INSULINUM HUMANUM. Humán inzulin

Átírás

1 01/2011:0838 INSULINUM HUMANUM Humán inzulin C 257 H 383 N 65 O 77 S 6 M r 5808 DEFINÍCIÓ A humán inzulin az emberi hasnyálmirigy által termelt, antidiabetikus hatású hormon szerkezetével megegyező szerkezetű, kétláncú peptid. Tartalom: 95,0 105,0% humán inzulin (C 257 H 383 N 65 O 77 S 6 ) és A21 dezamido humán inzulin (szárított anyagra). Megállapodás szerint az inzulin készítmények feliratozásához 0,0347 mg humán inzulin 1 NE inzulinnal egyenértékű. ELŐÁLLÍTÁS A humán inzulint sertés hasnyálmirigyből nyert inzulinból állítják elő, enzimes átalakítással és megfelelő tisztítási eljárással, vagy rekombináns DNS (rdns) technológián alapuló módszert alkalmaznak. A humán inzulin előállításához felhasznált állatoknak adott esetben meg kell felelniük az emberi fogyasztásra alkalmas állatokra vonatkozó követelményeknek. A humán inzulin gyártásának körülményeit úgy kell kialakítani, hogy a mikrobiológiai szennyeződés kockázata a lehető legkisebb legyen. A sertés hasnyálmirigyből enzimes átalakítással nyert humán inzulin gyártási eljárását validálni kell annak bizonyítására, hogy a termék maradék fehérjebontó aktivitását megszüntették. Az illetékes hatóság további vizsgálatokat írhat elő. Az rdns technológiával gyártott humán inzulin tételek felszabadítása előtt a letöltés előtti végtermék minden egyes gyártási tételével el kell végezni a következő vizsgálatokat, hacsak az illetékes hatóság ez alól felmentést nem ad. Gazdasejt eredetű fehérjék. A határértéket az illetékes hatóság állapítja meg.

2 Egyláncú prekurzor. A határértéket az illetékes hatóság állapítja meg. Megfelelően érzékeny módszert alkalmazunk. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér por. Oldékonyság: vízben és etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik. Híg ásványi savakban oldódik; híg alkálilúgok bomlás közben oldják. AZONOSÍTÁS A. A Tartalmi meghatározás pont szerint nyert kromatogramokat értékeljük. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján látható főcsúcs retenciós idejét tekintve egyezzék meg az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúccsal. B. Peptidtérkép-vizsgálat (2.2.55). A PEPTIDKÖTÉSEK SZELEKTÍV HASÍTÁSA Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 2,0 mg/ml töménységű oldatot készítünk, és ennek 500 µl-ét tiszta kémcsőbe mérjük. Az oldathoz R HEPES tompítóoldat (ph 7,5) 2,0 ml-ét és R Staphylococcus aureus (V8 törzs)-proteáz 1 mg/ml töménységű oldatának 400 µl-ét mérjük. A kémcsövet lezárjuk, és 6 órán át 25 C-on tartjuk. A reakciót 2,9 ml R szulfát tompítóoldat (ph 2,0) hozzáadásával állítjuk le. Összehasonlító oldat. A vizsgálati oldattal egyidejűleg és azonos módon készítjük, de a vizsgálandó anyag helyett CRS humán inzulint használunk. KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oszlop: méretei: l = 0,10 m, Ø = 4,6 mm, állófázis: 8 nm pórusméretű, R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagél (3 µm); hőmérséklet: 40 C. Mozgófázis: A-mozgófázis: 100 ml R kromatográfiás célra szánt acetonitrilhez 200 ml R szulfát tompítóoldatot (ph 2,0) és 700 ml R vizet elegyítünk; az elegyet szűrjük és gázmentesítjük, B-mozgófázis: 200 ml R szulfát tompítóoldathoz (ph 2,0), 400 ml R kromatográfiás célra szánt acetonitrilt és 400 ml R vizet elegyítünk; az elegyet szűrjük és gázmentesítjük. Idő (perc) A-mozgófázis B-mozgófázis Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Egyensúly beállítása: legalább 15 percen át a kezdeti körülményeket alkalmazzuk. Üres kísérletet is végzünk, a fent megadott gradiens alkalmazásával. Injektálás: 50 µl.

3 Rendszeralkalmasság: a vizsgálati oldat és az összehasonlító oldat kromatogramja minőségileg egyezzék meg a humán inzulin-hidrolizátumnak a CRS humán inzulinhoz mellékelt kromatogramjával, az összehasonlító oldat kromatogramján azonosítjuk az I., II. és III. hidrolizátumfragmensek csúcsait: szimmetriafaktor: legfeljebb 1,5, a II. és III. fragmens csúcsaira vonatkoztatva, csúcsfelbontás: legalább 3,4, a II. és a III. fragmens között. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramjának profilja egyezzék meg az összehasonlító oldat kromatogramjának profiljával. MEGJEGYZÉS: az I. fragmens retenciós ideje sertés inzulin és humán inzulin esetében azonos. A II., illetve a IV. fragmens retenciós ideje minden inzulinra azonos. A III. fragmens retenciós ideje szarvasmarha inzulin és sertés inzulin esetében azonos. VIZSGÁLATOK Az inzulinnál nagyobb molekulatömegű szennyezők. Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval 4 mg/ml töménységű oldatot készítünk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. Olyan inzulin-oldat (kb. 4 mg/ml), amely 0,4%-nál több nagy molekulatömegű fehérjét tartalmaz. Használhatunk e célra a jelzett %-ban nagy molekulatömegű fehérjét tartalmazó injektálható inzulin készítményt, amely lehet akár oldat, akár szuszpenzió formájú (utóbbiból a szükséges mennyiségű 6 M sósavval tiszta oldatot készítünk), de használhatunk inzulinból 0,01 M sósavval készített oldatot is. A nagy molekulatömegű fehérjét a jelzett %-ban tartalmazó inzulint por alakú inzulin szobahőmérsékleten kb. 10 napig történő tárolásával állíthatjuk elő. Az oldatot 2 8 C-on tartjuk és 7 napon belül felhasználjuk. Amennyiben automata injektort használunk, ennek hőmérsékletét 2 8 C-on tartjuk. Oszlop: méretei: l = 0,3 m, = legalább 7,5 mm, állófázis: 12 12,5 nm pórusméretű R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagél (5 10 µm), amely alkalmas az inzulin monomer elválasztására a dimertől és polimerektől. Mozgófázis: R tömény ecetsavat (15 térfogatrész) és R acetonitrillel (20 térfogatrész) R arginin 1,0 g/l töménységű oldatával (65 térfogatrész) elegyítünk; az elegyet szűrjük és gázmentesítjük. Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 276 nm-en. Egyensúly beállítása: mielőtt egy új oszlopot kromatográfiás elemzés céljára használunk, nagy molekulatömegű fehérjét tartalmazó inzulin-oldat ismételt injektálásával beállítjuk az oszlop egyensúlyát. Ezt megtehetjük a csúcsfelbontás-ellenőrző oldat legalább háromszori injektálásával. Az oszlop akkor tekinthető egyensúlyban lévőnek, ha két egymást követő injektálás eredménye ismételhető. Injektálás: 100 μl. Kromatografálási idő: kb. 35 perc. Retenciós idő: polimer inzulin komplexek perc; kovalens inzulin dimer kb. 17,5 perc; inzulin monomer kb. 20 perc; sók kb. 22 perc.

4 Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás-ellenőrző oldat: hegy-völgy arány: legalább 2,0, ahol H p a dimer alapvonaltól mért csúcsmagassága, és H v ezt a csúcsot a monomer csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának alapvonaltól mért távolsága. Követelmények: a főcsúcsénál kisebb retenciós idejű csúcsok összterülete nem lehet nagyobb, mint a csúcsok összterületének 1,0%-a. Azokat a csúcsokat, amelyeknek retenciós ideje nagyobb, mint az inzulin-csúcs retenciós ideje, nem vesszük figyelembe. Rokon fehérjék. Folyadékkromatográfia (2.2.29), a Tartalmi meghatározás pontban leírtak szerint, az alábbi elúciós körülmények között: Idő A-mozgófázis B-mozgófázis (perc) Az oldatokat 2 8 C között tároljuk, és 24 órán belül felhasználjuk. A csúcsfelbontás és a linearitás ellenőrzése céljából a Tartalmi meghatározás pontban előírt rendszeralkalmassági vizsgálatot végezzük el. Amennyiben szükséges, az A21 dezamido sertés inzulinnak a gradiens indítását megelőző teljes elúciója érdekében változtathatunk a mozgófázisok arányán. Annak érdekében, hogy valamennyi, inzulinnal rokon szennyező teljes elúcióját biztosítsuk, a gradiensprofilt is módosíthatjuk. 20 µl a) összehasonlító oldatot, 20 µl b) összehasonlító oldatot, 20 µl c) összehasonlító oldatot és 20 µl vizsgálati oldatot injektálunk. Az injektált térfogatot szükség esetén a Tartalmi meghatározás pontban leírt linearitás vizsgálat eredményeivel összhangban 10 és 20 µl közötti értékre is beállíthatjuk. A kromatogramok felvételét kb. 50 percig folytatjuk. Az a) összehasonlító oldat kromatogramján az A21 dezamido humán inzulin kis csúcsként jelenik meg a főcsúcs után, kb. 1,3 relatív retencióval a főcsúcshoz képest. A vizsgálati oldat kromatogramján az A21 dezamido humán inzulin csúcsterülete nem haladhatja meg a csúcsok összterületének 2,0%-át; a humán inzulin és az A21 dezamido humán inzulin csúcsától eltekintve, a többi csúcs területének összege nem lehet nagyobb, mint az összes csúcs területének 2,0%-a. Kizárólag félszintetikus humán inzulin esetében: a vizsgálati oldat kromatogramján, a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcsnak megfelelő csúcs területe nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján a megfelelő csúcs területe (1,0% sertés inzulin a humán inzulinban). A következő vizsgálat kizárólag a sertés inzulinból enzimes átalakítással előállított humán inzulinra vonatkozik: Proinzulin-szerű immunreaktivitás (Proinsulin-like immunoreactivity PLI): legfeljebb 10 ppm, szárított anyagra vonatkoztatva. A meghatározáshoz kellően érzékeny immunkémiai módszert (pl. radioimmunvizsgálatot) használunk (2.7.1). A módszer kalibrálásához a sertés proinzulin Nemzetközi Referencia Reagenst használjuk. Cink: legfeljebb 1,0% (szárított anyagra). Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, I. Módszer). Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot 0,01 M sósavval 25,0 ml-re oldunk. A megfelelő koncentráció (0,4 1,6 µg/ml cink) eléréséhez az oldatot szükség szerint 0,01 M sósavval hígítjuk. Összehasonlító oldatok. 0,40 µg/ml, 0,80 µg/ml, 1,00 µg/ml, 1,20 µg/ml és 1,60 µg/ml cinket tartalmazó oldatokat használunk, amelyeket R cink mértékoldatból (5 mg/ml Zn), 0,01 M sósavval hígítva, frissen készítünk. Fényforrás: cink vájtkatód lámpa. Hullámhossz: 213,9 nm.

5 Atomizáló egység: megfelelő összetételű levegő-acetilén láng (például percenként 11 liter levegő és 2 liter acetilén). Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 10,0%. 0,200 g anyagot szárítószekrényben 105 C-on, 24 órán keresztül szárítunk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 2,5%, szárított anyagra vonatkoztatva. 0,200 g anyagot vizsgálunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 10 NE/mg. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást feleljen meg e vizsgálat követelményének is. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 40,0 mg vizsgálandó anyagot 0,01 M sósavval 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). CRS humán inzulin egy injekciós üvegének tartalmát annyi 0,01 M sósavban oldjuk, hogy 4,0 mg/ml töménységű oldatot kapjunk. Összehasonlító oldat (b). CRS sertés inzulin egy injekciós üvegének tartalmát annyi 0,01 M sósavban oldjuk, hogy 4,0 mg/ml töménységű oldatot kapjunk. Összehasonlító oldat (c). 1,0 ml b) összehasonlító oldatot 0,01 M sósavval 50,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-éhez 1,0 ml a) összehasonlító oldatot adunk. Összehasonlító oldat (d). 1,0 ml a) összehasonlító oldatot 0,01 M sósavval 10,0 ml-re hígítunk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. 1,0 ml a) összehasonlító oldatot 1,0 ml b) összehasonlító oldattal elegyítünk. Az oldatokat 2 8 C-on tároljuk és 48 órán belül felhasználjuk. Ha automatikus injektort használunk, annak hőmérsékletét is 2 8 C-on tartjuk. Oszlop: méretei: l = 0,25 m, = 4,6 mm, állófázis: R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagél (5 µm) hőmérséklet: 40 C. Mozgófázis: 42 térfogatrész A-mozgófázist és 58 térfogatrész B-mozgófázist elegyítünk. Szükség esetén módosítjuk az elegy összetételét. A következő oldatokat legalább 20 C-on készítjük, és tároljuk: A-mozgófázis: 28,4 g R vízmentes nátrium-szulfátot R vízzel 1000 ml-re oldunk; az oldathoz 2,7 ml R tömény foszforsavat mérünk; ha szükséges, az oldat ph-ját R etanolaminnal 2,3-re állítjuk be. Az oldatot szűrjük és gázmentesítjük. B-mozgófázis: 550 ml A-mozgófázist és 450 ml R acetonitrilt elegyítünk. A csapadékképződés elkerülésére (az A-mozgófázis acetonitrillel történő elegyítése endoterm folyamat) az oldatot 20 C-nál magasabb hőmérsékletűre melegítjük. Az oldatot szűrjük és gázmentesítjük. Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás: a csúcsfelbontás-ellenőrző oldatból és a b) összehasonlító oldatból μl-t injektálunk. A csúcsfelbontás-ellenőrző oldat kromatografálását addig folytatjuk, amíg a b)

6 összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcsnak megfelelő csúcs egyértelműen láthatóvá nem válik. A csúcsfelbontás-ellenőrző oldat kromatogramján azonosítjuk a sertés inzulinnak és a humán inzulinnak megfelelő csúcsokat. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a sertés inzulin és humán inzulin közti csúcsfelbontás legalább 1,2. A megfelelő elválás elérése érdekében, szükség esetén módosítjuk a mozgófázis acetonitriltartalmát. linearitás: az a) és a d) összehasonlító oldatból μl-t injektálunk. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe a d) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 10±0,5-szerese. Amennyiben az arány más, az injektált térfogatot 10 µl és 20 µl közötti értékre csökkentjük, hogy a válasz a detektor lineáris tartományába kerüljön. Injektálás: a vizsgálati oldatból és az a) összehasonlító oldatból μl-t injektálunk. A humán inzulin (C 257 H 383 N 65 O 77 S 6 ) és az A21 dezamido humán inzulin együttes tartalmát a vizsgálati oldat és az a) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő, megfelelő csúcsok területe, valamint a CRS humán inzulin deklarált humán inzulin- és A21 dezamido-inzulintartalma alapján számítjuk ki. ELTARTÁS A gyártó által történő felszabadításig légmentesen záró tartályban, fénytől védve, 18 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A felengedett inzulint 5±3 C-on kell tárolni, és rövid időn belül fel kell használni a gyógyszerkészítmények előállítására. Annak érdekében, hogy a tömegmérés folyamán elkerüljük a levegő páratartalmának abszorpcióját, az inzulint szobahőmérsékletűre kell melegíteni. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni, hogy az anyag sertés inzulin enzimes átalakításával, vagy rdns technológiával készült-e.