében hasítanak, de pontosan kiszámítható. Általában palindrom (oda-vissza olvasva ugyanaz) szekvenciát ismer fel 5 -végről szoktuk olvasni, de vannak heterodimerek is (aszimmetrikus, nem palindrom). A komplexben nincs metiláz, Mg-t igényelnek, 3 -végén OH, 5 -végén foszfát marad. Nomenklatúra: Baci fajnév, törzsnév, hányadikként felfedezett. Vannak mesterséges restrikciós endonukleázok is, ezeket géntechnológiai eszközökkel tudjuk előállítani, meg tudjuk változtatni, hogy melyik felismerő helyhez milyen hasító hely tartozzon. Természetesen nem a fehérjét (enzimet) magát próbáljuk változtatgatni, hanem DNS szinten történik a manipuláció (abból RNS lesz, majd a fehérje). Attól függően, hogy hány nukleotidot ismer fel, beszélhetünk 4, 6 vagy 8 kulcsos restrikciós enzimről (az iménti ábrán egy 4 vagy 6 kulcsosat láthatunk). Más-más baktériumból izolált enzimekhez más-más összetételű puffer kell (a ph általában 8 körüli). A hőmérsékletre is oda kell figyelni a használat előtt. Az ún. sztár aktivitás akkor következik be, ha vagy túl sok enzimet rakok be, vagy túl hosszú ideig hagyom emészteni, esetleg rossz puffert használok, ilyenkor máshol is hasítanak ezek a restrikciós endonukleázok, romlik a specifitásuk. Sztár aktivitáshoz vezet pl. a tároláshoz használt glicerin 5% feletti jelenléte, 8-nál magasabb ph vagy a kicsapás után el nem párolgott etanol. Restrikciós endonukleázok alkalmazási lehetősége az ún. restrikciós térképezés. Ilyenkor fizikai térképet tudunk csinálni, azt mondjuk meg, hogy hol emésztenek ezek a restrikciós enzimek. Megjelölöm a DNS egyik végét, és egyféle restrikciós endonukleázzal parciálisan emésztem, ez azt jelenti, hogy kevés enzimet használok és/vagy rövid ideig hagyom. Ezután gélen megfuttatom, és a radioaktívan jelöltek és nem jelöltek hosszából ki lehet találni, hogy hogy voltak sorrendben. 16

17 A másik fajta restrikciós térképezés esetében teljes emésztést csinálunk és nem egy enzimet használunk, hanem kettőt. Arra vagyok kíváncsi, hogy a DNS-emen belül hol vannak az enzimes hasítóhelyek. Ehhez a DNS darabot beültetem egy plazmidba, amiről tudom, hogy a DNS darab szélén van ez a két hasító hely (ld. következő ábra: BamH I és Kpn I). Megemésztem KpnI-gyel, kapok egy 1000-es darabot, ebből egyértelmű, hogy az 1000-esnél vágta el (a két hasítási helye a kb. 0 és az 1000.). Aztán emésztem BamHI-gyel, itt kapok egy 600-ast meg egy 2200-ast is, de ez alapján nem tudom, hogy 600.-nál vágta-e el, vagy nál, hiszen a at ami a harmadik sáv lesz, kiadja a és is. Ezért ráküldöm mindkét enzimet és megnézem mit kapok: A 2200-es sáv eltűnik és lesz helyette egy 1000-es és egy 1200-as, ez azt jelnti, hogy az nél vágó KpnI, kettévágta a 2200-as részt, vagyis ez volt előbb, nem a 600 méretű darab. Ezekből az adatokból már felállítható a pontos hasításihely-sorrend. Egy másikfajta térképezési módszer esetében azt térpékezzük fel, hogy egy adott restrikciós endonukleáz és egy adott metilációs hely egymáshoz képest hol van, ilyenkor átfedő helyeket próbálunk találni. (?...) 17

18 Az SNP (Single Nucleotide Polymorphism), ez azt jelenti, hogy két DNS szakasz csak egy nukleotidban tér el egymástól. Akkor tudunk ez alapján térképezni, ha ez a mutáció pont a restrikciós endonukleáz hasítóhelyében történt. A mutációkból olyan sok van és olyan sok helyen, hogy nagyon kicsi az esélye annak, hogy ezek pl. két emberben ugyanott legyenek, ezért alkalmasak az egyedek azonosítására. Az RFLP (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus) rokonsági viszonyok kimutatására alkalmas. Amire legtöbbször használjuk a r.e.-kat, azok a genetikai manipulációk, szabni-varrni tudjuk velük a géneket, elvágjuk restrikciós endonukleázzal, majd összeragasztjuk DNS-ligázzal (DNS darab illesztése plazmidba). Ligázok: DNS replikáció során szükség van a követő szál darabjainak összeligálására, valamint lehetnek hibás darabok is, ezek kivágódnak, a javítottat pedig vissza kell ragasztani. Csak akkor tudnak ligálni, ha az 5 -végén foszfor van, a 3 -végén pedig OH. A ligálásnak kedvez az alacsony hőmérséklet, mert a kisebb Brown-mozgás miatt könnyebben összetapadnak a ragadós végek (van, aki 4 C-on, de gyakran egyszerűen szobahőmérsékleten csinálják). Két típusú ligáz van, az egyik a T4/T7, ami ATP-vel működik, a másik az E. coli-nak a ligáza, ami NAD-dal működik. Össze tudják ragasztani a csak az egyik szálon lévő szakadást, a mindkettőn lévő tompa és ragadós végeket is, valamint az RNS-ligáz a saját végeket is képes karikára összekötni. 18

19 PCR PCR: Polimeráz láncreakció, 1983-ban találta fel Kary Mullis amerikai biokémikus, ban kapott érte Nobel-díjat. A lényege a hibridizáció és az azt követő polimerizáció, tehát a módszer felhasználja azt, hogy a hővel szétszedő a DNS-darab 95 C-on, ráültetek primereket a két végére, utána kiegészül a szál, majd mehet az egész elölről. A PCR-ciklus sematikus ábrája. (1) Denaturálás 95 C-on. (2) Kapcsolódás 50 C-on. (3) Meghosszabbítás 72 C-on (P=polimeráz). (4) Az első ciklus véget ért. Az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége. X darab dsdns és n darab ciklus után X*2 n-1 darab termékem lesz, ezekből exponenciálisan több lesz, míg az eredeti szálról keletkezők csak lineárisan szaporodnak, ezért nagyon sok reakció után a templát szálat már nem látjuk, vagy ha igen, akkor baj van, túl sok volt a templát. (ajánlott videó). Amikor lehűtöm a 2. lépésben az elegyet, akkor elvileg újra összepárosodhatnának a DNS-darabok, de túl nagyok, nem igazán találják meg egymást, ráadásul jó sok primert adunk hozzá, hogy ezt elkerüljük. Kellékek: DNS templát, dntp mix, primerek, Mg 2+, Tris puffer (ph 8), hőstabil DNSpolimeráz (pl. Taq: Thermus aquaticus, ennek bár nem 95 C-on van az optimuma, hanem 72 C-n, de legalább nem csapódik ki). 19

20 Tipikus reakciókörülmények: 0,2-0,5 ml, vékony falú cső kell, hogy gyorsan tudjuk hűtenifűteni és azért, hogy nem párologjon el a minta, a tetőt fűtik. Tiszta eszközök, csövek, hegyek, pirofoszfát-mentes víz kell. A fülkét UV-val vagy Clorox -szal 5 dekontamináljuk (tisztítjuk). Folyamat: Bemérjük a mintánkat jégen, hogy a polimeráz ne kezdjen el dolgozni. Hot start: a Taq-polimeráz a cső aljában gyárilag le van viaszozva, így csak magas hőmérsékleten jut be a rendszerbe (a viasz olvadása után szabadul ki) és csak specifikusan fog polimerizálni. Ugyanezt az eredményt el lehet érni úgy is, hogy antitestekkel fogják le a polimerázt, míg ez utóbbi jól bírja a magas hőmérsékletet, az antitest nem. Felfűtjük 95 C-ra 3-10 percig, utána csinálunk egy ciklust: Először olvasztás 94 C (ez az a hőmérséklet, ahol a DNS-szálak fele szétesik) sec. Aztán lehűtjük C-ra (pár fokkal a primer olvadási hőmérséklete alatt) sec. Utána felfűtjük 72 C-ra, itt van a polimeráz optimuma és itt tartjuk addig ameddig szükséges (kb bp/min a Taq sebessége). A primer azért nem esik le/olvad el ilyenkor, mert bár a polimeráz optimuma 72 C, de 50 C-on is azért már működött valamennyire, ezáltal odakötve a primert (hosszabb lánc magasabb op.). A ciklust megcsináljuk húszszor-harmincszor, aztán a végén szokás tartani egy 72 C 2-5 percet azért, hogy ha maradt esetleg olyan DNSszál, ami nem készült el, az is be tudjon fejeződni. Végül le viszik 4 C-ra vagy szobahőmérsékletre. PCR felhasználása: Genetikai manipuláció: Klónozás: Van egy DNS-szakaszom, amit be akarok ültetni egy plazmidba, ahhoz, hogy a hatásfokát meg tudjam növelni ennek a műveletnek, érdemes megsokszorozni a DNS-szakaszt. Mutagenezis: Olyan primert teszek be, amiben van egy nukleotidnyi hiba, ennek ellenére a primer be tud kötni, felszaporítja a DNS-t, de ebben már lesz egy mutáció, így ültetem aztán be a plazmidba. Szekvencia analízis: Szekvenálás (később). Fertőzések kimutatása: különböző vírusokban és baktériumokban más-más a génállomány, ezért ha azt felismeri a specifikus primerem, akkor keletkezik róla másolat, ebből kiderül, hogy mi okozta a fertőzést. Mutációk, polimorfizmusok kimutatása (betegségek, öröklődés, apaság). Mennyiségi vizsgálatok, pl. mrns szintek vizsgálata, ennek az az alapja, hogy adott számú ciklus után annál több termék lesz, minél több volt a mintában (mrns-t reverz transzkriptázzal írjuk át DNS-sé). 5 A Clorox Company védjegye. 20

21 Nagyon kell figyelni a specifitásra (úgy kell meg tervezni a primert, hogy az tökéletesen specifikus legyen az adott DNS-szakaszra) és a kontamináció elkerülésére (biztosnak kell lenni abban, hogy azt vizsgáltam, amit akartam, nem pedig mondjuk, egy beleesett hajszálat). Pozitív és negatív kontroll mindig szükséges! Negatív: csak víz, ha ezen feljön valami, akkor az egyik reagensem szennyezett. Pozitív: Berakok egy olyan DNS-t, amire tuti, hogy kell kapnom reakciót (csíkot), ha ez se ad pozitív eredményt, akkor nem a vizsgált mintámmal volt a baj. Primerek tervezése: G és C (guanin és citozin) együtt legyen min. 50%, ezek erősebben kötődnek. Ne legyen egymásnak megfelelő szekvenciák a primerekben, különben összetapadnának, sőt arra is figyelni kell, hogy egy adott primeren belül ne legyenek olyan szekvenciák, hogy önmagával összetapadjon (pl. hajtűszerűen). Ha két gént akarok vizsgálni egy csőben, akkor a primereknek nagyon specifikusaknak kell lenniük, és az olvadáspontjaiknak nagyon közel kell lenniük egymáshoz (5 C-on belül). Tm= ahol a primerek 50%-a már elvállt. A primerek hossza nukleotid, a hosszuk különbsége lehetőleg 4-en belül legyen. Ha ismerem a sokszorosítandó szekvenciát, akkor nem kell sokat gondolkodni, az egyik primer az 5 -végéről az első húsz nukleotid lesz, ez a másik szálhoz fog tapadni, a másik primer a 3 -vég első 20-ának a komplementere visszafele olvasva, tehát gtaacgctttaggc végűre gcctaaagcgttac primer kell. Ha csak kimutatni akarom pl. egy baci jelenlétét, akkor mindegy melyik részét PCR-ezem fel a genomnak, ilyen esetben nagyobb a szabadságom, figyelembe vehetek egy-két javaslatot. Repetitív szekvenciákon (pl. GCGCGC) el tud csúszni a primer. Saját magával és a másik primerrel ne legyen nagy komplementer szakasz. Az utolsó nukleotid jó, ha G, hogy jó erősen zárjon a 3 -végen, de azért az se jó, ha az utolsó ötből háromnál több G/C van, mert akkor túlságosan jól tapadna a DNS-hez. 5 -vég változatos lehet, nem baj, ha lelóg, bele tudok tenni egy csomó mindent, ami később hasznos lehet, ez a primert nem fogja zavarni. cdns-t RNS-ből készítünk, ez utóbbi izolálása során, ha ügyetlen vagyok, akkor maradhat mellette genomi DNS is. cdns-ben csak az exonok vannak együtt, ha marad genomi DNS amiben benne van az intronok is akkor két csíkot kapok a gélen. Ennek kiküszöbölése érdekében érdemes az exon-exon határra tervezni a primert (ha csak a cdns kimutatása a célom, hogy megtudjam mennyi RNS-em volt az eredeti mintában). Tudok degenerált oligonukleotidokat is csinálni. A genetikai kód degenerált: egy triplet egy aminosavat egyértelműen meghatároz, de visszafele ez nem működik, tehát aminosav-sorrendből nem egyértelmű a DNS. A probléma kezeléséhez primer poolokat kell gyártatni, vagyis egy csomó primert kell rendelnem, amik csak egy kicsit különböznek, pl. az aminosavam izoleucin, ezt az ATC, ATT és ATA kódolja, ezért mind a három féléből kell szereznem, de az első kettő nukleotidja legalább biztos. 21

22 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): Ha már megvan a primerem, akkor érdemes ráereszteni a teljes, eddig felfedezett genetikai állományra, hogy megtudjuk milyen egyezőség létezik vele, remélhetőleg csak az az egy, amire terveztem (főleg a fajon belül ne legyen másik egyező hely). Multiplex PCR: Több reakció egy csőben, ha lusta vagyok, vagy spórolni akarok. A primerekre persze nagyon oda kell figyelni, páronként kell ellenőrizni, hogy ne tapadjanak egymáshoz, közel legyen az olvadáspontjuk Főbb hőstabil polimerázok: Taq (Thermus aquaticus) a legolcsóbb, gyors, kb ként hibázik egyet. Pfu (Pyrococcus furiosus) lassabb, de csak 1.3 mbp-onként hibázik, mert van 3 5 exonukleáz aktivitása, időnként visszaellenőriz. A Vent vagy Tli (Thermococcus litoralis) hőstabilabb, sokkal tovább bírja, 7 óra a féléletideje, van 3 5 exonukleáz aktivitása, de lassú. Nemrégiben kitalálták, hogy ezek legyenek koktélban, egyesítik a pontos és a gyors polimeráz előnyeit. Ugyanezt el lehet érni mutációval is. Adalékanyagokkal is lehet növelni a specificitást, pl. DMSO-val, DTT-val (ditiotreitol: redukáló anyag, diszulfidhidakat bont), glicerinnel. Manapság már teljes PCR-mixet árulnak, ebbe csak a primert, DNS-templátot és vizet kell venni. Extra szakaszok: Mivel az 5 -végről lelóghatnak dolgok, rárakhatok a primerre restrikciós endonukleáz hasítóhelyeket, pl. accggt-t (palindrom!). Kizárólag ennél fogva a r.e. még nem biztos, hogy tud hasítani, ezért ajánlatos pluszban 3-4 nukleotidot utána berakni, mindegy milyet, de azért ne legyen komplementer egyik primerrel se. A másolás után rajta lesz a másik szálon is, hosszabb lesz az egész, aztán rakhatunk rá, mondjuk egy promóter szakaszt is bármeddig hoszszabbíthatjuk. Ezen a hasítóhelyen vágva ragadós véget kapunk, ezáltal beültethető plazmidba egy teljesen idegen DNS-darab. SNP nem kimutatható, ha nincs benne egy ismert r.e. hasítóhelyében. Erre is jó a PCR, tervezünk a mutációra egy olyan primert, ami jó ez egyik fajta polimorfizmusra (pl. a vadtípusra), de nem tapad a másikra. A primer utolsó 3 -végű nukleotidja kulcsfontosságú, ha ez nem passzol, akkor a polimeráz nem kapcsolódik, így nem képződik termék. A DNS túloldalára olyat tervezünk, ami betapad, de csak akkor lesz exponenciális a növekedés, ha minkét primer stimmel. Általában megcsinálják a kísérletet úgy is, hogy a mutánsra legyen jó és a vadtípusra ne. Néha van, hogy elfogadja az enzim ezt az egy hibát, és ha ezen túllendül, akkor már minden OK, ezért elrontják hátulról a harmadikat is, mert ha már kettő nem jó, akkor leesik egyben az utolsó három. 22

23 Mennyiségi kimutatás: a PCR végén mindig ugyanannyi termék lesz, tökmindegy mennyi volt az elején, mert a limitáló tényezők mindenestben egyformák (dntp, primer, enzim). Radioaktív PCR nagyon érzékeny: ki kell csapni a DNS-t, hogy ne legyenek benne a radioaktív nukleotidok, és csak a két (?) amplikonnak a radioaktivitását mérik, minél radioaktívabb, annál több ilyen jelölt nukleotid épült be, vagyis annál több mintám volt kezdetben. Realtime (q)-pcr (RT-PCR-nek inkább a reverz transzkriptáz PCR-t szokták rövidíteni): kitűzök egy mennyiségi küszöbértéket, és figyelem, hogy mikor az egyes minták mikor érik el: x ciklus különbség 2 x -szeres mennyiségi különbséget jelent. A rendszer azért ilyen érzékeny, mert egy fluoreszcens festéket használunk a méréshez. Magában a készülékben van egy fényforrás, ami gerjeszti ezt a festéket és van egy detektora is, ami méri a fluoreszcenciát. Ez a festék olyan, hogy csak a dsdns-hez kötődik (pl. SYBR Green 6 ) (működése: animáció), és mivel a templátból nagyon kevés van, a jel arányos az amplikon mennyiségével. Kétféle módon szokták ezt a qpcr-t csinálni, vagy átlátszó csövekben, vagy a drágább készülékek esetében kapillárisokban. A primert úgy tervezzük (speciális programmal), hogy rövid szakaszt erősítsen fel, így kisebb az esély, hogy az enzim leugrik róla, jobb a kitermelés. A qpcr hátránya, hogy csak minimum egy ciklusnyi, azaz kétszeres mennyiségi különbséget tud kimutatni az egyes minták közt. Nagyon gyakori, hogy két lépéses PCR-t használunk: 90 C után 60 C-ra hűtjük (kisebb hőmérsékleten kevesebb hibát vét a polimeráz), betapad a primer és itt is történik a polimerizáció, csak kicsit lassan, viszont rövid az amplikon (1-200 bp), szóval ez nem akkora probléma. Hot starttal kezdünk, hogy ne kezdjen a polimeráz már az elején bárhova betapadni. Ezeket a trükköket, mind azért találták ki, mert itt extra fontos a specificitás. Ct érték (cycle threshold): Mely ciklusszámnál éri el a fluoreszcencia a küszöbértéket. A specificitást két módon ellenőrizhetem (mindkettőt meg szokták csinálni): Fogom a csövet és a tartalmát megfuttatom gélen, ha egy csík lesz, akkor minden OK. A másik módszer az amplikonok olvadáspontjának ellenőrzése (melt curve analysis). Ha véletlenül egy másik DNSszakasz szaporodna fel, akkor valószínűleg más olvadáspontja lenne, mint a tervezettnek, mert más lenne a hossza és a nukleotidösszetétele. Hatékonyság ellenőrzése: Az egyes PCR-ciklusokban nem tökéletes a duplázódás, csak egy hatásfokkal jellemezhető. Ennek mérésére csinálnak egy hígítási sort, ábrázolják a ciklusszámot a bemért DNS mennyiségének függvényében, egyenest illesztenek rá, és a meredekségéből számítják az E-t (efficiency): E=10-1/meredekség, E=1.90 alatt nem jó a PCR. 6 Eredetileg a Molecular Probes, Inc. védjegye, ma a Life Technologies Corp. tulajdona, amit viszont a jegyzet írása alatt vásárol fel a Thermo Fisher Scientific, mely így a legnagyobb cég lesz a labor- és kutatóeszközök gyártása terén. 23

24 Gyakran megkövetelik a még erősebb specificitásigazolást, egy ilyen erre szolgáló módszer, az ún. TaqMan -próba 7 (Thermus aquaticus polymerase + Pac-Man 8 ). A DNS-szakaszom közepére is tervezek egy harmadik primert, vagy más szóval próbát, ami a másolás során nem épül be, hanem eltűnik, minden ciklusban duplázódik az eltűnésük. A próba két festéket tartalmaz, az egyik az a riporter, a másik pedig elcsendesíti, kioltja azt. Amikor a megindul a DNS-szintézis és a Taq-polimeráz eléri a próbát, akkor levágja róla a riporter festéket (a kioltás megszűnik), ezt tudjuk detektálni. Az aspecifikus SYBR Green-nel szemben ez a festék specifikus, nem kötődik hozzá a DNS-szakasz bármelyik darabjához, ezért akár 3-4 féle reakciót is tudok detektálni párhuzamosan, úgy, hogy a különböző próbákhoz kapcsolt festék különböző frekvenciájú sugárzást bocsátanak ki. További specificitásfokozást tesznek lehetővé a molecular beacon-ök. Csinálunk egy olyan oligonukleotidot, ami csak annyira stabil a DNS-hez kötött állapotában, hogy egy nukleotid hibával már inkább magával kapcsolódik össze hajtűformában, ez utóbbinál a két végén lévő festék közel van egymáshoz, így nem ad fényreakciót, míg betapadva igen. A PCR során egyre nő az intenzitás a növekvő DNS mennyiséggel párhuzamosan, mégse mennyiségi meghatározásra használják, hanem inkább a mutáns és nem mutáns DNS-darabok megkülönböztetésére. Ha már egy nukleotidnyi mutáció van a szakaszon, akkor ehhez nem köt be a molecular beacon ezért nincs fényreakció. Gélen ezt nem tudnám megállapítani, mert ugyanott lenne a két csík (ehhez meg se kell futtatni a gélt, tehát ahol sok ilyen vizsgálatot végeznek, megéri ezt csinálni és nem a primer tervezős módszerrel dolgozni). Ez a harmadik módszer SNP-k detektálására. 7 Eredetileg Roche Molecular Systems és Applied Biosystems, ma a Life Technologies védjegye, amit a jegyzet írása alatt vásárol fel a Thermo Fisher Scientific. 8 A Namco (Nakamura AmusementMachine Manufacturing COmpany) védjegye. 24

25 Touchdown PCR: A PCR specifitását lehet növelni ezzel a módszerrel. Lényege, hogy az annealing hőmérsékletet a ciklusok során fokozatosan csökkentjük, az elején 3-5 C-kal a Tm felett, míg a végén akár ennyivel alatta is lehet, pl. 53 C-on is. A kezdeti magas hőmérséklet nem engedi meg a pontatlan kötődéseket, csak a legjobban passzoló helyre kötődik be a primer, ezek már az elején megsokszorozódnak és a későbbi ciklusokban elnyomják azokat a szekvenciákat, ahova a primer alacsonyabb hőmérsékleten is (ahol hatékonyan megy az egész PCR) be tud kötődni. A gradiens PCR is a specificitását növeli, a rendszer képes arra, hogy különböző hőmérsékleten tartsa az egyes oszlopokat (12 db) pl C-ig. Ahol csak egy csíkot kapok, azzal az annealing hőmérséklettel dolgozok az adott primer párral, vagyis így ellenőrzöm, hogy csak egy helyre kötődött. Ez a módszer 25

26 Szekvenciaanalízis Manapság szinte csak Sanger-féle 9 láncterminációt használnak. Arra a kérdésre keressük a választ, hogy egymás után hogy jönnek a bázisok? Ez a módszer nem azt a láncot nézi amit szekvenálunk, hanem azt, amit róla polimerizálunk. Alapja, hogy ez a szintézis véletlenszerűen megakad, ezeket megfuttatva kapunk egy csomó csíkot egy-egy nukleotid különbséggel. Négy csőben csináljuk, az egyikbe rakunk, mondjuk ddatp-t (dideoxi-atp) is, ami megállítja a láncot, mert hozzá már nem tud kapcsolódni nukleotid. Így olyan különböző hosszúságú fragmenteket kapunk, amikben az a közös, hogy mind az A-nál álltak meg. Ha viszont ebből túl sokat teszek bele, akkor már az első adeninnél megáll. A négy különböző csőbe, beleteszem a négy különböző dideoxi-nukleotidot, és lefuttatom a négy csövet; egy helyen (egy szintben) csak mutáció esetén van két csík. (videó) A futtatás után alulról leolvasom a nukleotidok sorrendjét. Azért, mert egy csík elég halványan látszódna, radioaktív jelölést kell alkalmazni, például a datp-t, mert ez a legolcsóbb (ez 9 Nevét Frederick Sangerről az inzulin felfedezőjéről, a kétszeres kémiai Nobel-díjas brit biokémikusról kapta. (A jegyzet írásakor 94 éves.) 26

27 beépülve mindegyik mintában benne lesz). A módszer fontos előkövetelménye, hogy különlegesen tiszta templát DNS-re van szükség: nem maradhat benne fenol, se kis fragmentek amik esetleg a PCR után maradtak, ezeket pl. CsCl centrifugálással, vagy oszlopkromatográfiával lehet eltűntetni. Ezután nekünk egyszálú DNS-re van szükségünk: a dsdns-t denaturálni kell (melegítéssel és gyors hűtéssel) ss-é; ez valójában nem egyszálú, de nem talál vissza a társához, hanem hurkokat alkot. GC-gazdag helyek hajtűket alkothatnak, ezért alkalmazhatnak alternatív nukleotidokat, pl. 7-deaza-dGTP-t (nincs benne egy nitrogén), ez nem képez hármas kötést. A reakcióelegyet 65 C-ra fűtöm, hogy betapadjon a primer, aztán lehűtöm szobahőmérsékletre, itt zajlik a reakció. A polimerizáláshoz ún. szekvenáz enzimet használnak, ez egy módosított T7 polimeráz. Az reakciópuffer gyakran tartalmaz még pirofoszfatázt, ami eltűnteti a keletkező sok pirofoszfátot, így nem tolódik el annyira a reakcióegyensúly, elkerülhető a polimerizáció lelassulása. Szekvenálás hőstabil polimerázzal (Taq-kal): Úgy kell elképzelni, mintha PCR-eznénk, de csak az egyik irányba. Azt csinálom, hogy egy DNS-szálról nem egy másolatot készítek, hanem elkészítek egyet, utána felfűtöm a rendszert, leválik róla, visszahűtöm, újabb primer fog feltapadni és egy újabb DNS-darab készül el, de nem biztos, hogy ugyanakkora, mint az előző, csak azt tudom, hogy ugyanolyan nukleotidnál fog megállni. Ebben az esetben nem exponenciálisan, hanem lineárisan fog felszaporodni a DNS. Alapból a Taq ddntp-k iránti affinitás igen pici, nem szereti felismerni őket, ezt úgy lehet orvosolni, hogy egyszerűen több dideoxi-nukleotidot kell a rendszerbe tenni, illetve a genetikailag manipulált Taq-ok könnyen felismerik ddntpket és a fluoreszcens jelölteket, így nem kell radioaktivitással dolgozni. Szekvenáló gél: Ha valaki arra vetemedne, hogy a laborban maga szekvenáljon és ne egy erre specializálódott laborba küldje el a mintát, akkor fogjon két üveglapot, fogassa össze és öntsön egy baromi vékony gélt (0,2-0,5 mm). Az akrilamid gélbe tegyen ureát, ami szétfogja denaturálni a kétszálú DNS-t egyszálúvá. Folyamatosan keverje, szűrje le, adja hozzá a katalizátorokat (APS, TEMED) és a végén vákuummal szívassa ki a buborékokat. Ha megdermedt a géle (ilyenkor ugye mindig öntenek rá egy második gélt, ebben az esetben ez most nem történik meg, hanem) fogjon egy cápafog fésűt, ennek a fogai közé töltse be a mintákat és hagyja is benne. Loadolás előtt pufferrel alaposan ki kell mosni a zsebeket. Ajánlatos előfuttatni a gélt, ilyenkor eléri a rendszer az üzemi, 50 C-os hőmérsékletet. Ha lefutott az első négy minta, akkor 15 perccel később lehet újra loadolni, így egy gélen olyan eredményt (elválasztást) lehet elérni, mintha két gélt össze tudnánk illeszteni egymás alá. Gél fixálás: 10% MetOH, 10% ecetsav. Szárítás: papír, műanyag fólia, vákuum. Előhívás: Röntgen-film, óra, -80ºC. 27

28 Manapság léteznek automatizált szekvenálásra szakosodott cégek, csak be kell vinni hozzájuk a DNS-t és a primert, a többi az ő dolguk. Négy fluoreszcens színnel jelölt ddntp-t használva nem is kell négy cső. A készülékek már nem gélen futtatják meg a mintákat, hanem kapilláris-elektroforézisként működnek: akár egyszerre 384 mintát tud megszekvenálni egy készülék. A kapilláris-elekroforézis képe az elején, az első csúcsig még nem olyan szép, meg az utolsó se, de a középső teljesen jó. Hibridizációs technikák: egy ismert DNS-szekvenciát keresek egy másik szervben vagy élőlényben. Az erre (ma már nem annyira) használt módszer a Southern-blot 10. A hibridizációs módszereket elég gyorsan kiszorították a PCR-ek, amelyek sokkal könnyedebb, gyorsabb módszerek, kis mennyiségű DNS-t igényelnek, nem kell jelölt próbát alkalmazni. Azt, hogy egy gén átrendeződött vagy inszertálódott, azt egész jól és könnyen ki lehet mutatni a Southern-blottal (pontmutációt nem!). A módszer lényege: Mivel egyben nem tudjuk kezelni az egész genomot, a genomi DNS-t restrikciós endonukleázokkal össze-vissza vágjak kis darabokra, így a gélen egy smear (paca) lesz. A futtatás után sóval és lúggal denaturalizáljuk (nem hővel), majd gyorsan neutralizájuk és átszívatjuk egy membránra, amin így ott lesz a gél replikája. Maga az átszívatás úgy zajlik, hogy a gélre rárakjuk a membránt, föléjük meg egy csomó papírtörlőt, ez felszívja a vizet és elindul egy felfelé tartó folyadékáram, a DNS persze nem jut messze, csak a membránig. (A transzfer történhet még vákuummal vagy elektromos árammal is.) A membrán anyaga lehet nitrocellulóz (csóróknak) vagy nylon, ez utóbbi töltött NH3 + -csoportokat tartalmaz, így nagyobb a kapacitása, viszont nagyobb a háttere is. A membránra rátesszük a radioaktívan jelölt próba DNS-darabot, ami oda fog hibridizálni azokhoz a darabokhoz, amik tartalmazzák a próba komplementer részei. 10 Nevét Sir Edwin Southern angol molekuláris biológusról kapta (1975-ben). 28

29 DNS rögzítés: Vákuumos sütés (80ºC), mikrohullám. Próba jelölése: Random priming: Ez egy jelölési mód: fogok random hexamereket, amik valahova biztos be tudnak kötődni a DNS-szálamhoz, és primerként funkcionálnak. Ezzel meg tudok szintetizálni egy másik szálat, úgy hogy az egyik nukleotidot (mindegy melyiket, úgy is lesz mindegyikből a szálban) radioaktívra cserélek. Az alfa-foszfátnak kell így jelöltnek lenni, mert a β-γ pirofoszfátként leválik, ha viszont végjelölést csinálok, akkor gamma-jelölt kell. PCR (mindenre jó): Ha ismerem a szakaszt, amiről próbát akarok gyártani, akkor termeltetek egy primert róla és felsokszorozom. Ilyenkor két radioaktív szálat kapok, egymás komplementereit, de ezek ugyanaddig fognak futni, egy helyen lesznek a gélben (még dupla erős is lesz a radioaktív jel). Hibridizáció: Alapvetően két módszer használható: lehet csinálni kamrában (csőben) vagy zacskóban. Előbbi: A membránt betekerik a cső falához, a lötty forgás közben mossa a membránt, közben temperálható. Utóbbi (low-budget verzió): a membránnak megjelölik az egyik oldalát, hogy tudják melyik érintkezett a géllel (pl. ceruzával, vagy a jobb felső sarkát levágva) beteszik egy zacskóba, duplán lehegesztik az oldalait, levágják az egyik sarkát és ezen át töltik be az oldatokat. Addig nyomogatjuk, amíg ki nem jönnek a buborékok és visszahegesztjük. Ezután egy vízfürdőben úszó tálcába tesszük, amiben szintén víz van, ennek az az értelme, hogyha kilyukad a zacskó, akkor nem menjen tönkre az egész vízfürdő. Itt hagyjuk C-n 1-2 órát. OFF: Aszimmetrikus PCR: Az egyik primert sokkal kisebb koncentrációban adom az elegyhez. Az első néhány ciklusban csinálunk sok templátot, aztán ezekről egy csomó egyszálút (elfogy a másik primer). Prehibridizáció: Hibridizálás előtt kell csinálni: az én DNS-em egy nagy smearként van a gélen, ha ehhez hozzányomnám a próbát, akkor az, bizony majdnem mindenhova odatapadna, még magához a membránhoz is. Ennek elkerülésére előtte felkötök egy csomó dolgot (általában lazacspermát), ami aspecifikusan hozzákötődik, sokat kötök hozzá, ezért hozzáköt, de aspecifikusan, tehát le tudom szorítani a specifikus próbámmal (olyan, mint az 29

30 oszlopkromatográfia). Ezután a zacskónak levágjuk egy másik sarkat, és benyomjuk a próbánkat a prehibridizációs oldatra, majd újra lehegesztjük. A specifikus próbánk leszorítja a lazacspermát onnan, ahova a próba specifikusan tapad (1-2 óra C). Ha kész, levágjuk a zacskó sarkát, (a löttyöt nem a csapba öntjük), kivesszük a membránt, beletesszük egy tálcába, és csökkenő sókoncentrációval mossuk, így a végén csak azok maradnak fenn, akik tényleg odavalók, a teljes hátteret el kell tűntetni. Bemegyek a Röntgen-szobába, ráteszem a Röntgenfilmet, -70 C-on kb. 24 óra az előhívás. Ugyanez videóban (erős indai akcentussal ). 30

31 Northern blot: Génexpressziós vizsgálatokra (RNS-ek mennyiségének a vizsgálatára) jó, pl. beadok valamilyen szert és nézem, hogy elkezd-e egy gén (amit sejtek, hogy fog) expresszálódni, ezzel szemben vizsgálom a kontrollt, de előtte kell valami ötlet, hogy mi fog megváltozni. A PCR-hez képest, ami minimum kétszeres mennyiségek közt tud csak különbséget tenni, itt a feketedés elvben kisebb különbségeket is meg tud mondani. RNS-t izolálunk, és intakt RNS-t futtatunk. A futtatás RN-áz mentes gélen történik, amihez DEPC-es vizet használunk, autoklávozzuk + tiszta tűhegyek, bontatlan puffer. Az RNS futtatás után a smearben van két erős csík, a két rrns, ha ezek nem láthatók, akkor kuka. Ezután a próbafuttatás után formaldehides gélen futtatjuk. A formaldehid azért jó, mert megöli a bacikat, így a gél RN-áz mentes, az RNS pedig egyszálú marad benne (RNS képes önmagával kétszálúsodni, ezt meg kell akadályozni). Futtatni lassan kell, akár egy éjszakán át, kis feszültségen, hogy szépen szétváljanak a csíkok. A transzformálás, fixálás, prehibridizálás, hibridizálás és a mosás gyakorlatilag ugyanúgy zajlik, mint a Southern blot esetében. Dot blot és slot blot: ha már tudjuk, hogy hova köt a próba, mert belőttük Southern vagy Northern blottal, akkor nem kell gélt futtatni, elég egy pontba becsöppenteni a mintát, főleg igen/nemre jó (dot blot), de még egyszer: ehhez az kell, hogy a próba nagyon specifikusan, csak egy helyre kötődjön. A slot blotban szabályos lyukak vannak, így minden minta egyforma. A keretre rá lehet kötni egy pumpát így rászívható a membránra. 31

32 NPA (Nuclease Protection Assay): Segítségével meg tudjuk mondani, hogy hol van az adott mrns-nek az 5 és 3 -vége, hol vannak benne az intronok, de a legfontosabb felhasználása a génexpressziós vizsgálat; az RT-PCR és a Northern blot alternatívája. Kis expressziós különbségek kimutatására is jó, erősebb jelet ad, szor érzékenyebb, mint a Northern blot, viszont az a hátránya, hogy a primereket nagyon drágán kell megvenni hozzá. Az RNS mellé rakjuk a radioaktív antisense-eket és olyan enzimet adok hozzá, ami leeszi egy egyszálú RNSeket, ezért csak olyan marad, ami megegyezett a próbával illetve annál rövidebbek is lehetnek, mert a túllógó egyszálú próbát is megeszi. Az egész ribonukleáz-emésztés után csak a próba és a vele párosodott komplementer RNS marad meg, a háttér teljesen eltűnik. A futtatás után már csak át kell transzferálnom a membránra és kész, nem kell pancsolni, már mérhető is (radioaktívan), de akár maga a gél is mérhető. A minta mellé kell csupasz próbát is rakni, hogy ha nem kapok csíkot, akkor tudjam, hogy a próba maga egyáltalán működött-e, és tényleg csak a mintámban nem volt a keresett RNS. DNS-chip vagy microarray: Felhasználása: Génexpresszió vizsgálat (relatív gyakoriság), genomok összehasonlítása, SNP detekció, alternatív splicing és génfúzió kimutatás. Az előző módszerekkel szemben, itt lövésünk sincs, milyen gének expressziói változnak meg, ezért vizsgálunk mindent egyszerre. Az RNS-t izolálják, gyakran cdns-sé írják, mert az stabilabb, fluoreszcensen jelölik és hibridizáltatják egy chipen. A chipen apró zsebek vannak, egy zseben belül sok ugyanolyan oligonukleotid van, de minden zsebben más van. A jelölt darabkánk odatapad, ahol megtalálja az antiparalell (vagy más szóval, antisense) nukleotid párját. Amiből sok van, ott erősen világit a zseb, amiből kevesebb, annak a zsebe kevésbé fényes (CCD kamera detektálja). Magyarul meg tudjuk mondani, hogy egy RNS-ből sok vagy kevés volt, de pontos mennyiség megállapítására nem alkalmas, ha komolyabban utána akarok járni, akkor a már ismert génhez ott a Northern blot és az RT-PCR. Kontrollal (nem kezelt sejt) hasonlítjuk össze az eredményt, vagyis az egyes zsebek intenzitását. Az eredmények normalizá- 32

33 lásához, és annak eldöntésére, hogy a módszer egyáltalán működött, belső kontrollt is alkalmazunk, ami azt jelenti, hogy vannak olyan zsebek, amiknek biztos, hogy jelezniük kell és olyanok is, amiknek biztos, hogy nem. Lehet spórolni és ravaszkodni, úgy hogy kétszínű microarrayt csinálunk; ahogy az ábrán látszik, a két sejt közti eltéréseket az mutatja, ahol csak az egyik színű jelölés világít. Az a módszer előnye, hogy rengeteg információt ad, gyors, viszont drága a chip, egyszer használatosak, ezért az ismétlések különösen megdrágítják a mérést. (videó) Kolónia hibridizáció: Akkor használjuk, ha például van egy csomó bacink vagy gombánk egy plate-en és arra vagyunk kíváncsiak melyik az a kolónia, amelyik tartalmazza azt a DNSszakaszt, ami minket érdekel. Ehhez ráteszek egy nitrocellulóz membránt a plate-re, erre rátapadnak a bacik, aztán nyakon öntöm valami lúggal, kinyílnak és akkor ott lesz a baci DNS-e a membránon, keresztkötöm, prehibridizálom, majd hibridizálom. Egy fekete pöttyöt (az ábrán pirosat) kapok ott ahol hibridizált a próba, vagyis ahol a keresett DNS-szakaszom volt. Ezután kiveszem a hűtőből az eredeti plate-et és leszedhetem róla, ami kell. 33

34 Vektorok Vektor: Olyan DNS-molekula, amivel bevihetünk valamilyen genetikai információ egy organizmusba. Négy fajtájuk van: plazmidok, ezek kerülhetnek eukariótákba és prokariótákba, lehetnek fágok (baktériumvírusok), ezek max 20 kb-t tudnak magukba foglalni, ennél sokkal nagyobbak a kozmidok és a mesterséges kromoszómák. Plazmidok: Főleg baktériumokban előforduló kettősszálú cirkuláris DNS-darab, amin 1-2 gén van ( kbp), sokkal kisebb, mint a genomi cirkuláris DNS-ük. Önálló replikonok, mindig van rajtuk replikációs origó. Rolling circle vagy téta-replikációval szaporodnak. F (fertility) plazmid: ún. szexplazmid, egy píluson keresztül a baktérium át tudja jutatni egy kis genetikai darabkáját egy másikba. R (resistance) plazmid: antibiotikum rezisztenciát hordoz. Col (colicine) plazmid: antibiotikumokat kódol más bacik ellen. Antibiotikumokat azért használunk, hogy a rezisztenciát tartalmazó plazmid beépülését detektáljuk; kiszűrjük, kiirtsuk azokat, amikbe nem sikerült beültetni. DNS-darab legegyszerűbb bevitele: kinyitjuk a bacit és ragadós végekkel berakjuk. Tompa végekkel is össze lehet ragasztani, csak sokkal rosszabb a hatásfoka. Linkerekkel lehet ezt javítani, ezek pici DNS darabok, amik r.e hasítóhelyet tartalmaznak, adaptoroknak is hívják őket. Úgy működnek, hogy hozzáragasztják a r.e. hasítóhelyet nem tartalmazó, beültetendő DNS-szakaszhoz, elhasítják, így ragadós végek keletkeznek, amik nyilván tökéletesen illeszkednek a plazmidba, amiben szintén ugyanaz a hasítóhely van. 34

35 PCR-rel (ami mindenre jó) bármilyen véget rá kehet rakni. Úgy tervezem meg a primert a DNS-darabomra, hogy még elé tervezem a baciban lévő restrikciós endonukleáz hasítóhelyét. Mivel a plazmid szekvenciáját mindig ismerjük, ki tudunk nézni egy nekünk tetsző helyet, és azzal megegyező farkacskát kell a DNS-re ragasztani. Ha két különböző szakaszra ugyanazt a primert rakom, amik össze tudnak tapadni, akkor a denaturálás után remélhetőleg lesz egy kis hányad, ami annál a kis résznél tapadt össze. Ezt kiegészítve megkapom a két fragmentet egymáshoz kötve. Transzdukció: A transzformáció egy módja (a többit ld. 8. oldal), gyakorlatilag azt jelenti, hogy a fertőzés után a fág nem tudja szelektálni a szekvenciákat, amiket a fertőzöttben talál, ezért véletlenül továbbviheti a baci DNS-darabját is. Ezt meg tudom csinálni in vitro is, fogom a λ-fágot, kiszedem a DNS-ének a belső részeit, ebben vannak azok a részek, amik a fertőzésért és a szaporodásért felelősek, ezekre nekem nincs szükségem (ezt mondta, de a diákon mintha más lenne ), helyette beleteszem az én DNS-darabkámat és hozzáöntöm a fág fehérjéit, amiből összeépül a teste. Ez a fág a bacit nem öli meg, mert nincsen benne az ehhez szükséges gén. A PCR-rel szemben a baktériumban vannak hibajavító mechanizmusok, ezért jobb ebben őrizni/fenntartani a DNS-darabomat. 35

36 A puc18/19 (plasmid University of California) az egyik legfontosabb plazmid, az M13-ból gyártották, van benne egy lacz gén (ß-galaktozidázt kódol), amiben van egy MCS (multiple clonig site) vagy polilinker szakasz, azaz egy csomó r.e. hasítóhely, de mindegyikből csak egy van benne. Kiválaszthatunk egyet vagy kettőt és közé be tudjuk rakni, a DNS-darabunkat, ha sikeresen beül a lacz-be, akkor nem fog működni a gén. A puc19 szelete Ahhoz, hogy az operon működjön, az kell, hogy ne legyen glükóz, mert leszedné a CAP-ot, ami segíti az átírást, de legyen hozzáférhető laktóz, mert a represszort viszont az szedi le (ld. ábra a köv. oldalon). Hozzáadhatunk a tenyészethez egy ONPG 11 nevű mesterséges szubsztrátot, ami, ha van ß-galaktozidáz aktivitás, akkor sárga terméket ad, méghozzá az aktivitással arányos mennyiséget. Ha a tenyészethez X-gal-t adunk, akkor ß-galaktozidáz aktivitás azaz sértetlen lacz esetén kék színű terméket kapunk, míg a nem működő lacz-sek fehérek, ez a kék-fehér próba. A harmadik fontos mesterséges szubsztrátunk az IPTG 12, ami egy laktóz analóg, tehát a lacz induktora, az operátor régióhoz köt, leszedi a represszort, de megemészteni nem tudják, tehát soha nem fogy el. Ha kinő a telep, akkor benne van a plazmid, mert rezisztens a talajban lévő antibiotikumra, de ami kék, abban működik a lacz-ről átírt ß-galaktozidáz, tehát a génünk nem inszertálódott. 11 orto-nitrofenil-ß-galaktozid 12 izopropil-ß-d-1-tiogalaktopiranozid 36

37 A lac operon működése: Klónozó vektor: tartalmaz egy helyet, ahova berakhatjuk a fragmentünket, ezért gyárilag lyukasan, nyitottan árulják. A PCR-ezés során a Taq-polimeráz nem tompa végeket csinál, mindig rárak a DNS szakasz végeire egy-egy A-t, ezért a TA TOPO 13 klónozáshoz a plazmidot úgy alakították ki, hogy pont belepasszoljon az 1-1 lelógó T-khez. Expressziós vektor: egy meglévő DNS-darabot fognak a klónozó vektorból, átteszik és kifejeztetik (mert érdekes tulajdonságai a fehérjéknek vannak, nem az azt kódoló DNS-nek). A vektort először baktériumban felszaporítjuk, izoláljuk, tisztítjuk, utána betehetjük eukarióta sejtbe. Az alábbi képen lévő ptarget 14 egy egyszer használatos, de praktikus, kényelmes és gyors megoldás (benne ott neomicin-rezisztencia gén, ami tipikusan eukariótákban használatos szelekciós marker). 13 Eredetileg Invitrogen Life Technologies Thermo Fisher Scientific 14 A Promega Corporation védjegye. 37

38 Könyvtárkészítés: Fogunk egy klónozó vektort, csinálunk benne egy lyukat (vagy már elhasítva vesszük), összevagdossuk a genomi DNS-ünket kis darabokra, összekeverünk sok ilyen DNS-darabot sok plazmiddal, így jó eséllyel különböző plazmidba különböző darabka kerül. Ezután beültetjük őket, mondjuk baktériumba, és ha szerencsénk van, akkor egy baciba csak egy plazmid ül be. A baktériumokat kiszélesztjük, majd ezek közül pl. kolónia hibridizációval megkeressük azt a telepet, ami minket érdekelhet. Kozmid (cos+plazmid): Míg a plazmid csak 1-20 kbp-t tud befogadni (márpedig az intronokkal teletűzdelt eukarióta gének simán tudnak ennél hosszabbak lenni), a kozmidba akár kbp is belefér. Nevét a cos-régióról kapta, ami λ-fág konkatamerjében (a rolling circle replikáció gyakori terméke, egy több kópiát egymás után tartalmazó DNS-szál) található. Beültethető λ-fágba, ami transzdukcióval szaporodik, így hatékonyabb, mintha a baci sejtfalán próbálnánk átgyömöszölni. Fosmid (F-plasmid): Amikor baciba kerül, akkor alacsony lesz a másolatszáma, általában egy darab marad egy baciban, ezáltal kisebb a rekombináció esélye, jól megőrzi az infót. YAC (Yeast Artificial Chromosome): kbp nagyságú DNS-fragment klónozására alkalmas vektor. Élesztőbe teszik bele és mivel vannak benne telomér és centromér régiók meg replikációs origó, szaporodáskor azt hiszi, hogy ez egy kromoszóma és lemásolja. Mivel az élesztő eukarióta, az antibiotikum nem hat rá, ezért van benne TRP1 régió: triptofán-szintézis hiányzó enzime, ezért túl él az élesztő, ha megkapja a plazmidot (ld. még 9.o.), amelyik nem, az viszont megdöglik, mert a fogadó sejtben a recesszív trp1 allél van. URA3 ugyanilyen. BAC (Bacteria Artificial Chromosome): F-plazmid alapú, ebbe kbp-t tudnak betenni. Nem fog rekombinálódni a baci genomjával, se más plazmiddal, ezért tértek át a YACról BAC-ra a Human Genome Projectben. 38

39 Ligálás nélküli klónozás: Miért akarom elkerülni a ligálást? Mert hosszú, bonyolult; nem tudom, hogy nem kötődik-e össze a plazmid sajátmagával, a DNS-fragmantek egymással A ligálás mentes klónozáshoz az kell, hogy a gyártott DNS-szakaszoknak hosszú ragadós végük legyen, ezekben már olyan erősek a másodlagos kötések, hogy nem kell ligálni. Ki tudok hagyni egy csomó tisztítási lépést, növeli hatékonyságot; nem kell attól félnem, hogy fordítva ül bele a DNS-darabom, vagy, hogy egymással tapadnak össze. A ligálás nélküli klónozási módszerek közül kettőt nézünk át: USER - klónozás 15 (Uracil-Specific Excision Reagent): A cégtől megveszem a plazmidot, amin van egy-egy r.e. hasítóhely (PacI), meg két-két nick-elő enzim hasítóhely (Nt.BbvCI). A nick-elő enzim a kettős szálú DNS-nek csak az egyik szálát metszi be. Az enzimes kezelés után a plazmidon olyan ragadós végek keletkeznek, amik nem tudnak egymással összetapadni, mert kiesnek az áthúzott részek. Ezután csinálok egy PCR-t, amihez úgy tervezem a primert, hogy legyenek lelógó 5 szakaszok, méghozzá olyanok, hogy komplementerek legyenek a plazmid ragadós végeivel, viszont olyan trükkösen rendelem a primert a cégtől, hogy az első T helyett U-t kérek. A PCR után hozzáöntöm a cég keverékét, a hibajavító enzim kivágja az uracilt és mivel csak másodlagos kötések tartják össze a többit, ezért statisztikusan egy részükben az egész szálvég leesik, így ragadós vég keletkezik, ami pont beleillik a vektorba. (A restrikció endonukleáz is csak egy helyen vágja el a szálat a másik 3-4 nukleotid ugyanemiatt tud elválni.) 15 A New England Biolabs, Inc. védjegye. 39

40 Ligálás independens klónozás: A vektor klónozó része speciális: van egy r.e. hasítóhely, utána pedig viszonylag hosszú szakaszon csak három féle bázis van: pl. GCT és komplementer szála GCA. A restrikciós hasítás után hozzáadnak T4-polimerázt, aminek van 3 5 exonukleáz aktivitása, ez visszaemészti a GCT-s szálat egészen addig, amíg A-t nem talál. Ezt is leszedi persze, de mivel adunk a rendszerhez datp-t, sokkal nagyobb a valószínűsége, hogy utána rögtön vissza is rakja. Az így kapott plazmidhoz a PCR során úgy tervezem meg a primert, hogy megegyezzen a plazmidról lerágott résszel, tehát a plazmid emésztésekor hozzáadott nukleotid komplementerét adjuk most az emésztéshez, jelen esetben dttp-t (az alsó ábrán C-hiány miatt tűnt el a 3 -plazmidvég, ezért a DNS-szakasz emésztésekor dgtp-t adagolunk). A DNS-szakasznak tehát a (lelógó primer miatt) az 5 -végében nincs benne az, ami a plazmidnak meg a 3 -végéből hiányzik. A primer PCR során kiegészült szakaszát elbontja az enzim, egészen addig, amíg meg nem találja azt, amit hozzáadtam. T4-es emésztés itt tehát az első T-ig zajlik, ez fog illeszkedni az első A- hoz, ami a plazmidon maradt. Az alsó ábrán a plazmid G-, a PCR termék pedig C-hiányosan egyszálú (egyszálúság a 3 5 exonukleáz aktivitás miatt természetesen csak az 5 -végen lehet). 40

41 Könyvtárak Könyvtárak: Reprezentálják az adott organizmust, vagy annak speciális részét. Van genomi és cdns könyvtár. Könyvtáraknak nevezhetjük magát a genetikai anyagot is; van sok plazmidunk, különböző DNS-ekkel, amit egy adott organizmusból nyertünk és benn van egy csőben, már azt sokszor könyvtárnak hívjuk. Vagy beteszik vektorba, esetleg belenyomják valamilyen organizmusba (szuszpenzióban/plate-en), ezeket mind nevezhetik könyvtáraknak. Keresés: genetikai-, vagy fehérje-információ alapján; a kolónia hibridizáció a genetikai információ alapján való keresésre volt példa. Arra, hogy kiderítsem a beült DNS-darabom környékét a legjobb módszer az inverz PCR: A genomi DNS-t szétvágom restrikciós endonukleázokkal és összehegesztem ligázokkal, ami után jó eséllyel kis cirkuláris darabok keletkeznek (a végek magukkal kapcsolódnak össze). A beült szakaszhoz kifele (3 -végen utolsó 20 ) tervezem a primert, hogy megtudjam a környékét. Pl.: megfertőzök valamit egy ismert vírussal és kíváncsi vagyok hova építi be a DNSét, mivel ismerem a vírus szekvenciáját, tudok rá primert tervezni. cdns szintézis: mindig RNS-ről írunk át reverz transzkriptázzal (az RNS-vírusok használnak ilyet, pl. a HIV). Először kétszálúsítani kell az RNS-t, a kiegészítő szálat kétféleképpen írhatjuk át (a reverz transzkriptáznak primer kell); vagy úgy, hogy tudjuk, hogy az eukariótáknak poli-a farka van, ehhez pedig tervezünk egy poli-t primert + hozzáadjuk a dntp-ket és az enzimeket. 41

42 A másik megoldás az ún. random priming: A random primerek valahol betapadnak, így kis szakaszokban íródik át a másik szál. Ha kétszálú cdns-re van szükségünk, akkor miután átírtuk az első szálat, az alap RNS-t ki kell cserélni DNS-re. A reverz transzkriptáz egy hajtűkanyarral képes visszafordulni és megcsinálni a másik szálat is, de ez lassú és esetleges, ezért hozzáadunk RN-áz H-t, ami nick-eket vagdos a szálba, valamint hozzáadunk DNS-polimeráz I-t is, ami a hibát látva kijavítja, de már dntp-kel. A DNS-polimeráz az RNS-szál legvégét már nem tudja átírni, ezért ragadós végek keletkeznének, ha nem használnánk T4 polimerázt is. rrns-t csak random priming-gal lehet átírni, mivel nincs poli-a farka! Ezt a szálat aztán többnyire plazmidba akarjuk ültetni, amihez a tompa vég nem túl jó, ezért pl. a poli-t véghez berakhatok r.e. hasítóhelyeket egy adapter segítségével, amit blunt-enddel ligálunk a cdns két végéhez. Ha irtózok a blunt-end ligálástól, akkor terminális transzferázzal rakok rá egy poli-g véget (ld. 14.o.: terminális-dezoxiribonukleotidiltranszferáz, 3 -végtől random sorrendben nyomja a semmibe a láncot, ez nem jó sok mindenre, de ha csak egyféle dntp-vel etetjük, akkor homopolimer farka lesz a szálnak. ), ehhez a poli- G véghez tervezek egy poli-c primert, rajta 5 -végen egy másik adaptorral. Ha restrikciós enzimekkel akarom beültetni a szakaszomat, akkor a szál belsejében lévő hasítóhelyeket metilálni kell, ehhez kell a specifikus metiláz és a metil-csoport-szállító molekula, a SAM (S-adenozil-metionin). Kell tehát a cdns szintézishez: RNS, primerek, Tris, KCl, MgCl2, dntp, DTT (ditriotreitol), RN-áz inhibitor, reverz transzkriptáz, víz meg egy óra szabadidő. 42

43 Az RT-PCR arra való, hogy kimutassak egy RNS-t a mintában, vagy realtime-mal a menynyiségét is megmondhatom. A DNS-polimeráz az RNS-szál legvégét már nem tudja átírni ezért az 5 -végek hiányosak, sőt a 3 -vég is problémás lehet, mert a poli-a végen könnyen elcsúszhat a poli-t primer. Ezt a problémát az 5 - és a 3 -RACE módszerrel lehet orvosolni. A RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) egy olyan technika, amellyel hozzájuthatunk egy sejt RNS-transzkriptjének teljes szekvenciájához, amit aztán PCR-rel sokszorosíthatunk. Először ki kell választanunk egy olyan klónt, ami tökéletesen sikerült. Ha már van egy csomó másolatom ilyen-olyan minőségben, akkor ebből mintát veszek, és mivel ismerem a szekvenciát, most már nem random primerrel meg poli-t farkakkal fogok itten szórakozni, hanem szekvencia-specifikus primert használok. Ezzel elkészíttetem az első szálat és hozzáadok terminális transzferázt, ami poli-a véget csinál, ehhez pedig oligo-t primert tervezek adaptoros véggel. A másik szálra is adatport téve, mindkét vége ragadós lesz. A 3 RACE hasonló, csak ott az első szál átírásánál használok adaptor-primert, és a másodiknál használok szekvencia-specifikus primert. FirstChoice 16 RLM-RACE: Van egy nagyon spéci kit, ami csak olyan mrns-eket vizsgál, amik tuti, hogy tökéletesen épek (kiválogatja azokat, amiket nem ért RN-ázos bontás). Mivel szekvencia-specifikus primert használok, itt nem az egész RNS-poolt írom át, hanem csak azt az egy darab gént, amit vizsgálok, hogy mi a szekvenciája. Tehát egy reverz transzkripciót mikor elkészítek, az az összes RNS-re vonatkozik, amikor vizsgálom azt az egy gént vagy RNSt, ami engem érdekel, akkor kezdek el szarozni a RACE-val, addig nem nyúlok hozzá, amíg nem tudom melyik az a klónom, amiben az RNS van. Megszekvenálom és ennek ellenőrzésére tervezek a szakaszra egy specifikus primert. Tehát első lépésben az összes RNS-emet belenyomom a vektorba, screenelés után (pl. kolónia hibridizáció), kihalászom a bacit, amiben benne van a génem, a baciból kiszedem a plazmidot, elküldöm megszekvenáltatni és erre tervezek primert. Gyakran viszont nem ez a teljes RNS-szekvencia, ezért visszamegyek a hűtőhöz, kiveszem azt a mintát, amiből az RNS-t izoláltam és a cdns-t átírtam, és akkor kezdem el a RACE-t. A bizonytalanságot az okozza, hogy sok átírás volt, nem biztos, hogy mindig tökéletesen tapadt be a primer, valamint tudjuk, hogy az 5 -végről levághatott darabokat a T4- polimeráz. Az 5 RLM-RACE-nél (RNA Ligase Mediated-RACE) csak ép mrns-ből fogunk DNS-t izolálni. Ilyenkor hozzáteszünk CIP-et, ami azt fogja nekünk eredményezni, hogy a nem ép mrns-eknek a foszfát-vége levágódik, míg az épek, amiken rajta van a 7-metil-guanozin sapka, azokkal nem történik semmi. Kitisztítjuk belőle a CIP-et és hozzáadunk TAP-ot (Tobacco Acid Pyrophosphatase), ez pedig leszedi a 7m G-P-P-t, így marad rajta egy foszfát. 16 Invitrogen Life Technogies Thermo Fisher Scientific. 43

44 A két lépés után tehát az épeken lesz foszfát-vég, a nem épeken pedig nem. Ez azért jó, mert az épekhez így hozzá tudunk ligálni egy adaptert, a foszfát-hiányosokhoz viszont nem. A ligálás után fel tudom a szálat PCR-ezni, hiszen ismerem az alap szál és az adapter szekvenciáját is, így tudok rájuk primert tervezni. A 3 RACE esetében úgy tervezzük a primert, hogy az oligo-t rész után az első nukleotid (utolsó előtti) az bármi lehet csak nem timin, az az utáni (utolsó) pedig bármi a négy nukleotid közül; a cég tehát egy 3*4=12- es primer poolt ad. Nem tudni melyiket használja a reakció, de így biztos, hogy nem csúszik el a primer a poli-a szakaszon. 44

45 Expressziós rendszerek Most már tényleg meg akarjuk nézni a fehérjéket, hiszen a valós életfunkciókért a fehérjék a felelősek, ezért ráveszünk valamilyen élőlényt, hogy expresszáltassa. Ezután valahogy el kell különíteni, ki kell nyerni, vagy ha az organizmuson belüli útját akarjuk figyelemmel kísérni, akkor elég csak detektálni. A négy leggyakoribb expressziós rendszer: baktérium, élesztő, bakulovírus (rovarsejt), emlős sejt, de lehet még: növény sejtek, nyálkagomba, Drosophila sejtek. A felhasználási cél szerint kell választanom organizmust: A baktériummal való termeltetés gyors, viszont nem biztos, hogy a fehérje tökéletesen be tudja tölteni a funkcióját, nem feltétlenül lesz megfelelő a glikoziláltsága, máshogy tekeredik fel. Az emlős sejtek ezen szempontok szerint pont fordítva működnek. Hátulütők: A termeltetett fehérjére alapvetően nincs szüksége az organizmusnak, túltermelés esetén könnyen toxikus lehet a termelőre nézve, ennek kiküszöbölésére két megoldás lehetséges: alacsony kópiaszámú plazmiddal keveset termeltetek vagy gazdát cserélek, akárhogy is: mérgeket mindenképpen nehéz számottevő mennyiségben expresszáltatni. Fontosabb lépések: 1. Teljes hosszúságú cdns klónozása expressziós vektorba. Miután leellenőriztem, hogy a vektorban biztosan az a DNS-darab van, amit én akarok, akkor mehetek tovább. 2. Fehérje termeltetése: Erős vagy gyenge, konstitutív, vagy indukálható promóter: folyamatosan vagy kikapcsolhatóan termeltesse. Termeltetés a sejtbe / organellumba / médiumba: Ha azt akarom, hogy valamelyik organellumban gyűljenek fel, akkor szignálszekvenciát kell a fehérje elé rakni. Nagymennyiségű termeltetésnél célszerű a médiumba kiválasztatni. 3. Fehérje vizsgálata: In vivo (hagyjuk, hogy a fehérje eljusson a céljába és megnézzük, mit csinál), vagy in vitro (kromatográfiás tisztítás utáni vizsgálat). Speciális domének kellenek detektáláshoz, tisztításhoz, oldhatósághoz: hozzákapcsolunk egy farkacskát, amit ismerünk, és ezen keresztül tudjuk manipulálni. Fehérjeexpresszió baktériumban: Olcsó, gyors (intraday), nagy mennyiségben tudunk expresszáltatni. Sok fehérje rosszul oldódik, kinyeréskor van, hogy nem a vizes fázisba kerülnek, mert a bacikban mások a körülmények (eukarióta fehérjéket termeltetünk). Megfelelő törzs kiválasztása: BL-21: proteáz deficiens, érdemes ebben termeltetni, a fokozott expresszió érdekében pedig célszerű T7-fág promótert használni (erős, virális promóter). 45

46 Expressziós vektor részei: Mivel az a baktérium, akinek nem kell lemásolni még a plazmidjat is, az előnyt élvez, ezért a mienk hamar eltűnne, ennek elkerüléséhez folyamatosan szelektálni kell antibiotikum rezisztencia alapján. Vannak a vektoron promóter és hozzákacsolódó régiók, például lac operon. MCS (multiple cloning site), ebben sok r.e. hasítóhely van egymásután. Szokott lenni előtte vagy utána egy fúziós peptidet kódoló szakasz, így az átíródó fehérjének két doménje lesz, az egyik az eredeti, amit akartam, a másik meg ad valami extra tulajdonságot, de remélhetőleg nem változtatja meg az eredeti funkcióját. Fúziós peptidek/szekvenciák Ezek a fúziós peptidek a tisztításhoz kellenek, mert a fehérjémet soha nem tálalnám meg, ha nem kötök hozzá egy ismert fúziós tag-et, pl. MBP-t (maltose-binding protein), ami maltózzal vagy amilózzal töltött oszlophoz köt. Egy másik gyakran használt fúziós peptid a GST (glutation S-transzferáz), ami glutationhoz köt affinkromatográfia során, ezután valami proteázzal akár farok (fúziós tag) nélkül is kinyerhetjük az alap fehérjénket. A harmadik a 6xHis-tag: hat egymás utáni hisztidin egymás után, ami nikkel-nitril-triacetát oszlophoz köt. Epitóp-tag: semmi másra nem jó csak arra, hogy felismerjük a fehérjénket. Ilyenkor egy immunogén részt kódoló szakaszt teszünk a fehérjénk után a plazmidra (nem a fehérjét kötjük hozzá, hanem az azt kódoló DNS-szakasz lesz mellette!), nagyon specifikusan tudom antitestekhez kötni. (pl.: Myc-tag, FLAG-tag) Riporter gének: Ha bent a sejtben akarom vizsgálni, hogy merre vándorol, akkor luciferázt, vagy GFP-t (green fluorescent protein) kapcsolunk hozzá. A luciferázok luciferineket bontanak (ez egy anyagcsoport), oxigén vagy ATP felhasználásával, fotonkibocsájtás kíséretében. Itt van példának egy tipikus bakteriális expressziós plazmid (GST-vel működik): A fehérjénk kódoló szakaszának beültetésekor ügyelni kell arra, hogy a GST-t kódoló rész és a mi fehérjénk közt egész számú kodon legyen, vagyis frame-be essen, különben elég hamar találna az átírás egy stop-kodont és tönkremegy az egész. LacI van rajta, tehát IPTG lesz az induktor. 46

47 Gateway 17 klónozási technika: A módszer előnye, hogy még restrikciós endonukleáz emésztés se kell hozzá, elég PCR-rel elkészíteni a DNS-emet és beletenni a plazmidba, utána minden megy a maga útján. A módszer gyors, kényelmes és drága, de egyre elterjedtebb (ha nem is itthon). A PCR-termékre úgy kell terveznem a primert, hogy lelógjon róla egy négy nukleotidnyi rész, ami komplementer a cég által adott nyitott plazmidról lelógó szakasszal (overhang). Úgy árulják ezek a plazmidokat, hogy topoizomeráz van kovalensen kötve az 5'- végi foszfáthoz, tehát ha úgy nézzük, a plazmidban magában benne van a ligáz (topoizomerázként), ezek képesek összeilleszteni a szálat, majd leválnak, a kis Y-alakban lelógó nukleotidsort meg a baci majd levágja. A pentr 18 egy befogadó/klónozó plazmid, ebbe egy lépésben beültethetem a DNS-emet, ez még nem expressziós vektor, viszont van rajta két olyan rész, ami olyan szekvenciákat tartalmaz, amik rekombinálódni képesek egy másik plazmidba. Tulajdonképpen ez a módszer nagy újdonsága, hogy a plazmidok között hatékonyan tudunk DNS-fragmenteket átadni. Klónozás (és ellenőrzés, szekvenálás) után in vitro rekombinációval át tudjuk rakni egy expressziós plazmidba, pl. pet301/ct-dest-be, aminek T7- promótere van, ami erős, és mégis indukálható, mert lac-operátort (laco) tettek hozzá. Természetesen a beültetés után szelektálni kell: Pozitív: ha túlél a plazmid, az azt jelenti, hogy kiesett az a rész, amiben a DNS-topoizomeráz gátló rész van. Negatív: klóramfenikol rezisztencia gén; ha kiesett ez a rész, akkor megdöglik az antibiotikumos talajon. A plazmidon van laci rész, tehát IPTG-vel fogjuk indukálni, és van rajta 6xHis-tag, tehát nikkeles gyantával tisztítjuk a terméket. PreScission Protease 19 : az affinkromatográfiás tisztításkor használják, olyan profi, hogy a fehérjénk utolsó aminosavnál hasít, semmi felesleg nem marad rajta a GST-tag-ből. 17 Invitrogen Life Technogies Thermo Fisher Scientific. 18 Invitrogen Life Technogies Thermo Fisher Scientific. 19 A GE Healthcare védjegye. 47

48 Fehérjék izolálása, tisztítása: Bemegyek reggel a laborba, kihígítom a baktériumkultúrát és hagyom egy kicsit szaporodni. A log-fázis közepén, amikor még jól érzi magát a baci és nem gondol a halálra, akkor adjuk hozzá az IPTG-t, hogy indukáljuk a fehérjetermelést. Lecentrifugáljuk, proteáz inhibitort adunk hozzá, és valahogy kinyitjuk a sejteket (lizozim, detergens, szonikálás ). Hidegben dolgozunk, hogy ne sérüljenek a fehérjék. Rázatjuk hidegben ligandos gyantával, majd pufferrel mossuk és végül eluáljuk a fehérjénket (imidazollal, glutationnal, maltózzal vagy emésztéssel). Ha a fehérjék egy része nem az oldható fázisba kerül, akkor maradt még tenni valónk: Szolubilizálás: A sejttörmelékhez (inclusion body) hozzáöntünk valamilyen kaotrop (szerkezet romboló) anyagot, pl. ureát vagy guanidin-hcl-t, meg SDSt, hogy a lipidek leváljanak, amik esetleg a fehérjékhez vannak kötve. Fehérje renaturálása: A roncsoló anyagokat el kell távolítani, ezért egyre gyengébb detergensekre cseréljük a közeget, több lépésben, hogy nem csapódjon ki a fehérje. Fehérjeexpresszió élesztőben: Előnyei: gyors szaporodás, oxigén hiányában is működhet viszonylag olcsó, nagy mennyiségű szabályozható fehérje termeltetés, jól karakterizált poszttranszláció, eukarióta fehérjékhez ideális. Pichia pastoris expresszió: A Pichia törzsek nem döglenek meg az alkoholtól, sőt van egy alkohol-oxidáz promóterük (AOX1), ami erősen szabályozott: glükóz gátol, metanol indukál. Expresszió előtt éjszakára érdemes glicerines táptalajra tenni, ezt is meg tudja enni és nem gátolja alkohol-oxidázt. Főleg N-glikoziláció jellemző rájuk, nincs hiperglikoziláció, ami a többi élesztőre jellemző, és nincs 1,3-glikán képződés se, tehát nem immunogén a termék. Kevés saját szekretált fehérjéje, van, azt csinálja, amit mi akarunk. Különböző mutánsok vannak, pl. ADE2: szelekció alapja: rózsaszín telepeket képez a felszaporodó purin miatt (ezért ppink a képen lévő plazmid fantázianeve). Csináltak különböző proteáz knock-out törzseket, ezekben az a jó, hogy nem eszik meg a fehérjéket, amit csináltatunk velük. Így néz ki egy Pichia pastoris vektor, van rajta: ampicillin rezisztencia gén (korábban baciban volt), Trp2-szakasz (triptofán szintéziséhez szükséges enzimet kódol, mert az élesztő amúgy trp-deficiensek), AOX1-promóter, MCS (fent), ADE2 a színért, α-faktort kódoló szakasz (eredetileg a szaporodást elősegítő feromont kódol, de ha berakjuk a fehérjénk elé, akkor rá kerül a szignálszekvenciája és szekretálódni fog a termékünk a médiumba, nem kell megölni érte szegény Pichiát). 48

49 Bakulovirus expressziós rendszer: Előnyei: Egyszerű, relatíve olcsó, gyakorlatig bármekkora gént beültethetek, vannak poszttranszlációs módosulások (még jobban hasonlít az emberhez, mint a gomba), vannak chaperoninok (olyan dajkafehérjék, amik segítenek a feltekeredésben), kiválasztható a kompartmentizáció. Van ez az Sf9 (Spodoptera frugiperda) báb petefészeksejt, amit meg lehet venni a közértben, ezt a sejtet megfertőzzük a DNS-sel, amiben benne van a génünk, utána a vírusokat gyűjtjük és újrafertőzünk, amíg elég sok nem lesz nagymenynyiségű fehérje átírásához. Teszünk még a médiumba borjú magzat szérumot (FBS-t, de max 0.5%-t), hogy a sejt ne érezze, hogy egyedül van, ne legyen öngyilkos (túlélési szignál). A klónozás úgy megy, mint a Gateway, topoizomerázzal, egylépésben donor plazmidba, ez még nem expressziós vektor, át kell rakni vírusba. Az ampicillin rezisztens donor plazmidot betranszformáljuk E. coliba, amiben már van egy kanamicin rezisztenciát kódoló bacmid; a transzformáció után tehát mindkét antibiotikumnak ellenáll (és garantáltan egyik plazmidot se veszíti el!). Ezután hozzáadunk a colihoz egy helper plazmidot, amin tetraciklin rezisztencia van meg transzpozáz gén, ami elősegíti a rekombinációt. Az ampicillint és a tetraciklint megvonva eltűnik a már felesleges két plazmid, a bacmidot izoláljuk és transzfektáljuk rovarsejtbe. Szerencsétlen rovarsejt azt fogja hinni, hogy ez egy vírus genetikai állománya és átalakítja a működését a másolásra és az átírásra. Mindegyik termelődött vírus tartalmazza a teljes virális genomot + az én fehérjém génjét. Fogjuk ezeket a vírusokat és visszafertőzzük a friss tenyészetet, most már egyre több vírusunk lesz, ami tartalmazza a génünket, de ezzel még nem vagyunk előrébb, mert fehérjét kéne belőle csinálni. Ennek érdekében olyan promótert rakunk elé, ami a vírus késői génjeinél kezd el működni. A korai gének a virális genom megkettőződéshez kellenek, a későiek meg vírus fehérjéit termelik. Ha a sejtünket akkor öljük meg, mikor már döglődik, mert készül benne a sok vírus, de még nem szabadultak ki, akkor lesz egy csomó olyan fehérjénk, amik nem tudtak beülni a víruskapszidba, mert nincs ott a helyük. A vírus fehérjékből vírus lesz, a mienk meg ott marad árván, az izolálásra várva. 49

50 Emlős expressziós rendszerek: A kísérletek során általában emlős géneket akarunk kifejezni, az ebből készített fehérjék pedig akkor hasonlítanak leginkább arra, amit akarunk, ha azt szintén emlős sejtben gyártatjuk. Így ezek megfelelő a glikozilációjúak, megfelelő diszulfidhidak, harmadlagos szerkezet, és foszriláltság jön létre. Hogy néz ki egy ilyen emlős vektor? Természetesen van rajta replikációs origó, továbbá van promóter/enhancer régió, terminátor szekvencia (ez a génexpresszió első lépésénél, a transzkripciónál fontos) és van benne egy ún. Kozak-szekvencia, ami a transzláció indításához kell; az emlősökben nem elég az ATG, hanem kell még egy G utána, sőt előtte hárommal A/G kell. Milyen sejteket használnak? Primer, vagy immortalizált sejtek: HELA, COS, HEK-293, stb. Milyen klónokat tudunk csinálni? Vannak tranziens sejtek, ezek esetében a bevitt plazmid nem integrálódni a genomba, nem szaporodik együtt a gazda sejttel, 1-2 nap alatt kikopnak belőlük, a stabil klónokba ezzel szemben integrálódik az általunk kívánt szekvencia. Transzfektálás: ld. 10. o. Szelekció: Antibiotikum rezisztencia, vagy az élesztőkhöz hasonlóan vannak olyan sejtvonalak, amik valamilyen enzimhiányosak (pl. timidin-kináz), ezt a hiányt az esetlegesen beült plazmidról tudják pótolni, különben életképtelenek maradnak. 50

51 Stabil klónok előállítása: Fogjuk a plazmidot, transzfektáljuk az emlős sejtbe, várunk pár napot, ezután lesz 1-2 sejt, aminek beül a genomjában, ezek (és az ebből képződő telepek) túlélik az ezt követő antibiotikumos kezelést. Ezt a rendszert be lehet gyorsítani a Gateway - módszerrel: a rekombinációs helyek helyére beültethető az én génem (zölddel), ehhez mellérakunk egy olyan plazmidot, amiben van egy integráz gén (Clonase 20, transzpozáz, vagy ehhez hasonló rekombinációt segítő enzimet kódol). Ennek segítségével az így keletkező plazmid teljes egészében integrálódni tud a genomba, méghozzá egy általunk meghatározott helyre. Emlősökben gyakori a CMV promóter, de vannak indukálhatók is, pl. valamilyen szteroid hormonnal, vagy ekdizonnal. Ez utóbbi a Drosophilákból már jól ismert rendszer, ezt átültették emlős sejtekbe, de nem pont ekdizont használnak, hanem egy ahhoz nagyon hasonló molekulát, a muriszteront. Kis átalakítással a lac-rendszert is tudták adaptálni, ebben az esetben ugyanúgy az IPTG az induktor. Az emlőssejtes rendszerek alapvetően hátránya, hogy a sejtek nagyon kevesen vannak, ezért alacsony az expresszió szintje. A transzgenikus állatokat igyekeztek úgy kialakítani, hogy ne kelljen levágni őket, ahhoz, hogy hozzájussunk a termeltetett fehérjéhez, ezért szövetkspecifikus promótert alkalmaztak, egészen konkrétan az emlőmirigyben (pl. a kazein promóter után tesszük be a fehérjénket), hogy a termék az állat tejébe választódjon ki. A megtermékenyített petesejtet beültetik az állatba, majd különböző hormonokkal álvemhességet idéznek elő, az utódokat pedig genomiális DNS alapján azonosítják, így képesek voltak 6 g/les tpa és 20g/l-es α1-proteáz inhibitor kiválasztást elérni a tejben. (A α1-proteáz inhibitor azért kell, hogy a hasnyálmirigyben termelődő tripszin rossz helyen aktiválódva ne eméssze meg magát a hasnyálmirigyet, vagy a vérben keringve mást se (heveny hasnyálmirigy-gyulladás).) 20 Invitrogen Life Technogies Thermo Fisher Scientific. 51

52 Sejtmentes expresszió: Ha az ember gyorsan akar valamit csinálni, nincs ideje arra, hogy szarozzon, állatokat klónozzon és azokat noszogassa, akkor sejtmentes expressziót tud készíteni. Fogom a DNS-darabomat, belerakom egy Eppendorfba, átírom róla az RNS-t, amiről majd átíródik a fehérje. Az ehhez szükséges cuccokhoz (enzimek, riboszómák), kibelezek egy sejtet (E. coli, búzacsíra, nyúl retikulocita) és beleöntöm az Eppendorf-csőbe. A módszer előnye, hogy baromi gyors, csak fel kell szaporítani a plazmidomat, aztán hozzáöntöm a boltban vett löttyöt, amiben van kreatin-foszfát (vagy E. coliban piruvát-kináz) (ATP-t csinál), aminosavak, ionok. Az ilyen kiteket arányárban mérik, de ha valamit gyorsan akarok vizsgálni, arra pont jó, terápiás célra nem, mert a glikoziláció nem tökéletes. Mutagenezis A mutagenezis célja az adott organizmus genetikai állományának megváltoztatása. A manipuláció után megvizsgálom milyen változások történtek, persze nem a DNS érdekel valójában, hanem a végén mindig a fehérjéket nézegetem. Régebben még csak random mutagenezis használtak valamilyen kémiai ágens vagy radioaktivitás segítségével. Manapság viszont az irányított mutagenezis a menő, aminek a három típusa van: deléciók, inszerciók és pontmutáció létrehozása. Egy pontmutációt úgy tudok létrehozni, hogy az adott DNS-szakasznak leszedem az egyik szálát, kinézem azt a nukleotidot, amit meg akarok változtatni és olyan primert tervezek a körzetére, ami tökéletesen illeszkedik, kivéve ezt az egy helyet. Ezt a plazmidot berakom egy baciba, ahol a szálak külön másolódnak, amelyikben benne van a mutáció, az most már a hozzáillő párt kap (a képen A helyett C-t). Ezzel a módszerrel a plazmidoknak csak a fele lesz mutáns, ami nem túl jó hozam, ennek az aránynak a javítására, azonban vannak különböző lehetőségek. 52

53 Kunkel-módszer: A mutálni kívánt DNS-szakaszt egy plazmidba ültetjük, amit aztán egy olyan E. coliba transzformálunk, aminek két hibajavító enzime a dutp-áz (dut) és az uracil-deglikozidáz (ung) is hiányzik/hibás. Az előbbi a dutp-t bontja el, ha véletlenül keletkezne, az utóbbi pedig levágja a DNS-be tévedésből beépült uracilt. Az ilyen E. coli olyan másolatokat fog csinálni, ami tele van U-val, egyszálúsítás után ez lesz a mutagenezis templátja. Összeöntöm a mutációt tartalmazó primerrel, kiegészítés után a paralel szál már nem fog U-t tartalmazni, ezt kihasználva most egy egészséges E. coliba transzformáljuk, ahol a hibajavító mechanizmus lebontja U-kat tartalmazó szálat és kiegészíti a mutánst. PCR-alapú teljes plazmid mutagenezis (Wikipedián: Whole plasmid mutagenesis): Ez egy másik lehetőség: Metilált plazmidot izolálva és szétválasztva tervezek rá két primert, mindkettőben ugyanazzal a mutációval (persze ugyanaz a mutáció, ha a kódoló szálon A, akkor a kiegészítő szálon T). A PCR-ezés csőben zajlik, itt nem metilálódnak a termékek, az eredeti egyik vagy mindkét szálon metilezett szálakból viszonylag kevés marad. Ezután hozzáadok DpnI-et (restrikciós enzim), ami csak a metiláltakat hasítja el, és békén hagyja azokat, amiket én akartam előállítani. A szétvágott plazmidok több nagyságrenddel nehezebben transzformálódnak, mint az ép, cirkulárisak. 53

54 A harmadik módszer egy restrikciós hasítóhely tönkretételén alapul. Két primert tervezek, egyet oda ahol a mutációt létre akarom hozni, a másikat valahova ahol szintén egy pontmutációval elrontok egy r.e. hasítóhelyet. Ha már beült az egyik primerem, az meg gátolja a komplementer szál visszatapadását, ezért jó eséllyel feltételezhetem, hogy a másik primerem is képes bekötődni a helyére, tehát ha az egyik mutáció létrejött, akkor valószínűleg a másik is. Az újonnan készült szál tehát tartalmazza az általam kitalált mutációt és egy elrontott r.e. hasítóhelyet. Az enzimes kezelés után elvágódnak azok a plazmidok, amibe a primerek helyett a komplementer szál kötődött be (megmaradt az ép hasítóhely), és megmaradnak cirkulárisnak a mutáns plazmidok. Ezután transzformáljuk az egészet E. coliba és szaporítjuk őket. A beültetettek még tartalmaznak vad típusokat és mutánsokat is, de az biztos, hogy izolálás után feleseket (kívül sárga, belül fekete) nem, mert szaporodáskor a szálak külön másolódnak, ezért utána csak teljesen sárga és teljesen fekete lesz. Végül tehát leszedjük az összes telepet, plazmidot izolálunk és az egész poolt másodszorra is megemésztjük, a mutánsok továbbra is épek maradnak, tisztítjuk őket, aztán visszaültethetjük a baciba, hogy már tényleg csak ezeket másolja. Megaprimeres PCR: Mint minden mást, természetesen pontmutációt is PCR-rel a legegyszerűbb előállítani. A kétlépéses PCR első részében tervezünk két primert a szakaszra, az egyik primer a közepén tartalmazza a mutációt (M), a másik meg a végéhez kapcsolódik (A). Az elkészült szakaszt megaprimernek hívjuk, ezt megtisztítva a második PCR-szakaszban hozzáadom ezt a megaprimert és tervezek az eredeti szálam másik felére egy B-primert. Ennek a reakciónak egy ugyanakkora szál lesz a terméke, mint amivel elkezdtem az egészet, csak mindkét szálában benne lesz a kívánt pontmutáció. 54

55 Egyszerűnek hangzik a módszer, de a megvalósítása nehézkes, mert a megaprimer Tm-je nagyon magas, ha meg a fragmentnek nagyon a közepére kéne a mutáció, akkor meg egyáltalán nem használható. A tisztítást ki lehet hagyni, azzal a trükkel, hogy a B-primert a megaprimerhez hasonlóan nagyméretűre tervezem, így baromira fel kell fűteni a rendszert, itt viszont az első reakcióból megmaradó A és M primer nem tud semmit csinálni, Tm-jük sokkal alacsonyabb, nem tapadnak be (vagy felfűtés során betapadnak, de aztán rögtön, mikor emelkedik a hőmérséklet, akkor le is esnek). Ha a DNS-szakaszom közepére kéne a mutáció, arra is van megoldás (a): Ehhez szintén két PCR szükséges, az elsőnél tervezek az egyik végre egy a -primert, a közepére meg egy a mutációt tartalmazó b -primert, meg ezek komplementer részeire c -t és d -t is (ld. ábra). A reakció után hővel széttekerem a termékeket, amik a b=c szakaszban megegyeznek, és ritka esetben, emiatt az átfedés miatt kialakul AB-CD kapcsolódás. Az a - és a d -primert hozzáadva felerősíthetjük a mutáns szálunkat, amit aztán plazmidba tehetünk és az expresszáltatás után megnézhetjük, miben változott a fehérje. A fenti elv alapján nem csak mutációt lehet generálni, hanem kimérákat is készíthetünk (b). Mivel a házasítani kívánt szálakban nincs közös szakasz, ezt nekünk kell hozzáadni a már jól ismert 5 -véges toldásokkal, ezután ugyanaz az egész, mint az előbb. 55

56 Deléciók generálása: Akkor kell, ha pl. meg akarom tudni, hogy egy adott DNS-szakasznak mi a funkciója és mekkora az szakasz, ami még feltétlenül szükséges ahhoz, hogy ellássa a funkcióját (pl. promóterek esetében). Bal31- vagy ExoIII- és S1-nukleázokkal emésztjük (a végéről eszegetnek le), ezek statisztikussága miatt sokféle hosszúságú termékünk lesz, amiket újra össze lehet kapcsolni karikába. Ennek a módszernek az a hátránya, hogy ezeket a lecsökkentet plazmidokat mind be kell ültetni, és felnevelni a bacikat, ahhoz, hogy tudjam, hogy mi történt. Van egy jobb módszer is, amit manapság gyakrabban használnak: Ha arra vagyok kíváncsi, hogy mit okoz a B-szakasz hiánya, akkor tervezek egy olyan primert, ami az A-hoz és a C-hez kapcsolódik, ettől a B-szakasz kitüremkedik. Ezután ráeresztek egy olyan restrikciós endonukleázt, ami vág egy nick-et abba a szálba, amin a hurok van. A hibajavító enzimek felismerik a lyukat, ezt látva azt hiszik, hogy ez az a szál, ami éppen átíródott, ezért rajta keresik a hibát; az ExoIII le vágja ezt a loop-ot (és a környékét is, amit aztán a DNS-polimeráz visszapótol). 56

57 Génkiütés állatokban (egérben): Ha egy génnek vizsgálni akarjuk a funkcióját, annak egy jó módszere a génkiütés: megnézzük, hogy mit okoz a hiánya. A vizsgált génünket kicseréljük (valamekkora hatékonysággal) egy olyan szakaszra, ami neomicin-rezisztenciát tartalmaz. Kiszedjük az egér blasztocisztáját, amiből pedig az őssejteket és rögzítjük őket, aztán nyakon öntjük neomicinnel és az ezt túlélőket fogjuk tovább szaporítani, majd visszaültetjük egy másik egér blasztocisztájába. Az így kinövő egerek kimérák lesznek, a testük egyes részei az eredeti őssejtekből alakulnak ki, míg mások a génkiütöttekből; akkor van szerencsénk, ha az ivarsejt ez utóbbiból lesz. Ha az ilyen testvéreket egymás közt szaporítjuk, akkor minden negyedik egér lesz génkiütött (knock-out), vagyis olyan, aminek mindkét kromoszómáján a génkiütött változat van. A módszernek vannak nehézségei is, például vannak létfontosságú gének, ha ezeket kiütjük, abból nem tudunk állatot felnevelni (letális mutáció). Ilyen esetben csak az embriót tudjuk vizsgálni vagy ún. kondicionális mutánsokat hozunk létre, ebben az esetben nem a szó szoros értelmében ütjük ki a gént, hanem beültetünk egy másikat, ami valahogy legátolja az általunk vizsgált gént (vagy a róla képződött RNS-t vagy a fehérjét), ezt pedig csak indukáljuk, amikor mi akarjuk, pl. szerv- vagy kajaspecifikus promóterekkel. Vannak továbbá olyan gének is, amik nehezen kiüthetők, pl. heterokromatin tartalma (szorosan csomagolt, hozzáférhetetlen DNS-csomag), kiterjedten metiláltak (szintén nehezíti a rekombinációt), repetitív szekvenciák [a rekomb. alapját képező homológ régiók (fenti ábrán sárga négyzetek), ha máshol is megtalálhatók, akkor lehet, hogy oda épül be]. A harmadik problémakört az jelenti, ha a génkiütésnek nincs, vagy más a hatása egérben. Bár az egér nagyon hasonlít ránk, nem tudunk az egérkísérletek eredményeiből egyértelműen következtetni emberre, semmi nem garantálja, hogy az a génkiütés ugyanúgy fog működni. 57

58 Géncsendesítés: A génkifejeződés szabályozásának egyik lehetősége az ún. géncsendesítés (silencing). sirns képződés (small interfering RNA): A DNS-ről átíródott pre-mirns bizonyos enzimek hatására hajtűt képez (így lesz kettős szálú része). A sejtmagból kijutva ezt egy specifikus endoribonukleáz (Dicer) felismeri, és kis darabokra hasítja, amiket sirns-eknek hívunk. Ezekhez a kétszálú nukleotidos darabkákhoz hozzákapcsolódik egy fehérjekomplexhez (RISC=RNA-induced silencing complex), melynek része az argonauta, ez a kupac ATP segítségével aktiválódik és az sirns egyik szálát elemészti. A megmaradó száldarabkát megtartja magának és össze-vissza úszkálva mutogatja, hátha talál egy azzal homológ mrns részletet. Ha talál megfelelő célszekvenciákat, akkor hozzákapcsolódik és az mrns-t darabokra hasítja, nem fog már átfordítódni, nem képződik róla fehérje. (Aztán folytatja tovább a vadászatot.) (a két ábrán ugyanaz van) Másik lehetőség a géncsendesítésre mirns-eken (microrna) keresztül történik. A RISC az előzőhöz hasonlóan képződik, kapcsolódik hozzá a cél mrns-hez, de nem vágja el, hanem rajta marad és megakadályozza a transzlációt (a kettős szál elakad a riboszómában). Előző esetben tehát az RNS tényleges feldarabolódás történt, itt pedig a cél az RNS-nek az inaktiválódása. 58

59 RNS-alapú RNS interferencia: Kétszálú RNS-t veszek a közértben, bejuttatom a sejtbe és várom, hogy hasson: gyors, könnyű és olcsó, viszont a sejt azt hiszi, hogy egy RNS-vírus került bele, ezért az RN-ázával úgy megemészti, hogy arról koldul (ennek kiküszöbölésére rengeteget kell belelapátolni, ami viszont lehet, hogy már megárt a sejtnek). Ha gazdag a főnök, akkor kérek tőle pénzt módosított dsrns-re, aminek egy kicsit módosítottak a bázispárjai, ettől ugyan pontosan tud párosodni, de jobban ellenáll az RN-ázos bontásnak. DNS-alapú RNS interferencia: DNS-t ültetek be egy vektorral (pl. plazmiddal), így ha ez beül a genomba, akkor stabil vonalakat tudok létrehozni. Kétféle promótert használok; az RNSpolimeráz II által hajtott az szövetspecifikus, jobb esély a sikerre, míg az RNS-polimeráz III által hajtott nagyon erős, ez a riboszómális és transzfer RNS géneket írja át folyamatosan, kevéssé reguláltan. Az egész interferencia hatása több dologtól is függ: Az interferencia hatása lehet nagyon késleltetett is, mert a módszer nem távolítja el a már elkészült fehérjéket, amíg ezek le nem bomlanak (protein féléletidő), addig hiába nem íródik át új, a kiütés hatását lehet, hogy csak napok múlva látjuk. A transzfekció hatékonysága is lényeges, hiszen ha nem jut be sirns/plazmid, vagy kevés jut be, akkor kisebb hatást váltanak ki, az egyes sejtek közt nagy a szórás. Kritikus kérdés, hogy milyen legyen az az sirns, amit beültetek, mert nem biztos, hogy az argonauta felismeri. Vannak programok, amik segítenek a tervezésben, vagy ha szerencsém van, akkor már valaki előttem csinálta ugyanazt, és akkor tudom, hogy milyen sirns-t célszerű alkalmazni az adott gén ellen. Ha nem tudom melyik sirns lenne jó, akkor csinálhatom azt is, hogy többet rendelek, nyakon öntöm a pácienseket az egész pool-lal, aztán ha jó valamelyik, akkor több csoportra szedem a halmazt és megkeresem melyik(ek) volt(ak) jó(k). Egy ilyen kísérletnél folyamatos kontroll kell: A transzfektálás sikerességét a plazmidban lévő GFP igazolhatja: amelyik sejt nem világít zölden, abban nem is kell várni, hogy csökken valamilyen fehérje mennyisége. Mindig kell olyan sejtvonal, amibe nem tettem, és olyan is, amibe random tettem RNS-t, hiszen a specifikusságot is ellenőrizni kell. A negatív kontrollhoz tehát egy másik sejtbe beteszek egy scramble sirns-t, ami nem specifikus arra az RNS-re, amit ki akarok ütni. Pozitív kontroll: egy már ismert, korábbi tapasztalatok alapján működő sirns-t juttatok be: ha ez nem ad eredményt, akkor a kísérleti körülményeim rosszak. Northern-blottal és qpcr-rel (real-time) tudom vizsgálni, hogy sikerült-e kiütni a gént, a fehérjéket meg Western-blottal. 59

60 Hogyan tervezem meg a plazmidot? Választok neki egy promóter: nagyon gyakori az U6 és a H1 (ezek RNS-polimeráz III által hajtottak). Ezután a számítógép megmondja, hogy melyik a legjobb hely, ahova tervezzem az sirns-t. A két antiparalell szakasz között van a loop, amit felismer a Dicer, ez egy konszenzus szekvencia. Úgy kell tehát megtervezni, hogy: egyik szál sora, aztán loop-szekvencia, aztán a másik szál sora, ami az első sor komplementerei visszafele olvasva. Antibiotikum rezisztencia azért kell a plazmidba (KanaR), mert ezt először baktériumba ültetjük be, felszaporítjuk, utána kerül eukariótába. Ott van még rajta a GFP-szakasz, előtte egy citomegalovírus promóterrel (RNS-polimeráz II-es). 60

61 Fehérjekimutatás Antitestek: Az antitestek termeltetése érdekében az adott állatba (pl. nyúl, kecske, egér) komplett Freud-adjuvánst nyomnak. Ez egy olajos emulzió, benne a fehérjével, ami ellen antitest kellene, ezt az állat bőre alá juttatják, hogy ne vigye el a véráram azonnal. Ebbe az első injekcióba tesznek mycobacter darabkákat is, ami felpiszkálja az állat immunrendszerét. Az immunizálás után várnak egy hetet és jöhet a második szuri, ebbe már nincs mycobacter. Néha vért vesznek tőle, és ha már elég magas az antitest titer, akkor levágjak az állatot és véralvadásgátlót adnak hozzá. Míg a nyúl poliklonális antitesteket termel, addig az egérrel lehet monoklonális antitestet csináltatni; ehhez sejtekre kell szedni a lépét, amit fuzionáltatnak egy rákos sejtet. Míg a poliklonális antitestek különböző epitópokat ismernek fel, a monoklonális antitestek egyetlen epitópra specifikusak. Gazdaságossági szempontból gyártanak ún. másodlagos antitesteket is. Az elsődleges antitest tapad a fehérjéhez, a másodlagos pedig az elsődlegeshez, ez azért jó, mert ezeket a másodlagos antitesteket meg szokták jelölni például egy fény- vagy színreakciót adó enzimmel, hogy lássuk az elsődlegeseket. Azért gazdaságos, mert elsődleges antitestből van egy csomó, ezeket közvetlenül megjelölni csak akkor éri meg, ha nagyon sok fogy belőle, viszont másodlagos antitestből csak annyiféle van a boltban, ahány állat, mert állaton belül már nem specifikus, hozzátapad mindenhez. Aptamerek: A 90-es években fedezték fel, hogy egy adott fehérjéhez hozzá tud tapadni egy tőle független DNS/RNS-szekvencia (tehát nem csak úgy, mint a promóterek esetében), ha azok pont összeillenek. Gyakorlata: Fogják a fehéréjét, üveggyöngyökhöz kötve beleteszik egy kémcsőbe, mellé pedig ismert 3 és 5 -végű, de a közepén rengeteg féle különböző nukleotid sorrendű DNS-darabot öntenek. Különböző fehérjékhez különböző DNS-ek kötődnek többé-kevésbé specifikusan. Mosás után PCR-ezem amik ott maradtak, utána újra ráöntjük, de most egy kicsit erősebb szerrel mossuk, így egy idő után csak a legspecifikusabb marad. Ezt a DNSszakaszt fluoreszcensen jelölve mérhető a fehérje mennyisége, de használható terápiás célokra is: csinálnak egy fúziós aptamert, aminek az egyik karja hozzáköt a sejt receptorához, a másik karjára pedig rakhatnak egy gyógyszermolekulát. Az aptamerek felhasználása hasonló az antitestekhez, de előnye, hogy nem keltenek immunválaszt az emberekben. Peptidekből is csinálhatnak aptamereket, ezek random aminosavból állnak (sokkal kisebbek, mint egy antitest), de még nem igazán használják. 61

62 A Western blot fehérjék kimutatására használatos. Fogjuk a fehérjét, megfuttatjuk PA-gélen, ráteszünk egy nitrocellulóz-membránt, vagy ami sokkal jobb: PVDF 21 -membránt és elektromos árammal átszívatjuk. Fontos, hogy míg a nitrocellulózt vízzel kell nedvesíteni, a PVDFet metanollal/etanollal! Az antitestek szintén fehérjék, ugyanúgy ahol érik, hozzátapadnának a membránhoz, ezért a blokkolás itt is szükséges, mint a Southern és Nortnern blotnál a prehibridizáció. Ehhez alacsony zsírtartalmú zsírtalan tejpor 5%-os TBS-oldatát 22 használják. A detektáláshoz ráeresztem az antitesteket vagy aptamereket, amik 1 óra - overnight alatt leszorítják a tejport onnan, ahova specifikusan kötődnek. Mosás után ráöntöm a másodlagos antitesteket, aztán megint mosom, jó alaposan, mert ha nagy marad a háttér, akkor nem látni benne még a nagy jelet sem. A jelölt másodlagos antitestek nem radioaktívak, hanem fényvagy színreakciót adnak; beleteszem egy kis tálkába a lapot, rá a röntgen(?)-filmet és berakom a sötétszobába, ahol a film sötétre színeződik. Mivel nem tudni előre, hogy mennyire lesz intenzív a reakció, szokás több különböző expozíciós idejű felvételt is készíteni. Részletesebb, jobb folyamatábra: >> Wikipedia << Az előkészítés során fontos, hogy a fehérjét ne menjen tönkre, ezért proteáz-inhibitorokat használunk, valamint SDS-t, hogy kitekerje őket a futtatáshoz, továbbá DTT-t, hogy redukálja a kénhidakat. Loadolás előtt vegyünk mintát a sejtlizátumból és mérjük meg az összfehérjekoncentrációt, hogy tudjuk mihez viszonyítani a Western blottal mért fehérjénk mennyiségét! ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): Hasonlít a dot-blotra, itt már tudjuk, hogy melyik az az egy fehérje, amit vizsgálni akarunk, és most már arra vagyunk kíváncsiak, hogy mennyi van belőle. A plate welljeinek az alján kötött antitestek vannak (legalábbis a szendvics- 21 Polivinilidén-difluorid 22 Tris-buffered saline = Tris + NaCl 62

63 ELISA esetében), ezekbe a lyukakba öntjük bele a mintákat, különböző hígításokkal. Egy bizonyos idő után kimossuk a welleket és hozzáadjuk a másodlagos antitesteket, ami a fény- vagy színreakciót fogja produkálni, melynek intenzitása a fehérjénk mennyiségével lesz arányos. A különböző hígítások ahhoz kellenek, hogy beletaláljunk a közel lineáris szakaszba. Fehérje interakciók Hogyan mutatunk ki fehérje-kapcsolatokat? Van egy fehérjém, szeretném tudni, hogy mihez köt hozzá, vannak sejtéseim, de nem tudom pontosan. Mit csinálok? Beültetem a fehérje génjét egy plazmidba és expresszáltatom valamilyen fúziós tag-gel együtt. Pl. GST-t, ami rákapcsolódik egy agaróz gyöngyöcskére kötött glutationra, ez lesz a csali. A baci belét tehát Laemmli-pufferben 23 hozzáöntöm a ligandos hordozókhoz, utána sokszor lemosom pufferrel és lecentrifugálom, hogy a gyöngyök leüljenek a cső aljára (ha csőben csinálom). Ezután ráöntöm azt a lizátumot, amit vizsgálni akarok, és megvárom, hátha valamilyen fehérje ráharap a belógatott csalira. SDS-es mosogatás után megfuttatom: ha egy csík lesz, akkor az csak a tag-elt fehérjénk. Ha van még egy csík, és sejtjük mi az, akkor hozzárakunk egy jelölt antitestet, ha nem, akkor ki kell vágni, és el kell küldeni szekvenáltatni. 23 Nevét Ulrich K. Laemmli svájci kutatóról kapta, tartalmaz SDS-t, Tris-t, 2-merkaptoetanolt, glicerint. 63

64 Immunoprecipitáció: Ez tulajdonképpen egy feljavított Western blot, akkor szükséges, ha a mintámban olyan nagyon híg a vizsgált fehérje, hogy nem férne bele elég az SDS-PAGE welljébe, ahhoz, hogy lássak valamit belőle (pl. az ábrán a piros golyó). Az Y-alakú IgG talpát Fc-nek (fragment crystallizable) hívják, ehhez tud tapadni a protein-a vagy a protein-g, ezeket gyöngyhöz kötve ki tudjuk halászni az antigén-antitest párokat, mert centrifugálás után leülnek a cső aljára (vagy az ábra szerint lehet, hogy gyöngy nélkül is egyszerűen csak oldhatatlanná teszi). Ko-immunoprecipitáció: Ez nem betöményítésre, hanem protein-protein interakciók kimutatására való, ugyanarra jó, mint a fúziós fehérjés, de ez inkább közelebb van az in vivo kategóriához, mert a minta közvetlen sejtlizátum. A sejteket úgy lizálom, hogy óvatosan bánok az SDS-sel, hogy ne tegye tönkre a fehérjekomplexet. Az antitesteket overnight hozzákötöm a gyantához, belerakom egy emlőssejtlizátumba és azt várom, hogy az a fehérje, ami ellen az antitestem van, az egy komplexben van más fehérjékkel. SDS-PAGE futtatás után kiderül milyen darabokból állt a komplex. 64