PROTEOMIKA AZ ÉLELMISZER ELŐÁLLÍTÁSBAN. Czeglédi Levente Gulyás Gabriella Csősz Éva

Átírás

1 PROTEOMIKA AZ ÉLELMISZER ELŐÁLLÍTÁSBAN Czeglédi Levente Gulyás Gabriella Csősz Éva

2 A PROTEOMIKA VIZSGÁLATI MÓDSZEREI I.

3 Az előadás vázlata Molekuláris biológiai alapfogalmak Proteomika, mint tudományterület Gél alapú proteomika - a munka lépései - eszköztára

4 Biológiai alapismeretek DNS: - dezoxiribonukleinsav - örökítőanyag - szerkezete lehetővé teszi a genetikai információ tárolását, megkettőződését és átadását Forrás:

5 RNS: - ribonukleinsav - a gének kifejeződésében játszanak szerepet - hírvivő RNS (messenger, mrns): a DNS információtartalmának szállítása a fehérjeszintézis helyére - szállító RNS (transfer, trns): aminosavak szállítása a fehérjeszintézis helyére - riboszomális RNS (rrns): riboszómák felépítésében vesznek részt

6 Fehérje: - aminosavakból felépülő szerves makromolekulák - az aminosav sorrendet a DNS nukleotid szekvenciája kódolja a kódszótárnak megfelelően - elsődleges szerkezet: aminosav sorrend - másodlagos szerkezet: polipeptidlánc konformációja - harmadlagos szerkezet: a fehérje háromdimenziós szerkezete - negyedleges szerkezet: több polipeptidlánc aggregációja, összetett fehérjék szerkezete

7 Transzkripció: a DNS-ben tárolt információ átíródása hírvivő (mrns) molekulákra Transzláció: az átíródott mrns nukleotid sorrendjének megfelelő aminosav sorrendű polipeptid képződése Poszt-transzláció: megváltozhatnak a fehérjék egyes kémiai tulajdonságai (pl.: foszforiláció, glikolizáció) ill. a fehérjék irreverzibilis hasítását jelentheti (proteázok)

8 Transzkripció Fázisai: INICIÁCIÓ: RNS polimeráz kötődése, transzkripciós kezdőpont (promoter), DNS szál széttekeredik ELONGÁCIÓ: lánchosszabbítás 5-3 irányban, hibrid hélix képződése TERMINÁCIÓ: terminációs szignálhoz ér, befejeződik az RNS szintézison Exon, intron szekvenciák

9 RNS-polimeráz DNS kettős hélix RNS Stop-szekvencia RNS

10 Transzláció Fázisai: INICIÁCIÓ: riboszóma kis és nagy alegysége + mrns ELONGÁCIÓ: - riboszómán A(aminosav) és P(peptid) kötőhely - mrns kodon és t-rns antikodon párosodás - Met t-rns-sel kezdődik a P helyen - újabb t-rns az A helyen - peptidkötés kialakul - transzlokáció TERMINÁCIÓ: stop kodonig tart az elongáció, leáll a fehérje növekedés

11 fehérjelánc aminosav t-rns mrns riboszóma

12 Poszt-transzláció 1. csoport: enzim által katalizált kovalens módosítás; aminosav oldalláncok kémiai tulajdonságai megváltoznak pl.: glikoziláció, aciláció, metiláció, foszforiláció, 2. csoport: proteolízis; fehérjék peptidkötéseinek irreverzibilis hidrolitikus hasítása

13 Omikák transzkripció DNS Genomika Ugyanaz a genom! transzláció poszt-transzláció mrns Fehérje Transzkriptomika Proteomika Funkció

14 Proteomika: adott időpillanatban egy sejtben vagy szövetben expresszálódó fehérjék összességével foglalkozó tudományterület

15 Proteomika történet O Farrell nagy felbontású elválsztástechnika: két dimenziós gélelektroforézis, néhány ezer fehérje Wilkins proteom kifejezést először használta James proteomika kifejezés

16 Élelmiszer proteomika Élelmiszer minőség és biztonság Milyen hatással van az élelmiszer a fogyasztók egészségére/életfolyamataira A feldolgozási folyamatok során hogyan változik a fehérje összetétel

17 Gél-alapú proteomikai vizsgálatok főbb lépései Minta előkészítés: homogenizálás, fehérjék szolubizálása, frakcionálás Elválasztás: - ph szerint (izoelektromos fókuszálás) - molekulasúly szerint (SDS-PAGE) Festés: coomassie, ezüst, fluoreszcens Gélelemzés: expressziós különbségek keresése

18 Intens. [a.u.]? x m/z

19 Minta előkészítés A proteomikai vizsgálatok sikerességét nagy mértékben befolyásolja a minta előkészítés Figyelembe kell venni a fehérjék oldhatóságát, méretét, töltését, izoelektromos pontját Hatékony minta előkészítés: - megakadályozza a fehérjék aggregációját - megakadályozza a fehérjék módosítását (enzimatikus, kémiai) - eltávolítja az interferáló anyagokat

20 Homogenizálás Cél: szövetek, sejtek roncsolása, feltárása Mechanikai: Potter-féle homogenizátor (kézi) Folyékony nitrogén - mozsár+mozsártörő Polytron - rotor+állórész Gyöngyök: koptató, nyíró hatás Ultraszonikálás: ultrahangos roncsolás kavitáció Magas nyomás: French press Fagyasztás-olvasztás

21

22

23 A sejtek feltárását követően különböző vegyszerek segítségével végezzük a fehérjék kivonását a mintákból A kivonásnál használt detergensek, amfolitok, redukáló ágensek és kaotrópikus sók koncentrációjának módosításával jelentős különbségeket érhetünk el a későbbi elválasztási lépések során.

24 Kaotrópikus ágensek Urea, thiourea Makromolekulák denaturálása Hidrogén kötéseket bont Fehérje aggregációk kialakulásának megakadályozása Thiourea gyengén oldódik vízben 37 C fölött Karbamiláció Ajánlott: 2M thiourea, 8M urea

25 Detergensek Amfipatikus molekulák (hidrofil+hidrofób) Nem ionos detergensek: NP-40, Triton X-100 Ikerionos detergensek: CHAPS 3-[(3-kolamidopropil)- dimetilammónium]-1-propánszulfonát, CHAPSO, szulfobetainok (ASB-14) Hidrofób kölcsönhatások megakadályozása (aggregációt, precipitációt okoznak) Fehérjék oldhatósága nő Ajánlott: max. 4% CHAPS

26 Redukáló ágensek Intra- és intermolekuláris diszulfid kötéseket bontják Dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), tributylphosphine (TBP) Magas cisztein tartalmú fehérjéket a DTT nem tudja teljesen redukálni TBP sokkal hatékonyabb, de toxikus! Ajánlott: DTT max. 100mM TBP 2mM

27 Amfolitok Stabilizálják a ph-t Megakadályozzák az amino csoportok karbamilációját A nem megfelelő só koncentrációt ellensúlyozzák Túl magas amfolit koncentráció lelassítja az izoelektromos fókuszálást Az első dimenzió ph tartományának megfelelő amfolit használata növeli a hatékonyságot

28 Proteáz inhibitorok Proteáz: peptidkötések hidrolízise A mintavétel során a szövetek kikerülnek természetes közegükből, a fehérjék nagyon gyorsan elkezdenek degradálódni (kisebb peptidek jönnek létre), nem az intakt állapotnak megfelelő képet kapjuk a fehérje összetételről Ez megakadályozható: - azonnal folyékony nitrogénbe helyezzük a mintát - proteáz inhibitorok hozzáadásával - a kettő kombinációjával

29 PMSF: leggyakrabban használt, szerinproteázok és néhány cisztein proteáz ellen hatásos, vízben hamar degradálódik AEBSF: szerin-proteázok ellen EDTA: metalloproteázok gátlása Benzamidine: szerin-proteázok ellen Aprotinin: szerin-proteázok ellen Bestatin: aminopeptidázok ellen Pepstatin: aszpartát-proteázok

30 Frakcionálás Nagy gyakoriságú fehérjék depletálása: ELŐTTE UTÁNA

31 Frakcionálás méret szerint: centrifugálással Szubcelluláris frakcionálás

32 Frakcionálás oldhatóság szerint Ezekkel a frakcionálási módszerekkel növelhető a marker fehérjék megtalálásának valószínűsége

33 Kromatográfiás elválasztás Frakcionálás egyik lehetséges módja Lényege: álló fázis + mozgó fázis a minta komponensei az állófázissal és a mozgófázissal különböző típusú kölcsönhatásba lépnek, eltérő ideig tartózkodnak az álló-fázisban Típusai a mozgófázis halmazállapota szerint: - gázkromatográfia, - folyadékkromatográfia - szuperkritikus folyadékkromatográfia

34 DNS/RNS Sók Lipidek Poliszacharidok Szennyező anyagok Zavarják a további elválasztási lépéseket!!!

35 Fehérje koncentráció meghatározása Abszorbancia mérés 280nmen Bradford reagens: Coomassie Brillant Blue 470nm-595nm, kék szín BCA módszer: bicinchoninic sav, 562nm, a peptidkötés redukálja a réz(ii) iont réz(i) ionná, lila szín

36 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Mi a transzkripciós és a transzláció? Mi indokolja a fehérjék frakcionálását? Melyek a mintaelőkészítés vegyszerei és szerepük? Felhasznált és ajánlott irodalom 2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation,Volume 1,2 Szerkesztő: Anton Posch Thierry Rabillouda, Cécile Lelong (2011): Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial. Journal of proteomics, Wayne F. Patton (2002): Detection technologies in proteome analysis. Journal of chromatography B, 771, Jian-Zhong Han and Yan-Bo Wang (2008): Proteomics: present and future in food science and technology. Trends in Food Science & Technology 19,

37 A PROTEOMIKA VIZSGÁLATI MÓDSZEREI II.

38 Az előadás vázlata Kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis -Első dimenzió -Második dimenzió Blue Native PAGE Western-blot

39 Első dimenzió - Izoelektromos fókuszálás (IEF) fehérjék elválasztása izoelektromos pontjuk(pi) alapján pi: az a ph érték, amelynél a pozitív és a negatív töltések kiegyenlítik egymást, ilyenkor a molekula neutrális viselkedést mutat elektromos térben Legtöbb fehérje izoelektromos pontja ph 3-12 tartományba esik áram hatására a fehérjék vándorolnak a gélben elérik az izoelektromos pontjukat

40 ph3 ph10 IPG strip 4,5 4,5 6,9 5,9 5,9 4,8 4,5 4,5 5,9 8,2 4,5 6,9 6,9 4,5 4,8 4,5 5,9 IEF ph3 ph10 IPG strip 4,5 4,8 5,9 6,9 8,2

41 Rögzített ph gradiens - stripek Vékony gél csík egy műanyag fóliához polimerizálva, meghatározott ph tartománnyal Könnyen kezelhető, jól ismételhető Lineáris vs. nem-lineáris Különböző ph tartományok: 3-10, 4-7, 5-8, 3-6, 7-10 Különböző hosszúság: 7cm, 11cm, 17cm, 18cm, 24cm Különböző rehidratálási térfogat: 7cm-125ul, 11cm-200ul, 17cm-300ul

42 Rehidratálás fehérjék abszorbeálódnak a gélben (strip) óra aktív: alacsony feszültség, a fókuszáló gépben passzív: csak abszorbció cup-loading: sok DNS/RNS/nagy molekulák Cup-loading sok glikoprotein bázikus IPG stripeknél szérum mintáknál, melyek még albumint tartalmaznak

43

44 Izoelektromos fókuszáló

45 Futtatási paraméterek Függ: minta típustól, ph gradinestől, strip hosszúságtól Áramerősség max: 50uA/strip Hőmérséklet konstans 20 C 1 lépésben vagy 3 lépésben Kezdetben alacsony a feszültség, így elkerülhető az aggregáció és precipitáció Volt-óra: pl: 9000Vhr= 9000V 1óra alatt vagy 4500V 2óra alatt 7cm 8-10,000 V-hr 11cm 20-35,000 V-hr 17cm 40-60,000 V-hr

46 Problémák az IEF során Vízszintes csíkozottság: Túl hosszú fókuszálási idő Túl rövid fókuszálási idő Túl sok fehérje a gélen Sók, lipidek, nukleinsavak, poliszacharidok Nem megfelelő rehidratáló oldat

47 DNS szennyeződés, rövid fókuszálási idő IEF nincs optimalizálva

48 Equilibrálás IEF után Két különböző összetételű equilibráló puffert használnak egymást követően Összetevők: urea, SDS, Tris puffer ph 8,8, glicerol, DTT/iodoacetamide Urea, glicerol: electroendozmózis csökkentése Tris puffer: megfelelő ph fenntartása SDS: denaturálás, egységes negatív töltés

49 Szulfhidril csoportok redukálása 1. equilibráló puffer 2%DTT Szulfhidril csoportok alkilálása 2. equilibráló puffer 2,5% iodoacetamid perc / equilibráló puffer Elégtelen equilibrálás

50 Második dimenzió SDS PAGE SDS PAGE: Szodium dodecil szulfát poliakrilamid gélelektroforézis A fehérjék molekulasúly alapján történő elválasztása SDS: negatív töltést ad, így már csak a molekulasúly különböző - A kisebb fehérjék gyorsabban mozognak SDS

51 Molekulasúly (kda) ph3 ph10 IPG strip 4,5 4,8 4,8 5,9 6,9 8,2 SDS-PAGE 8,2 4,5 5,9 4,8 6,9

52 Monomer: akrilamid Poliakrilamid gél Keresztkötő: N-N -metilén-biszakrilamid T%:monomer mennyisége C%:keresztkötő mennyisége A polimerizáció katalizátorai: Ammonium perszulfat TEMED (N,N,N,N -tetramethylethylenediamine) Különböző méretű gélek különböző felbontás

53

54 Grádiens gél elektroforézis Koncentráció grádiens: gél tetejétől az alja felé nő a pórusméret csökken Lassabb migráció Kis molekulasúlyú fehérjék tovább maradnak a gélben ugyanabban a gélben lehetséges a kis és nagy molekulasúlyú molekulák elválasztása Komplex minták szeparálása Általános: 8-16 T%

55 SDS-PAGE Csak molekulasúly szerinti elválasztás Elektroforézis előtt SDS-sel forralás Gyűjtő (stacking) és elválasztó (resolving) gél

56 FELSŐ PUFFERTARTÁLY ZSEBEK GYŰJTŐ GÉL ELVÁLASZTÓ GÉL ALSÓ PUFFERTARTÁL Y

57 BlueNative-PAGE A fehérjék szolubilizálása nem-denaturáló reagenssel + Coomassie brilliant blue (negatív töltést ad) 1.dimenzió: natív gélelektroforézis (nem-denaturáló), a molekulák alakja és mérete is befolyásolja a futtatást Gélsáv kivágása, SDS-es oldattal denaturálás 2.dimenzió: 90 -kal elforgatás és egy grádiens SDS-es gél tetejére Mitokondriális fehérjék vizsgálata

58 BN-PAGE Molekulasúly csökken elforgatás SDS- PAGE 1. dimenzió 2. dimenzió

59 16-BAC Hidrofób membrán fehérjék vizsgálata 1. dimenzió: kationos detergens 16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride) stacking gél ph 4,1; resolving gél ph 2,1 Gélsáv kivágása, 90 -kal elforgatás 2. dimenzió: SDS-PAGE (molekulasúly szerinti elválasztás)

60 16-BAC Molekulasúly csökken elforgatás SDS- PAGE 1. dimenzió 2. dimenzió

61 DIGE (Differential in-gel electrophoresis) Ugyanazon a gélen 2 minta + belső standard (kísérletben szereplő összes mintából képzett elegy) Fluoreszcens festékkel jelölve: Cy2, Cy3, Cy5 a futtatás előtt A festéknek megfelelő hullámhosszon scan Előnyök: kevesebb gél, futtatásból adódó különbségek csökkennek (jobb az ismételhetőség), gélelemzés egyszerűbb, nagyon érzékeny módszer

62 Cy2 Cy3 Cy5 Cy2 Gélek elemzése Cy3 2D-PAGE MIX Cy5

63 Cy3 - kb. 575 nm

64 Gél festési eljárások Három leggyakrabban használt: Coomassie festés: érzékenység 10ng R-250: regresszív festés G-250: progresszív festés Ezüst festés: érzékenysége 1ng nem végpontos festés, nem alkalmas mennyiségi összehasonlításra Fluoreszcens festés: érzékenysége 1ng kvantitatív, pl.: Sypro Ruby

65 Gélelemző szoftverek Ugyanaz a spot ugyanolyan futtatási paraméterek mellett sem mindig ugyanott helyezkedik el a gélen! Okok: inhomogén poliakrilamid különbségek a hőmérsékletben különbségek az áramerősségben A szoftverek segítségével: festésből adódó háttérzaj csökkentése spotok párosítása (matching) gélek egymásra illesztése (warping) fúziós gélek létrehozása spotok detektálása és kvantifikálása statisztikai próbák alkalmazása

66 Decodon, Germany Delta2D Bio-Rad, USA PDQuest, ProteomWeaver Nonlinear Dynamics, UK SameSpots Progenesis GE Healthcare Decyder 2D Syngene, UK Dymension

67

68

69 Western blot Fehérjék kimutatásához antitesteket használnak Lépései: - gélelektroforézis - transzfer nitrocellulóz vagy PVDF membránra - nem specifikus fehérjék blokkolása - fehérjék jelölése antitesttel - detektálás SDS-PAGE Western blot

70 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Miért érdemes több dimenzióban elválasztani a fehérjéket? Gélfestési eljárások összehasonlítása Mi a Western blot elve? Alkalmazhatósága? Felhasznált és ajánlott irodalom 2D PAGE: Sample Preparation and Fractionation,Volume 1,2 Szerkesztő: Anton Posch Thierry Rabillouda, Cécile Lelong (2011): Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial. Journal of proteomics, Kathryn S Lilley, David B Friedman (2006): Difference gel electrophoresis DIGE. Drug Discovery Today: Technologies 3,3. Leo G.J. Nijtmans,Nadine S. Henderson,Ian J. Holtc (2002): Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods 26,

71 HÚS és HÚSTERMÉKEK PROTEOMIKÁJA I.

72 Az előadás vázlata Izomszövet, mint hús és fehérjéi A hús minősége és azt befolyásoló proteinek: - porhanyósság - márványozottság - szín - víztartóképesség - PSE/DFD

73 Húsfogyasztás Világátlag: 42,5 kg/fő/év (2012) Magyarország: 63,2 kg/fő/év ( ) Százalékos megoszlás Magyarországon: - Marha és borjúhús: 4,4% - Sertéshús: 44,6% - Baromfihús: 43,4% - Egyéb hús: 2,8% - Belsőség: 4,8%

74 56-72% víz 15-22% fehérje Hús összetevők 5-34% intramuszkuláris zsír 3,5% szénhidrátok, sók, ásványi anyagok, vitaminok Az összetevők arányát több tényező befolyásolja: faj, fajta, nem, életkor, tartási körülmények

75 Izomfehérjék miofibrilláris fehérjék: - magasabb só koncentrációjú oldatokban oldhatóak - aktin, miozin, tropomiozin, troponin és a-, b- aktinin - melyeknek elsősorban az izommozgásában van szerepük

76 wikipedia.org alapján

77 szarkoplazma fehérjék: - vízben és gyengébb sóoldatokban oldhatók - albuminok, mioglobin, globuláris fehérjék, miogén, mitokondriális fehérjék, lizoszómák, liposzómák, szarkoplazmás retikulum hálózat kötöszöveti fehérjék: - kollagén, elasztin, retikulin - vízben és sóoldatokban oldhatatlan frakciót képeznek

78 Élettani hatások A kiegyensúlyozott táplálkozás fontos része Teljes értékű fehérjeforrás, esszenciális aminosavak B1-, B2-, B6-, B12-, A- és D-vitamin Fontos ásványi anyagok: vas, cink, mangán, szelén Húsban lévő vas nagyobb mértékben hasznosul a felszívódás során, mint a növényi forrásból származó vas Mértéktelen húsfogyasztás káros következményei: köszvény, reuma, érelmeszesedés

79 Proteomikai vizsgálatok célja Húsminőség hátterében álló jelenségek feltérképezése Húsminőség javítása, biomarker fehérjék azonosításával Izomnövekedés és fejlődés vizsgálata Feldolgozási folyamatok hatása a proteom összetételére Hamisítások kiszűrése Élelmiszerbiztonsági vizsgálatok

80 Húsminőség A húsminőségben mutatkozó variancia gyakran jelent problémát a húsiparban Proteomikai módszerek segítséget nyújthatnak e komplex tulajdonság tanulmányozásában Post-mortem folyamatok is befolyásolják Húsminőségi paraméterek: porhanyósság,víztartó képesség, márványozottság, lédússág, szín

81 Fehérje módosítások - Kovalens módosítások: oxidáció, foszforiláció, acetiláció, glikoziláció, aciláció - Fehérje molekulák hasítása Hatással vannak az élelmiszer különböző tulajdonságaira: emészthetőség, tápérték, szavatosság

82 A módosítások megváltoztathatják a fehérjék molekulasúlyát és/vagy izoelektromos pontját 1D v. 2D PAGE használható kimutatáshoz vagy LC-MS/MS Oxidáció minőségromlást okoz: csökkenti a hús víztartóképességét, a porhanyósságát és lédússágát valamint az emészthetőséget és tápértéket is

83 Porhanyósság Az izomfehérjék postmortem degradációja fontos faktora a hús puhaságának Nem sokkal vágás után elkezdődik Miofbrilláris fehérjék degradációja okozza Ezek a fehérjék biztosítják a miofibrillumok szerkezeti integritását, proteolitikus degradációjuk a miofibrillumok gyengüléséhez, végső soron a hús puhaságához vezet

84 Porhanyósság marker fehérjéi troponin T, nebulin, titin, vinculin, desmin, dystrophin SDS-PAGE és immunoblot segítségével is bizonyították ezek post-mortem degradálódását Titin és nebulin gyorsabban degradálódik a porhanyósabb húsban (lehetséges biomarkerek)

85 Glikolitikus útvonal enzimjeinek expressziós szintje növekszik a porhanyós húsokban: triózfoszfát izomeráz, enolase 3, gliceraldehid 3-foszfát, piruvát-kináz Triózfoszfát izomeráz Enoláz 3

86 Oxidatív energia metabolizmus enzimjei a mitokondriumban, megnövekedett expressziós szintjük a hús porhanyósságát jelzi: 3-hydroxyisobutirát dehidrogenáz citokróm-c hydroxyacyl CoA-dehydrogenase izocitrát dehidrogenáz szukcinát dehidrogenáz szukcinil KoA dehidrogenáz

87 Hősokk fehérjék: - védik a fehérjéket a denaturálástól és a funkcióvesztéstől - HSP60, HSP70, HSP40, HSP27 marker fehérjék - megnövekedett expressziójuk a porhanyósággal ellentétes irányba hat (keményebb lesz a hús)

88 Elektromos stimuláció Porhanyósság javítása post-mortem Hidegrövidülés (izomban lévő ATP és a nem megfelelő Ca pumpa váltja ki) ellen hatásos Izom összehúzódást indukál, mely az izomban lévő maradék ATP-t felhasználja 2D-PAGE segítségével összehasonlítás: nem kezelt vs. elektromosan stimulált hús

89 Eredmények: Elektromos stimuláció hatására: - metabolikus enzimek degradációja - ATP kiürülést segíti - kreatin kináz degradáció nagyobb energia felhasználás - troponin-t, dezmin, aktin mennyisége csökken proteolízis sebessége nő - csökken a miofibrilláris fehérjék stabilitása

90 Márványozottság Intramuszkuláris zsírtartalom mennyisége és eloszlása A hús ízének kialakításában nagyon fontos Biomarker fehérjék Negatív korreláció a márványozottsággal: triózfoszfát izomeráz, szukcinát dehidrogenáz

91 Szín Mioglobin és származékai határozzák meg a telítettséget és az árnyalatot Mioglobin oxidáltságától függően: Dezoximioglobin (bíborvörös), oximioglobin (cseresznyepiros) metmioglobin (szürkés barna) tárolás során L*: világossági tényező, a hús fényvisszaverési képességével függ össze

92 Sertésnél L* biomarkerek: sötétebb húsban overexpresszió: - mitokondriális fehérjék, magyarázza az erősebb oxidatív metabolizmust - hemoglobin, jobban erezett a sötét hús - chaperonok (Hsp 27 és αb-christallin) világosabb húsban overexpresszió: - glikolízis néhány enzimje (enolázok) - proteolízis indikátorai

93 a*: vörösség - Marhahús esetén pozitív korrleáció a* értékkel: aldóz reduktáz, reductase, keratin kináz, ß- enoláz, piruvát dehidrogenáz - Marhahús esetén negatív korrleáció a* értékkel: mitokondriális akonitáz Szín stabilitása: pozitív korreláció Hsp27, piruvát dehidrogenáz, peroxiredoxin-2, stresszindukált foszfoprotein-1

94 Víztartó képesség Vágás, hő vagy nyomás hatására is képes a hús megtartani a vizet A post-mortem a ph csökkenés és a fehérje denaturáció csökkenti a vízkötő képességet Csepegési veszteség formájában lehet mérni Nagy csepegési veszteség súly csökkenést okoz a nyers és a feldolgozott húsokban A víztartó képesség a lédússág fontos tényezője

95 Marker fehérjék: Nagyobb csepegési veszteség - kreatin kináz enzim (marker fehérje) expressziós szintje magas - keratin foszfát gyorsabb degradációját okozza - gyorsabb ph csökkenés és gyorsabb izom összehúzódás - nagyobb csepegési veszteség Jó víztartó képesség: Hsp70 overexpresszió

96 Juh hús ph5-8

97 Szarvasmarha hús ph5-8

98 Sertés hús ph 3-10

99 Szarvasmarha hosszú hátizom ph 5-8 DIGE Cy5 Cy2 Cy3

100 PSE/DFD húsminőség PSE: Pale Soft Exudative halvány, puha, vizenyős gyors glikogén lebomlás sok tejsav ph 5,7 alatt ok: stressz (genetikai v. környezeti) PSE markerek: proteolízis mértéke csökken a PSE húsokban troponin T, MLC1, α-krisztallin mennyisége magasabb a csökkent intenzitású proteolízis miatt

101 DFD: dark, firm, dry sötét, tömött, száraz ha tartós stressz után vágják az állatokat, a glikogén már korábban lebomlik, nincs tejsav ph 6,4 feletti könnyen romlik, kevés sót vesz fel DFD markerek: lehetséges marker HSP70, az alacsony csepegési veszteségű húsokban szintén marker

102 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Melyek a legfontosabb izomfehérjék: A porhanyósságnak vannak protein biomarkerei? Mi a áll a PSE/DFD húshiba hátterében? Felhasznált és ajánlott irodalom Proteomics in foods Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. Thierry Sayd és mtsai. (Proteome Analysis of the Sarcoplasmic Fraction of Pig Semimembranosus Muscle (2006): Implications on Meat Color Development J. Agric. Food Chem., 54 (7), Gianluca Paredia és mtsai. (2012): Muscle to meat molecular events and technological transformations: The proteomics insight. Journal of proteomics 75,

103 HÚS és HÚSTERMÉKEK PROTEOMIKÁJA II.

104 Az előadás vázlata Szárazon pácolt sonka és proteomikai kutatások Hő hatása a húsfehérjékre Fajspecifikus proteinek Baktériumok hústermékekben Hamisítások

105 Hústermékek Proteomikai vizsgálatok többsége: szárazon pácolt sonka ( dry-cured ) Proteolízis tanulmányozása Füstölés, sózás, ph változás, hő, szárítás hatása Virslik, szalámik, kolbászok

106 Szárazon pácolt sonka Magas minőség, tipikus íz és állag Hosszú érlelési idő Pl.: Prosciutto, Bayonne Több biokémiai reakció (proteolízis, lipolízis, glikolízis) is lejátszódik, míg kialakul a végleges íz Fehérjék degradációja: proteolízis (a leginkább tanulmányozott folyamat a sonkák érlelése során)

107 Sózás 1-3 C, páratartalom>90%, 1,1 nap/kg Pihentetés 2-4 C, páratartalom 75-85%, 40-60nap Érlelés C, páratartalom 70-80%, 6-24 hónap

108 Proteolízis az érlelés során Enzimatikus autolízis során a nagyméretű miofibrilláris fehérjék (miozin, aktin, titin) a proteázok enzimatikus aktivitásának hatására kis méretű peptidekre hasadnak Ez a folyamat nagymértékben meghatározza a sonka ízét, textúráját és illatát Proteolitikus enzimek 2 csoportba sorolhatók: - endopeptidázok - exopeptidázok

109 Endopeptidázok: - pl.: kalpainok, katepszinek, - közvetlenül felelősek a post-mortem változásokért - intakt fehérjéket hasítják nagyobb polipeptidekre - kalpainok az érlelés első 2 hetében aktívak - katepszinek akár a 15. hónapig is

110 Exopeptidázok: - az endopeptidázok által létrehozott nagyobb polipeptideket hasítják kis peptidekre ill. aminosavakra - dipeptidil-peptidáz, sózás alatt csökken az aktivitás, mert a ph kedvezőtlen - aminopeptidázok: N-terminális végen lévő aminosavak lehasítása, a fehérje degradáció késői fázisában fontosak -karboxipeptidáz: C-terminálison hasít

111 Proteomikai vizsgálatok SDS-PAGE: Miofibrilláris fehérjék vizsgálata: - aktin, miozin könnyű és nehéz lánc, tropomiozin, troponin T fehérjék proteolízise az érlelés során érlelés 12. hónapját követően teljesen hidrolizálódnak - troponin T degradációja és a marha hús íze között pozitív korreláció - lipofil aminosavak, dipeptidek kellemetlen keserű íz markerei

112 SDS-PAGE: Szarkoplazmatikus fehérjék vizsgálata - Mioglobin az érlelés 17,5. hónapjáig kimutatható az ibériai sonkában - Mioglobin sávja SDS-PAGE-en a bayonne-i sonkában is folyamatosan csökken az érlelés alatt

113 2D-PAGE: - foszfoglicerát kináz, kreatin kináz, glikogén foszforiláz, mioglobin mennyisége csökken az érlelés során - enoláz, foszfoglicerát mutáz végig kimuatatható az érlelés során, de csökken - piruvát kináz, az érlelés 11. hónapja után is konstans mennyiség

114 2D-PAGE: - érlelés során használt só mennyiség hatása a fehérje összetételre - különböző genotípusú állatok sonkájának proteom vizsgálata (PRKAG3 és CAST gének) - ph hatása a proteolízisre a sonka érlelése során - a sonka textúrájában lévő különbségek proteomikai háttere

115 MS alapú módszerek - gél alapú módszerekhez hasonlóan, miofibrilláris és szarkoplazmatikus fehérjék proteolízisének vizsgálata - bayonne-i sonkában a különböző érlelési szakaszok megkülönböztethetőek - mass fingerprint - legmodernebb módszerek esetén előzetes frakcionálások: SEC (size exclusion chromatography), RP-HPLC (reversed phase HPLC)

116 Nyers hús fehérje markereiből meg lehet jósolni a sonka minőségét - segítséget nyújthat az élelmiszeriparban a megfelelő sonka alapanyag kiválasztásához - módszer: SELDI-TOF- MS (surface-enhanced laser desorption/ionisation time-of-flight MS) - főleg a nyers hús színe és állaga között találtak korrelációt a sonka minőségi paraméterivel

117 Serrano sonka: - proteolízis tanulmányozása az érés során - miozin könnyű lánc 1 - peptid fragmensek elvesztik az N-terminális végen lévő dipeptidet - dipeptidil peptidázok végzik ezt a hasítást - a dipeptidek felelősek lehetnek a Serrano sonka karakteres ízéért

118 Hő hatása a húsfehérjékre A húsfeldolgozási folyamatok közül a hő károsítja leginkább a fehérjéket A leromlás a nagy molekulasúlyú fehérjéket jobban érinti Az izoelektromos pont és a molekulasúly nem változik, ezért a 2D képeken a pozíció nem változik A festés intenzitását csökkenti a hő hatás, főleg a nagy molekulasúlyú fehérjék esetén (pl.:miozin nehéz lánc)

119 Faj-specifikus fehérjék változása a feldolgozási folyamatok során Kolbászok, virslik, szalámik különböző fajokból (sertés, marha, csirke, pulyka, stb.) Különböző feldolgozási folyamatok: sós pácolás, füstölés, sütés, főzés, szárítás A feltételezésekkel ellentétben a legtöbb fajspecifikus fehérje rezisztens a feldolgozási folyamatokkal szemben A denaturálás ellenére nem degradálódtak szignifikánsan

120 Húsiparban a hőkezelés hatására (a termék belsejében legalább 72 C) a legtöbb proteáz inaktiválódik, a felvágottaknál ezt ritkán használják A só (nátrium-klorid, nátrium-nitrát) és a ph változás is csökkenti a proteázok aktivitását A sók is csökkentik a festés intenzitását A termékek magas zsírtartalma nem befolyásolta a 2D mintázatot

121 Fermentáció Tejsav baktériumok a legfontosabbak Higiénia és minőség javítás A romlását okozó és a patogén flóra kialakulását gátolja a savanyítással Bakteriocin termelés: fehérje, közeli rokon mikroorganizmusok elpusztítása Stabilizálja a hús színét és textúráját javítja Proteolitikus aktivitás: kis peptidek és aminosavak (nem ezek a baktériumok a fő résztvevői a postmortem proteolízisnek, de részt vehetnek benne)

122 SDS-PAGE analízis: - szarkoplazmatikus fehérjék - bizonyos fehérjék eltűnnek a gélképről, ok: proteolízis vagy elsavasodott közeg - L. curvatus CRL705 vákuum csomagolt húsok szavatossági idejét növeli, a kis peptidek és szabad aminosavak felszabadításával

123 Bakteriális leromlás Az a folyamat, mely során különböző biokémiai változások történek mikrobiális aktivitás hatására Gazdasági veszteséget és súlyos élelmiszereredetű megbetegedéseket okozhatnak Aminok keletkeznek, melyek kellemetlen ízűek, vagy ízetlenné teszik a húst MALDI-TOF-MS alkalmas a baktériumok detektálására és kvantifikálására a húsmintákból

124 Hamisítások kiszűrése Olcsóbb hússal helyettesítés - vallási megfontolások (hinduk nem esznek marhát, iszlám vallásúak és a zsidók sertést) Friss vs. felolvasztott hús Nem hús eredetű anyagok kiszűrése, pl: színezékek, egyéb vegyszerek frissebbnek tűnik a hús Füst aromák füstölés helyett Víz hozzáadása tömegnövelés céljából

125 Kimutatás célja: faj-specifikus biomarker fehérjék azonosítása kromatográfiás és elektroforetikus elválasztás, immunoassay Gyakorlatban: Csirkehús kimutatása húskeverékekből - miozin könnyű lánc-3 a markerfehérje - OFF-GEL elektroforézis + SDS-PAGE + MALDI-TOF MS - 0,5% w/v csirkehús belekeverés még kimutatható

126 SDS-PAGE mintázat alapján elkülöníthető: marha, gímszarvas, kecske, juh, nyúl Kézzel csontozott hús (drágább) és csontozás utáni maradék hús (olcsóbb), melyet géppel szednek le - szükségessé vált egy analitikai módszer, mely segítségével elkülöníthető a két hústípus - OFF-GEL elektroforézis + SDS-PAGE + nanolc-ms - maradék hús biomarkerei: hemoglobin alegység, myosin-binding protein C

127 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Milyen proteolízis játszódik le a húsban? A hús/hústemrék hőkezelése miként befolyásolja a 2D PAGE eljárást? Felhasznált és ajánlott irodalom Proteomics in foods Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. Leticia Mora és mtsai. (2012): Proteolysis follow-up in dry-cured meat products through proteomic approaches. Food research international Silvina Fadda és mtsai. (2010): Role of lactic acid bacteria during meat conditioning and fermentation: Peptides generated as sensorial and hygienic biomarkers. Meat science 86, Aldo Di Luccia és mtsai. (2005): Proteomic analysis of water soluble and myofibrillar protein changes occurring in dry-cured hams. Meat Science

128 A TOJÁS PROTEOMIKÁJA

129 Az előadás vázlata Fehérjék és kötelező élelmiszerjelölés Tojás fehérje Tojás sárgája Tojáshéj Tárolás során bekövetkező változások

130 Élelmiszerek jelölése 19/2004. (II. 26.) FVM-ESzCsM-GKM együttes rendelet az élelmiszerek jelöléséről Elérhetőség:

131 Élelmiszerek jelölése Allergén anyagok, melyek jelölése kötelező: -Glutént tartalmazó gabona (búza, rozs, árpa, zab, tönköly, kamut-búza vagy ezek hibrid változatai) és azokból készült termékek -Rákfélék és azokból készült termékek -Tojás és abból készült termékek -Halak és azokból készült termékek -Földimogyoró és abból készült termékek -Szójabab és abból készült termékek -Tej és abból készült termékek (beleértve a laktózt is)

132 Élelmiszerek jelölése Allergén anyagok, melyek jelölése kötelező: -Diófélék, azaz mandula, mogyoró, dió, kesudió, pekándió, brazil dió, pisztácia, makadámia és queenslandi dió és azokból készült termékek -Zeller és abból készült termékek -Mustár és abból készült termékek -Szezámmag és abból készült termékek -Kén-dioxid és SO2-ben kifejezett szulfitok 10 mg/kg, illetve 10 mg/liter koncentrációt meghaladó mennyiségben -Csillagfürt és abból készült termékek -Puhatestűek és abból készült termékek

133 Élelmiszerek jelölése Enzimek felhasználásának jelölése: Összetevőnek minősül mindazon anyag, az adalékanyagokat és enzimeket is beleértve, amelyet az élelmiszer előállításához használnak fel, akkor is ha az megváltoztatott formában van jelen a végtermékben. Nem minősül összetevőnek: enzim, amely az adott élelmiszer egy vagy több összetevőjében jelen volt, de a fogyasztásra kész élelmiszerben technológiai funkcióval nem rendelkezik Nem kötelező az összetevők felsorolása : sajt, vaj, savanyú tej- és tejszínkészítmények, amennyiben az előállításukhoz a tej eredetű alapanyagon, enzimeken, mikrobatenyészeten, továbbá a friss és ömlesztett sajttól eltérő sajtok esetében az előállításhoz szükséges étkezési són kívül más anyagot nem használtak fel

134 TOJÁS Magyarországi éves tojás fogyasztás: 247db/fő Vitaminforrás: A, B2, D, E, K Fehérjék, zsírsavak (telített, telítetlen), karotinoidok, ásványi anyagok Táplálkozás-élettani jelentősége kiemelkedő

135 Tojásfehérje Feladata: embrió táplálása, mikróbák elleni védekezés, embrió stabilizálás Olcsó, jó minőségű fehérje forrás Tojásfehérje kb. 11%-a fehérje Nagy gyakoriságú fehérjék: 54% ovalbumin 12% ovotranszferrin 11% ovomucoid

136 Kis gyakoriságú fehérjék: 4% ovoglobulin G2, 4% ovoglobulin G3, 3,5% ovomucin, 3,4% lizozim, 1,5% ovoinhibitor, 1% ovoglikoprotein, 0,8% flavoprotein, 0,5% ovomacroglobulin, 0,5% avidin, 0,05% cystatin

137 Fehérjéi széles molekulasúly és pi tartományban mozognak 7kDa kda ph3,9 - ph10,7

138 KMITL Sci. Tech. J. Vol. 7 No. S2 Nov D-PAGE

139 2D-PAGE KMITL Sci. Tech. J. Vol. 7 No. S2 Nov. 2007

140 Tojássárgája Embrió táplálása Immunológiai funkció: anyai antitesteket is tartalmaz Az élelmiszer- és kozmetikai iparban elterjedt a használata (kötő ágensként, antioxidánsként, emulgeálószerként) Fehérje tartalma kb % Vitellogenin: foszfo- és lipoproteinek prekurzora a sárgájában Víz 48%, lipidek 33%

141 Fehérjék: 68% low-density lipoprotein (LDL) 16% high-low density lipoprotein (HDL) 4% phosvitin 10% livetin Vízoldékony frakció Globuláris frakció

142 Kombinatorikus peptid ligand könyvtár Tojásminták esetén legnagyobb kihívás a nagy gyakoriságú fehérjék (ovalbumin, ovotranszferin) csökkentése, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítása gyöngy technológia (2005) Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

143 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal Tojásfehérje: ezzel a módszerrel megduplázták az azonosított fehérjék számát (148) Tojássárgája: 70%-kal növekedett a fehérje találatok száma (316)

144 Tojáshéj Védi az embriót a mikrobiális és a fizikai környezeti hatásokkal szemben Kalciumot biztosít a növekvő embrió számára Szabályozza a víz és gázcserét Rétegei: - kutikula: legkülső vékony filmréteg, mely lezárja a pórusokat, véd a mikróbák ellen - mészhéj: kalcit - héjhártya: dupla membrán

145 Kutikula: kb. 85%-a fehérje 47 különböző fehérjét azonosítottak, melyek közül több antibakteriális és antifungális aktivitással is rendelkezik Mészhéj: - sok tojásfehérje protein megtalálható benne - de vannak csak mészhéj specifikus fehérjék is, melyek az elmeszesedést szabályozzák Héjhártya: megakadályozza, hogy az elmeszesedés befelé is terjedjen - kollagének, proteoglikánok, lizozim, ovotranszferin

146 Tárolás Hosszabb tárolás során a tojás fehérje viszkozitása csökken (elvékonyodik) Kevésbé ellenálló a mikrobiális fertőzésekkel szemben 2D PAGE segítségével megállapították, mely fehérjék expressziója változik tárolás során: ovalbumin, ovotranszferrin, clusterin, ovoinhibitor

147 ph növekedés a tárolás során: - a fehérjék feltekeredését akadályozza - clusterin expressziója nő, hozzákapcsolódik a nem teljesen feltekeredett fehérjékhez, így stabilizálja azokat Tárolás során az ovalbumin és a clusterin proteolízisen megy keresztül, ez a folyamat vagy a proteolitikus enzimeknek vagy a ph savasodásának köszönhető

148 Allergia Magyarországon a lakosság kb. 1% Nagyon sok élelmiszerben megtalálható valamilyen tojás-származék Szigorú jelölés szabályozás szükséges az élelmiszereken MS-alapú módszerekkel nagyon alacsony koncentrációban is kimutathatóak a tojás fehérjéi különböző élelmiszerekből

149 Témakörhöz kapcsolódó kérdések A jogszabályoknak megfelelő élelmiszerjelölés betartását miként Segíthetik a fehérjevizsgálatok? Mi jellemző a tojásfehérje fehérjéire? Mi jellemző a tojássárgája fehérjéire? Felhasznált és ajánlott irodalom Alessia Farinazzo és mtsai. (2009): Chicken egg yolk cytoplasmic proteome, mined via combinatorial peptide ligand libraries. Journal of Chromatography A, 1216, Ning Qiu és mtsai. (2012): Proteomic analysis of egg white proteins during the early phase of embryonic development. Journal of proteomics 75, Egisto Boschettia és mtsai. (2008): The ProteoMiner in the proteomic arena: A nondepleting tool for discovering low-abundance species. Journal of proteomics 71,

150 TEJ ÉS TEJTERMÉKEK PROTEOMIKÁJA

151 Az előadás vázlata Tej összetevői és fehérjéi Tej zsírcsepp membrán fehérjéi Tejsavó jellemzése Kazeinek PTM-ek a tejben Sajt Baktériumok szerepe

152 Tej Természetes táplálék minden újszülöttnek Felnőttek számára is kiváló, tápanyagokban gazdag, könnyen emészthető Kedvező élettani hatások: immunerősítő, betegségmegelőző (csontritkulás, fogszuvasodás, magas vérnyomás) Sokoldalúan használható: - tej, író - vaj - joghurt, tejföl, kefir - sajt

153 Tejfogyasztás Magyarország: 67 liter/év Európai Uniós átlag: 60,7 liter/év Világátlag: 32,7 liter/év Dietetikusok által javasolt: 180 liter/év Magyarország éves tej és tejtermék fogyasztása: 156 kg

154 Tej összetevői Tejcukor (laktóz): ásványi anyagok felszívódását segíti Tejzsír: könnyen emészthető lipid, n-6 és n-3 zsírsav arány optimális Ásványi anyagok: kálium, kalcium, nátrium, foszfor, szelén Vitaminok: B2, B6, B12 Tejfehérjék

155 Tejfehérjék αs1-kazein αs2-kazein β-kazein k-kazein β Laktalbumin ß-Laktoglobulin Immunoglobulinok A sokféle poszttranszlációs módosítás teszi a tejproteomot különösen összetetté

156 Frakciók centrifugálás Tejzsír (MFG-milk fat globule), kis gyakoriságú fehérjék Fölözött tej ultracentrifugálás Oldott frakció: savó fehérjék és peptidek Oldhatatlan frakció: kazeinek

157 MFGM Milk fat globule membrane tejzsírcsepp membrán Tőgyepithel sejt membrán + citoplazma proteinek Kis gyakoriságú fehérjék, prefrakcionáció szükséges ezek feldúsításához A tőgy patofiziológiás állapotáról kaphatunk információt a laktáció ideje alatt

158 Fehérjéi nehezen vihetők oldatba, a sok lipid és a fehérjék hidrofobitása miatt Centrifugálást követően a legfelső zsírrétegből izolálható Zsírtalanítás: metanol+kloroform Fontosabb fehérjék: butyrophilin, lactadherin, adipophilin, xanthine, annexin, acyl-coa szintáz, lanosterol szintáz Szerepük: lipid transzport, szintézis és szekréció

159 Kombinatorikus peptid ligand könyvtár Kihívás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentése, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítása Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció) 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal

160 MFG frakció ph 3-10

161 MFG - vizes fázis ph 3-10

162 MFG frakció ph 3-6 ProteoMiner

163 MFGM fehérjék - betegség megelőzés Rákmegelőző hatás: különösen mellrák fatty acid binding (FAB) fehérje gátolja a ráksejtek növekedését BRCA1 és BRCA2 fehérjék a DNS javító folyamatokban játszanak szerepet Koleszterinszint csökkentő hatás

164 Helicobacter pylori fertőzés gátlása: gyomorfertőzések csökkentése Szív koszorúér megbetegedés esélyének csökkentése Baktericid hatás Szklerózis multiplex tünetek enyhítése Butyrophilin fehérje autoimmun enkefalomielitisz gátlása

165 Tejsavó 2 nagy gyakoriságú fehérje: α-lactalbumin, β- lactoglobulin, a fajok között nagy változatosság Immunglobulinok: antimikrobiális fehérjék IgA, IgM, IgG Laktoferrin, laktoperoxidáz Szerum albumin

166 Foszfoproteinek Kazeinek Tehéntejben a fehérjék 80%-a Sokféle poszt-transzlációs módosulás, nagyon különböző foszforilációs mintázatok αs1-kazein és αs1-kazein kalcium jelenlétében jobban oldódik Kappa kazein - Sajtkészítésben fontos szerepük van kazein+kalcium-foszfát - kazeinmicellák

167 Poszttranszlációs módosulatok vizsgálata A PTM-ek miatt olyan komplex a tej proteom Aminosav oldalláncok kémiai tulajdonságai megváltoznak Foszforiláció: protein kinázok aktivizálják, foszfátcsoport kapcsolódik a fehérjék szerin, treonin és tirozin oldalláncaihoz kazeineknél vizsgálták leginkább 2D-PAGE mintázat

168 Glikoziláció szacharid láncok kapcsolódnak az aszparagin, szerin, treonin és triptofán aminosavakhoz 2D-PAGE+MALDI 10 különböző kappa-kazein glikoforma detektálása Laktoziláció: speciális esete a glikolizációnak, hő hatására alakul ki

169 Proteolízis proteázok végzik, peptidkötés hasítása Legfontosabb proteázok: plasmin és cathepsin aktivitásuk nő a szomatikus sejtszám növekedéssel, így kapcsolatba hozhatók a masztitisszel Ez a folyamat fontos meghatározója a tej termékek textúrájának és ízének. Különböző keménységű és érlelési idejű sajtok különböző 2D mintázatot mutatnak.

170 Tej és tejtermékek hamisítás Pl: bivalytejbe tehéntejet kevernek és bivaly tejként/sajtként árusítják A DNS alapú eredetvizsgálat elterjedtebb DE! Proteomikai vizsgálatok is alkalmasak, főleg MS alapú HPLC/ESI-MS tehén tejet mutattak ki kecske tejben, beta-laktoglobulin marker, 5%-os határ A tejpor hozzáadást is ki lehet mutatni kromatográfiás módszerekkel MALDI-TOF-MS bivaly mozzarellában tehén vagy juh tej jelenléte, alfa-laktalbumin és beta-laktoglobulin marker

171 Sajtok Proteomikai módszerek segítségével vizsgálhatjuk: a proteolízis mértékét (proteolitikus enzimek expressziója) és fajtáját a sajtok eredetét (hamisítások) a tejfehérje polimorfizmusok és a sajtok minősége közti összefüggéseket

172 A víz-oldékony frakció a proteolízis következtében: fehérjék (kivéve kazeinek), peptidek, aminosavak és kis nitrogén tartalmú komponensek A sajtok ízéért ez a frakció felelős, és az érlelési szintet is ebből lehet megállapítani.

173 Oltóanyag (rennet) A tej alvadásért felelős Fiatal állatok (borjú, bárány) gyomrából Két enzim: kimozin, pepszin Kimozin (aszpartil proteáz) 88-94%-os tej alvadási aktivitás Pepszin (szerin proteáz) 6-12%-os tej alvadási aktivitás

174 Kimozin Kappa-kazeint bont 105 Fenilalanin és 106 methionin között vág Para-kappa-kazein + makropeptidek Para-kappa-kazein nem képes stabilizálni a micellákat és kicsapódik Helyettesíthető: mikroorganizmusokban termeltetett kimozinnal vagy gombákban lévő proteinázokkal

175 Baktériumok A fermentált élelmiszerekben lévő baktérium törzsek enzimaktivitása felelős az élelmiszer végső textúrájáért és ízéért Proteomikai módszerekkel lehetőség nyílik metabolizmusuk in situ tanulmányozására a tejtermékekben

176 Megvizsgálhatjuk a tárolás ill. a különböző feldolgozási folyamatok (hűtés, melegítés, extrém ph, magas nyomás) során hogyan változik a baktérium törzsek proteom összetétele Starter baktériumok: laktózból tejsavat állítanak elő, így a közeg savasodoik, patogének ellen hatásos

177 Sajtok: Lactococci ( L. lactis, L. cremoris, L. diacetylactis ), Lactobacilli ( L. helveticus, L. acidophilus, L. casei ), Streptococcus salivarius Joghurtok: Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus Sajtok érést segítő baktériumok: Propionibacterium freudenreichii, Brevibacterium linens

178 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Mi az MFGM? A sajtgyártásban milyen céllal használhatunk proteomikai megközelítést? Felhasznált és ajánlott irodalom Timothy A. Reinhardt, John D. Lippolis (2006): Bovine Milk Fat Globule Membrane Proteome. Journal of Dairy Research, 73, Caroline Vanderghem és mtsai. (2008): Proteome analysis of the bovine milk fat globule: Enhancement of membrane purification. International Dairy Journal, 18, Proteomics in foods Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. R. O Donnella és mtsai. (2004): Milk proteomics. International Dairy Journal 14,

179 A SÖR PROTEOMIKÁJA

180 Az előadás vázlata A sör élettani hatása A sör fehérjéi Allergének A habzás markerei Gyömbérsör

181 Sörfogyasztás A sör a legrégebbi és legszélesebb körben fogyasztott alkoholos ital Csehek a legnagyobb sörfogyasztók: 144 liter/fő Magyarországon átlagosan 70 liter/fő Az Európai Unióban különböző sör létezik és 130 sörtipus

182 Élettani hatások Kedvező élettani hatásai csak mérsékelt fogyasztás esetén érvényesülnek : - vízhajtó - vesekő képződés megelőzése - nyugtató, altató hatású - magas vitamintartalom (B1, B2, B3, B6, B9) - magas antioxidáns tartalom - csökkenti az LDL koleszterin szintet - stimulálja az immunrendszert - ásványi anyag tartalom (Cu, Fe, Zn, Mg)

183 Sör fehérjék 500mg/liter fehérjetartalom Méretük: 5-100kDa A legtöbb fehérje a sörfőzés során használt gabonából származik Hordein nagy gyakoriságú fehérje (árpából származik) Egyéb fehérjék: globulinok, albuminok, amiláz inhibítorok, chaperonok, lipid kötő fehérjék

184 Sörgyártás folyamán a fehérjék különböző módosításokon eshetnek át (különösen a malátázás és a cefrézés során) Hidrolízis, glikoziláció, glikáció A forralás és a hűtés során a fehérje tartalom nagy része kiválik a cefréből A fehérjék módosítása hatással van a későbbi minőségi tulajdonságokra: szín, íz, zavarosság, hab képződés és stabilitás

185 Lipid transzfer protein (LTP) LTP1: egyik nagy gyakoriságú fehérje a sörben Árpa aleuron rétegéből származik Az LTP1-nek nincs habképző potenciálja, de hő hatására irreverzibilisen denaturálódik és így már kitűnő habképző A sör LTP1 tartalma nincs szignifikáns összefüggésben a hab stabilitással

186 2D gélen a bázikus régióból a savasba vándorol a hő hatására LTP1 hatással van a túlzott habzásra, ami az üveg kinyitásakor figyelhető meg, ez súlyos minőségi probléma, az árpa gombás fertőzése okozza az LTP1 overexpresszióját

187 Z Protein: Nagy gyakoriságú fehérje, magas felületi feszültség és rugalmasság jellemzi Hab stabilitásban fontos szerep 3 izoforma: Z4, Z7, Zx Kloroform-/metanolban oldódó fehérjék Alfa-amiláz/tripszin inhibitor család Zavarosságot okoznak

188 Maláta Cefre Sör *1: serpin Z4 *2: LTP Forrás: Tanner GJ, Colgrave ML, Blundell MJ, Goswami HP, Howitt CA (2013) Measuring Hordein (Gluten) in Beer A Comparison of ELISA and Mass Spectrometry. PLoS ONE 8(2): e doi: /journal.pon e

189 Árpa alfa-amiláz inhibitor-1 dimer: Számos amiláz inhibitor azonosítható a sörből Hab képződést pozitívan befolyásolja, de zavarosságot is okoz Kelt tészták esetén is ez a fehérje felelős a gázbuborékok stabilizálásáért

190 Hordeinek: B-, C-, D-, γ- csoport Malátázás és a cefrézés során a maláta proteázok aminosavakra és kis polipeptidekre bontják a hordeineket Habképzők, a hab frakcióban koncentráltan jelen vannak

191 Élesztőből származó fehérjék: 2D + MS: 40 féle élesztő eredetű fehérjét azonosítottak a sörből - élesztő thioredoxin: habzásra negatívan hat - élesztő proteináz A: habzásra negatívan hat, lipid transzfer protein 1-et (LTP-1)bontja - enoláz és triózfoszfát izomeráz: élesztő citoplazmából származnak, melyek a sejtek károsodását követően kerülnek a sörbe

192 sörfőzés során használt élesztők számos környezeti stressznek vannak kitéve: alacsony ph, magas etanol koncentráció, magas ozmotikus nyomás, kevés tápanyag, hőmérsékleti szélsőségek - ezek mind hatással vannak a habképződésre és az ízre - a proteomikai módszerek segítségével ezek a fehérjék markerként használhatók az élesztősejtek kondíciójának monitorozására

193 Allergének Serpin-Z4 + Lipid transzfer protein 1 a leginkább allergén fehérjék a sörben Csalánkiütést és anafilaxiát okozhatnak Glutén érzékenység: búza glutenin és gliadin fehérjék árpa hordeinek rozs secalinek zab - aveninek

194 Habzás Egyik legfontosabb minőségi tulajdonság a fogyasztók számára Stabilitás, fehérség, intenzitás, krémesség Fehérjék a fő meghatározói Habképződés szempontjából vannak pozitív és negatív fehérjék pozitív pl.: árpa alfa-amiláz inhibitor-1 dimer negatív pl.: élesztő thioredoxin

195 Gyömbérsör A gyömbér széles körben használt fűszernövény és a természetgyógyászatban is elterjedt Emésztőrendszeri betegségek és petefészek rák megelőzésében körül Írországban készítettek először gyömbérsört

196 Kombinatorikus peptid ligand könyvtár A különböző italok esetén leggyakrabban használt eljárás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentésére, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítására gyöngy technológia (2005) Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

197 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal ProteoMiner segítségével vizsgálták egy kereskedelmi forgalomban kapható gyömbér ital fehérje összetételét

198 5 szőlő és 1 alma fehérjét sikerült azonosítani DE!!! Gyömbérfehérjét egyet sem sikerült azonosítani A szőlő és alma fehérje jelenléte nem meglepő, mert az italon feltüntették, hogy szőlő és alma levet is tartalmaz De nem lenne szabad rajta feltüntetni, hogy gyömbér kivonatot tartalmaz, habár a gyömbér íz érezhető

199 Megfelelő és pontos címkézés!! A kis és nagy mennyiségben előforduló összetevőket is fel kell tüntetni, ill. csak a ténylegesen előforduló komponenseket.

200 Kombinatorikus peptid ligand könyvtár használata üdítőitalok esetén: - kóla - mandulatej - mandulatej szirup Kombinatorikus peptid ligand könyvtár használata más alkoholos italok esetén: - aperitifek (olasz cynar és braulio) - borok, pezsgők

201 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Mi jellemző a sör fehérjetartalmára? Mi az LTP és mi a jelentősége? Felhasznált és ajánlott irodalom Takashi Iimure, Kazuhiro Sato (2012): Beer proteomics analysis for beer quality control and malting barley breeding. Food Research International Michelle L. Colgrave (2012): Proteomics as a tool to understand the complexity of beer. Food Research International Elisa Fasoli és mtsai. (2012): Ginger Rogers? No, Ginger Ale and its invisible proteome. Journal of proteomics 75, Elisa Fasoli és mtsai. (2012): In-depth proteomic analysis of non-alcoholic beverages with peptide ligand libraries. I: Almond milk and orgeat syrup. Journal of proteomics 74,

202 A bor proteomikája

203 Az előadás vázlata a bor élettani hatása szőlőfehérjék minőség és proteinek mikroorganizmusok fehérjéi más eredetű fehérjék

204 Borfogyasztás Magyarországon: 23liter/év Franciaországban: 54 liter/év Olaszországban: 49 liter/év Világátlag: 3,6 liter/év

205 Élettani hatások Kedvező élettani hatásai csak mérsékelt fogyasztás esetén érvényesülnek Magnézium: izomműködés Mangán: idegrendszer, pajzsmirigy, vérképzés Kalcium: csontritkulás ellen Kálium: szívritmuszavar ellen Vas: vérképzés Borkő, citromsav, borostyánkősav: emésztést segíti

206 C- és B- vitamin Antioxidánsok: koleszterinszint csökkentés Fenolok: vérrögök kialakulását gátolják, nitrogén-oxid termelés fokozása (értágító) Napi 1-2dl vörösbor fogyasztás 50%-kal csökkentheti a szív- és érrendszeri megbetegedések kialakulásának esélyét

207 Borfehérjék A bor fehérjéi származhatnak: Szőlőből (nagyobb rész) Mikroorganizmusokból

208 Szerepük a borban Borminőség Íz és testesség Habzás a pezsgőborok esetén Hátrányok: zavarosság okozói, allergének

209 A szőlő fehérjéi Kis mennyiség: mg/liter Heterogének Az érés kezdetét követően nő a fehérjemennyiség Fő komponensek: 34% Energiaháztartás 19% Patogenezishez köthető fehérjék (védekezés, stressz, betegségek) 13% Metabolizmus

210 Szőlőszemek érése során bekövetkező változások: - fotoszintézis, szénhidrát metabolizmus, stressz válasz fehérjéinek expressziója nő a szemek színváltozásának kezdetén - a színváltozás végén az antocián szintézis fehérjéi overexpresszálódnak a termés héjban - a szüretet követően a patogenezishez köthető fehérjék a legdominánsabbak

211 Patogenezis fehérjéi Kitináz Osmothin β-1,3-glukanáz Thaumatin-szerű fehérjék Szerepük: gombák elleni védekezés Egészséges növényekben alacsony a szintjük

212 Kitináz 32kDa, több izoforma Levelekben, gyökérben, szárban, de legnagyobb mennyiségben a bogyóban Érés során nő a mennyisége Borban is aktív, képes kötődni a kitinhez Thaumatin-szerű fehérjék 24kDa Főleg a szőlőszemben Thaumatin édes ízű, de ezek a fehérjék nem Antifungális hatás: permeabilizálják a sejtmembránt A proteolízissel és a bor alacsony ph-jával szemben ellenállóak, így túlélik a borkészítést. Üledékképződést és/vagy a bor zavarosodását okozhatják.

213 Borkészítés során a szőlő fehérjéi (kivéve patogenezishez köthető fehérjék): - denaturálódnak (savas ph miatt) - degradálódnak (proteázok) - precipitálódnak Nehéz izolálni a bor fehérjéit, a sok polifenol és más interferáló anyag miatt (fehérborból könnyebb, mert abban nincsenek antociánok)

214 Opálosság Tárolás során fellépő szélsőséges hőmérséklet okozza Fehérjék aggregálódnak, zavarosságot okoznak, üledéket képeznek Csökkenti a bor piaci értékét Bentonittal megelőzhető Nem mindegyik típusú borfehérje okoz zavarosságot, csak amelyek nem hőstabilak

215 Az opálosság okozójaként: patogenezishez kapcsolódó fehérjéket azonosítottak Ezek proteázokkal és savas ph-val szemben ellenállóak, de hővel nem Kitináz, thaumatin-szerű fehérje, β-1,3- glukanáz Bentonit abszorbeálja ezeket a fehérjéket Élesztő fehérjék (pl.: mannoproteinek) okolhatók a zavarosság fennmaradásáért

216 Habképződés Pezsgő borok esetén Pozitív korreláció a fehérje koncentráció és a habképződés között Fehérje degradáció csökkenti a habképződést Patogén gombák (Botrytis cinerea) negatív hatás a hab stabilitására (gomba proteázok hidrolizálják a bor fehérjéit)

217 Bentonit szintén csökkenti a hab képződést és stabilitást, mivel a megköti a fehérjéket Mannoproteinek (élesztőből): elősegítik a habképződést (sörben is)

218 Nyomon-követhetőség Jó minőségű borok eredetigazolása fontos Milyen típusú szőlő és földrajzilag honnan származik Többféle komponens alapján lehetséges az azonosítás, fehérjék alapján is Módszerek: natív-gélelektroforézis, kapilláris gélelektroforézis, SDS-PAGE, MALDI

219 Nem bor eredetű fehérjék Fehérje-alapú derítőanyagok használata Segítségükkel eltávolíthatóak az üledékek P.: glutén, tej kazein, tojás ovalbumin Gyakori allergének ELISA és Western blot használata elterjedt, de a detektálási limit túl magas (100ug/liter) MS-alapú módszerek kezdenek elterjedni, sokkal érzékenyebbek

220 Kombinatorikus peptid ligand könyvtárakkal 1ug/liter kazein mennyiség kimutatható Fehér borban inkább kazeint használnak, vörös boroknál albumint (tojásból) Olasz vörösboroknál egy kísérlet során csak kazeint találtak derítőanyagként (nincs feltüntetve az üvegen)

221 Botrytis cinerea patogén penészgomba, nagyon elterjedt szürkerothadást okoz, kedvező feltételek mellett nemesrothadást szőlő és a bor esetén is minőségi és mennyiségi veszteség egyaránt Pezsgő borok esetén csökkenti a hab stabilitását A 2D és 1D géleken számos fehérje eltűnik a fertőzött mintákból, ok: proteolízis, megváltozott expresszió a gombafertőzés miatt

222 Fermentáció Alkoholos erjedés Komplex folyamatok: mikrobiológiai és biokémiai Saccharomyces cerevisiae központi szerepet játszik Fermentáció során változnak a környezeti feltételek Az élesztő proteom összetétele is megváltozik az alkalmazkodás során

223 Fermentációs stressz hatása: - represszált fehérjék: folding és stressz fehérjék, fehérjeszintézis fehérjéi, szénhidrát metabolizmus fehérjéi - indukált fehérjék: fehérje szintézis és degradáció, szénhidrát metabolizmus - proteolízis

224 Kombinatorikus peptid ligand könyvtár A különböző italok esetén leggyakrabban használt eljárás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentésére, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítására gyöngy technológia (2005) Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

225 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal Borok esetén a derítőanyag komponenseinek kimutatására használják

226 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Mi okozza a bor opálosságát? A habképződés és a proteom között mi a kapcsolat? A Botrytis milyen módon hat a szőlő fehérje expresszióhára? Felhasznált és ajánlott irodalom Proteomics in foods Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. Zoel Salvado és mtsai. (2008): Proteomic evolution ofawineyeast during the first hours of fermentation. FEMS Yeast Res 8, Clara Cilindre és mtsai. (2007): Influence of Botrytis cinerea infection on Champagne wine proteins (characterized by two-dimensional electrophoresis/immunodetection) and wine foaming properties. Food Chemistry 103, S. VINCENZI és mtsai. (2011): Protein evolution during the early stages of white winemaking and its relations with wine stability. Australian Journal of Grape and Wine Research 17, 20 27,

227 A gabonafélék és proteomjuk

228 Az előadás vázlata A gabonafélék szerepe A búza endospermium fehérjéi Elektroforézis és MS spektrum értelmezése Liszt, csíra, korpa Környzetre reagáló gabonafehérjék Allergének

229 Gabona Az emberiség fő táplálkozási alapanyaga kezdetektől fogva - kenyérgabonák Szemtermésük magas energia, vitamin és ásványi anyag tartalommal jellemzhető E1-, B1-, B2-, B6-vitamin, niacin, magnézium, kalcium, cink Magas rosttartalom, mely a bélműködést, emésztést felszívást segíti A teljes magokból készült termékek jelentősen több vitamint és ásványi anyagot tartalmaznak

230 Fontosabb gabonafélék Sikérképző fehérjéket tartalmaznak Búza, rozs, árpa, zab Sikérképző fehérjéket nem tartalmaznak Rizs, köles, cirok, kukorica Alternatív gabonafélék Hajdina, amaránt

231 Búza Búzafehérjék: albumin (leukozin), globulin (edesztin), prolamin (gliadin), glutelin (glutenin), nukleoproteidek Sikér: gliadin + glutenin Búzaszem felépítése: - külső réteg: maghéj - csíra - endospermium

232 Búzaszem ph 3-10 Forrás:Guo H, Zhang H, Li Y, Ren J, Wang X, et al. (2011) Identification of Changes in Wheat (Triticum aestivum L.) Seeds Proteome in Response to Anti trx s Gene. PLoS ONE 6(7): e doi: /journal.po ne

233 Belső táplálószövet Endospermium Emberi táplálkozás szempontjából ez a legfontosabb része a búzaszemnek Endospermiumból készül a liszt Leginkább tanulmányozott magrész Endospermium fehérjéi határozzák meg a lisztből készült tészta rugalmasságát, nyújthatóságát, levegő tartási képesség

234 Tároló fehérjék: Gliadin: nagyon polimorf fehérje csoport Globulinok és triticinek: kisebb gyakoriság Rovarok és gombák elleni védekezés: amiláz és proteáz inhibítorok Amfipatikus fehérjék: pl. membrán fehérjék - néhány amfipatikus fehérje az endospermium fehérje mátrixa és a keményítő szemcse között helyezkedik el, befolyásolja a mag keménységét és végső soron a tészta tulajdonságait

235 Gliadinok különböző búzafajtákban Forrás: Lagrain B, Brunnbauer M, Rombouts I, Koehler P (2013) Identification of Intact High Molecular Weight Glutenin Subunits from the Wheat Proteome Using Combined Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. PLoS ONE 8(3): e doi: /journal.pone

236 Gliadinok azonosítása RP-HPLC-ESI- MS-sel Forrás: Lagrain B, Brunnbauer M, Rombouts I, Koehler P (2013) Identification of Intact High Molecular Weight Glutenin Subunits from the Wheat Proteome Using Combined Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. PLoS ONE 8(3): e doi: /journal.pone

237 Liszt A liszt fehérjék befolyásolják a keverési és sütési tulajdonságokat Fő vízoldékony fehérje frakció: - glutenin polimerek (nagy molekulasúlyú és kis molekulasúlyú alegység) és gliadin monomerek - a legtöbb vizsgálat ezekre irányult (2D PAGE, MS) - azonosításuk MS-sel nehézkes, mert a homológ fehérjék a hexaploid búza 3 genomjából származhatnak - legtöbb glutén fehérje csak a búzára jellemző, így pl. rizs szekvencia adatbázisok nem használhatók az azonosításnál

238 Amiláz és proteáz inhibítorok: szintén nagy gyakoriságú fehérjék, fontos esszenciális aminosav források Manapság a kisebb gyakoriságú fehérjék azonosításával foglalkoznak inkább: albuminok, globulinok A lisztfehérjék vizsgálata a lisztérzékenység és egyéb allergiás betegségek kapcsán is fontos

239 Csíra A búzamag embrionikus szövete Növekvő érdeklődés a fogyasztók részéről 2D-PAGE képe már elkészült (Mak et al.,2006) Az azonosított fehérjék kétharmada az embrió növekedésével és fejlődésével volt összefüggésben Stresszhez köthető fehérjék nagy mennyiségben, ellentétben az endospermiummal

240 Csírázás: csökkenő expressziós szintet mutat: - energiatermelő folyamatokhoz - fehérje szintézishez - jelátviteli mechanizmusokhoz - stressz-hez köthető folyamatokhoz - metabolizmushoz kapcsolódó fehérjék megemelkedett expressziós szintet mutat: - energia és fehérje degradációhoz kapcsolódó fehérjék

241 Búzakorpa Nagyrészt: terméshéj + aleuron (fehérje tartalmú szemcse) Proteomikai analízis eredménye: - külső réteg: baktériumok és gombák elleni védekezésben szereplő fehérjék - belső réteg: 7S globulin tároló fehérje, oxalát szekretáló bacik ellen Aleuron réteg: lizinben gazdag fehéjék, magas vitamin és ásványianyag tartalom

242 Tészta, kenyér Hab-képző oldható fehérjék: - a kelt tésztában kialakuló gázbuborékok stabilizálása és a kenyér belső szerkezetének kialakítása - béta-amiláz, tritin, szerpin - ezek a fehérjék egy elasztikus bélést alkotnak a gázbuborékok körül, a tészta integritását biztosítják - prolamint (tároló fehérje) és puroindolint (felület-aktív fehérje) nem azonosítottak

243 Proteomikai vizsgálatok gyakorlati jelentősége Proteomikai módszerekkel betekintést nyerhetünk: - gabonaszemek fejlődésének, táplálkozási jellemzőinek szabályozásába - biotikus és abiotikus stressz hatások okozta változásokba Aboitikus stressz vizsgálata kiemelt fontosságú a globális klímaváltozás szignifikánsan befolyásolja a mezőgazdaságot és az élelmiszeripart

244 A fehérje vizsgálatok segíthetik a klimatikus faktorok által okozott változások megértését: - fotoszintetikus stressz - légszennyezés - hő és hideg stressz - ozmotikus stressz (aszály, árvíz) - fém stressz Megszüntethető vagy csökkenthető ezen faktorok negatív hatása az élelmiszer előállításra

245 Abiotikus stressz Búzaszemeken vizsgálták a hőstressz, a hideg, a szárazság, és a só hatását 2D PAGE gélen több mint 140 fehérjét azonosítottak 124 fehérje expressziójában történt változás valamilyen stressz hatására Segíti a stressz tolerancia és adaptálódás megértését Markerek azonosítása, későbbi szelekcióban hasznos

246 Kukorica szárazságtűrése A szárazságra adott válasz megértése az első lépés a toleráns fajták termesztésében Dehidratációra való érzékenység szempontjából két fajtát vizsgáltak Védekező és stresszhez kapcsolódód fehérjék expressziója nő mindkét fajtánál, de a védekező fehérjék szintje a szenzitívnél kevésbé nőtt meg, mint a toleránsnál Fehérjeszintézis szintje alacsonyabb a szenzitívnél

247 Kontroll Szenzitív genotípus Szárazság - stressz Forrás: Benešová M, Holá D, Fischer L, Jedelský PL, Hnilička F, et al. (2012) The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi: /journal.po ne

248 Kontroll Toleráns genotípus Szárazság - stressz Forrás: Benešová M, Holá D, Fischer L, Jedelský PL, Hnilička F, et al. (2012) The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi: /journal.po ne

249 Forrás: Benešová M, Holá D, Fischer L, Jedelský PL, Hnilička F, et al. (2012) The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi: /journal.po ne

250 Árpa A sörkészítés legfontosabb alapanyaga A legnagyobb gyakoriságú fehérjék a sörben: hordeinek, melyek az árpából származnak Hordeinek az allergén fehérjék az árpában Árpán vizsgálták az aluminium-mérgezést, mely a savanyú talajok esetén fontos limitáló faktor

251 Árpa 2D- PAGE kép Forrás: Dai H, Cao F, Chen X, Zhang M, Ahmed IM, et al. (2013) Comparative Proteomic Analysis of Aluminum Tolerance in Tibetan Wild and Cultivated Barleys. PLoS ONE 8(5): e doi: /journal.p one

252 Allergének Glutén tartalmú ételek fogyasztása egyre több embernél okoz egészségügyi problémát Búza/glutén érzékenység/intolerancia, lisztérzékenyég, glutén allergia: csalánkiütés, emésztőrendszeri problémák, depresszió, ekcéma, alacsony vas mennyiség a vérben, autoimmun (lisztérzékenység), anafilaxiás hiperszenzitivitás

253 Az allergén fehérjék azonosításával foglalkozó tudományterület: allergenomics Az allergén forrás fehérjéit szolubilizálják erős anionos detergenssel és ureával Fehérjék elválasztása: 2D PAGE IgE-reaktív fehérjék detektálása allergiás páciensek szérumával (immunoblottal) Kandidáns allergének azonosítása MS-sel

254 LC-MS/MS: késztermékekből az allergén búza fehérjék ill. a nem-búza eredetű összetevők szintjének meghatározása

255 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Mi az amfipatikus proteinek szerepe? Az abiotikus stressz hatást gyakorol a gabona proteomjára? Milyen módon játszik szerepet a proteomika a gluténmentes étkezésben? Felhasznált és ajánlott irodalom Guo H. és mtsai. (2011): Identification of Changes in Wheat (Triticum aestivum L.) Seeds Proteome in Response to Anti trx s Gene. PLoS ONE 6(7): e Dai H. és mtsai. (2013): Comparative Proteomic Analysis of Aluminum Tolerance in Tibetan Wild and Cultivated Barleys. PLoS ONE 8(5): e Proteomics in foods Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. Benešová M. és mtsai. (2012): The Physiology and Proteomics of Drought Tolerance in Maize: Early Stomatal Closure as a Cause of Lower Tolerance to Short-Term Dehydration? PLoS ONE 7(6): e38017.doi: /journal.pone

256 Gyümölcsök és expresszált fehérjéik

257 Az előadás vázlata Gyümölcsfogyasztás Érés során bekövetkező változások vizsgálata Tárolás során történő változások Különböző tárolási körülmények hatása Allergének

258 Gyümölcsfogyasztás Magyarországon: 73kg/fő/év (2013) csökkenő tendenciát mutat Átlag európai: napi 220g Ajánlott mennyiség: g/nap

259 Karotinoidok, B- és C-vitamin Kálium, kalcium, vas, foszfor Magas rost és víztartalom Élettani hatások: szív és érrendszeri betegségek, daganatos megbetegedések, hiánybetegségek megelőzése A kiegyensúlyozott táplálkozás része a napi gyümölcsfogyasztás

260 Kémiai összetétel Száraztermésű, héjas gyümölcsök Víztartalom: alacsony (6-9%) Fehérjetartalom: 18-27% Szénhidráttartalom: 4-24% Zsírtartalom: 50-60%

261 Lédús gyümölcsök Víztartalom: 75-90% Fehérjetartalom: nagyon alacsony 0,1-1,3%, nem teljes értékű fehérjék Szénhidráttartalom: 4-24% Zsírtartalom: nem jelentős

262 Proteomikai vizsgálatok Érés során bekövetkező változások monitorozása Tárolás során hogyan változik a fehérje összetétel Hő, hideg, anaerob körülmények hatása

263 Érés során bekövetkező változások Az érés a gyümölcsök fejlődésének utolsó fázisa Biokémiai, fiziológiai és gén expressziós változások történnek Klorofillok degradálódnak Karotinoidok és antociánok szintetizálódnak Etilén receptorok degradálódnak Sejtfalak meglágyulnak A keményítő egyszerű cukrokká alakul Illóanyagok keletkeznek

264 Citrusfélék Legfontosabb örökzöld gyümölcsök a világpiacon Évi 105 millió tonna Felhasználásuk széleskörű Fontos C-vitamin forrás Bogyótermés: egyedülálló anatómiai struktúra Héjrész (exocarpium + mesocarpium) Endocarpium: lédús mirigyszőrök

265 Módszer: LC MS/MS Narancs - változások az érés során - Metabolikus enzimek: - invertáz szint nem változik, viszont egy invertáz inhibítor expressziós szintje megnő az érés végső fázisában - szacharóz foszfát szintáz és szacharóz 6-foszfát foszfatáz szint növekszik magas szacharóz szint a gyümölcsben - citromsav: aminosav és cukor szintézisben hasznosul

266 Eper Egyik legnépszerűbb gyümölcs, magas antioxidáns tartalom Módszerek: 1D, 2D, DIGE, nlc-ms Fehérje referencia térkép már elkészült 3 fázisát különböztették meg az érésnek Az érés fázisai során változik a fehérje expresszió: - energia és szénhidrát metabolizmus - stressz válasz - sejtalkotók szintézise - transzkripció

267 Szőlő Szőlő fehérjék: - Kis mennyiség: mg/liter - Heterogének - Az érés kezdetét követően nő a fehérje-mennyiség - Fő komponensek: 34% Energiaháztartás 19% Patogenezishez köthető fehérjék (védekezés, stressz, betegségek) 13% Metabolizmus

268 Nem csak táplálkozási szempontból, hanem a borkészítés kapcsán is végeznek vizsgálatokat Borkészítés során a szőlő fehérjéi (kivéve patogenezishez köthető fehérjék): - denaturálódnak (savas ph miatt) - degradálódnak (proteázok) - precipitálódnak Patogenezishez köthető fehérjék: kitináz, osmothin, β-1,3-glukanáz, thaumatin-szerű fehérjék Szerepük: gombák ellenei védekezés

269 Szőlőszemek érése során bekövetkező változások vizsgálata: - fotoszintézis, szénhidrát metabolizmus, stressz válasz fehérjéinek expressziója nő a szemek színváltozásának kezdetén - a színváltozás végén az antocián szintézis fehérjéi overexpresszálódnak a termés héjban - a szüretet követően a patogenezishez köthető fehérjék a legdominánsabbak

270 O2 Tárolás során alkalmazott kezelések, melyek célja a szavatossági idő meghosszabbítása

271 Őszibarack - hőkezelés hatása - Rövid szavatossági idő Több eljárás létezik, amivel meghosszabbítható a szavatosság pl.: - hűtve tárolás - módosított nyomásviszonyok - ehető bevonat - hőkezelés Hőkezelés: 48 C-os vízbe merítés 10 percig, további tárolás szobahőmérsékleten

272 Hogyan változik hő hatására az őszibarack fehérje összetétele? - reaktív oxigén gyökök metabolizmusa csökken - növekszik a kis molekulasúlyú stressz fehérjék mennyisége - néhány allergén fehérje mennyisége csökken - negatív hatás a glikolitikus útvonalra (csökkent energiatermelés) - a sejtfal integritásának fenntartásában részt vevő fehérjék expressziója nő

273 Pomelo - hűtve tárolás hatása - Alacsony hőmérsékletnek számos pozitív hatása van a gyümölcsök tárolása során: - organikus savak és vitaminok mennyisége magasabb - a gyümölcsök húsa keményebb Overexpresszió: - stressz válasz fehérjéi - metabolizmust gátló fehérjék - metabolitok transzportját gátló fehérjék Az alacsony hőmérséklet okozta stressz jelátviteli folyamatában a kalcineurin B-szerű fehérje és a protein kinázok komplexe fontos szerephez jut

274 Mandarin - hűtve tárolás hatása - 4 C-on 85-90%-os páratartalom 2D-PAGE + MALDI-TOF-TOF MS 74 fehérje expressziója változott meg a tárolás során C-komponensek és szénhidrát metabolizmus Aminosav metabolizmus Dehidrin dehidrációért felelős, a tárolás késői szakaszában halmozódik fel Betegség rezisztenciával kapcsolatos fehárjék overexpressziója, nagyon fontos a tárolás során

275 Anaerob stressz hatása Citrusféléken vizsgálták Tárolás során gyakran ki vannak téve anaerob viszonyoknak pl: olyan bevonat, ami nem engedi át a gázokat, elégtelen ventillációjú tárolási helyiség, műanyag zsákok 10% O2 alatti és 5%CO2 feletti mennyiséget a citrusfélék nem tudnak tolerálni, anaerob respiráció nő, etanol és acetaldehid akkumulálódik, ízetlen lesz a gyümölcs

276 Intens. [a.u.] Mandarin különösen érzékeny, mert a héja kevésbé permeábilis a gázokra Módszer: 2D-PAGE + HPLC/MS/MS x Mandarin és grapefruit Külső héj (flavedo) és gyümölcshús Kezelés: 24 h, N2 atmoszféra/ levegő m/z

277 Héj proteom változása az anaerob stresszre : - mandarin és grapefruit esetén is a stresszhez köthető fehérjék - pl.: dehidrinek, szuperoxid-dismutase, lipoxigenáz - oxidoreduktáz (reaktív oxigén gyökök detoxifikálása) szint a N2-es grapefruitban magasabb, mint a mandarinban, ezzel magyarázható, hogy a grapefruit jobban ellenáll az anaerob stressznek

278 Gyümölcshús proteom változása az anaerob stresszre: - fehérje expressziós változás az energia termelésben, sejt ciklusban, sejt károsodás elleni folyamatokban - mandarinban nagyobb változások

279 - 10-szeres expressziós különbséget azonosítottak az alkohol dehidrogenáz fehérje esetén a kezelések között a mandarin mintáknál, ez is bizonyítja a mandarin anaerob stressz érzékenységét - a kis hőstressz fehérjék (HSP) mennyisége is a mandarin esetén mutatott magasabb értéket

280 Alma - etilén hatása - Növényi hormon, etilén gyorsítja a gyümölcsök érését Az alma érése során is termelődik etilén Etilén kezelés indukálja a gyümölcs etilén termelését Vizsgálati módszer: 2D-PAGE + LC/MS/MS Etilén hatására növekszik azon fehérjék expressziója, melyek normál érés során nem jelennek meg Néhány fehérje expressziója csökken, pl.: glikolitikus útvonal utolsó néhány lépésének enzimje

281 Kivi - ózon - Az ózon sejthalált és sejtkárosodást indukáló sejteket aktivál Ózon kezelés megakadályozza a bakteriális leromlást és néhány betegség kialakulását Segíti az etilén oxidációját a tároláskor, szacharóz degradációt stimulálja, antioxidánsok termelését serkenti

282 Vizsgálati módszerek: SDS-PAGE + LC/MS Az ózon blokkolta a gyümölcsök etilén termelését, késleltette az érést, stimulálta az antioxidáns és szabadgyök képződést Az érés indukálja a fehérjék karbonilációját, de az ózon gátolja ezt a folyamatot A kivi kandidáns fehérjéinek nagy része érzékeny a karbonilácóra, ezért képes az ózon késleltetni az érést

283 Éretlen vs. érett Banán Vizsgálati módszer: 2D-DIGE + MS Kitinázok: - legnagyobb gyakoriság az éretlen gyümölcsben - többféle izoforma - patogének elleni védekezés + növekedési és fejlődési folyamatok - non-catalytic class III acidic kitináz mennyisége csökken az érés során (aminosav forrás a fehérje szintézisben)

284 - másik két izoforma expressziója azonban növekszik, patogének elleni védekezésben fontosak Pectát-liáz: pectint bont, ami a sejtfal fő komponense, csak mérsékelt szerep a gyümölcs puhaságában Érett banánban a keményítőt bontó enzim overexpresszálódik, édes íz kialakításban van szerepe Érett banánban a hősokk fehérjék mennyisége is nagyobb Ezek a fehérjék mind nagy mértékben befolyásolják az érett banán minőségét

285 Vérnarancs vs. narancs Vérnarancs: likopin és antocián akkumuláció 11 fehérje csoportban találtak expressziós különbséget: pl.: - cukor metabolizmus (vérnarancs) - stressz válasz (narancs) - aminosav metabolizmus (narancs) - oxidatív folyamatok (vérnarancs) - transzport (vérnarancs) - védekezés(vérnarancs) - sejtalkotók biogenezise (narancs)

286 Fehérje csoportok 2/3-a a vérnarancsban mutat overexpressziót - Valószínű ok: magas antocianin szint - Antocianin bioszintézis és a hozzá kapcsolódó útvonalak változtatják meg a fehérje expressziót A stressz válasz fehérjéi a másik csoportban mutattak magasabb expressziós szintet - Valószínű ok: a vérnarancs az antocianin szint növelésével reagál a rossz környezeti feltételekre, míg a normál narancs a stressz fehérjék szintézisével

287 Allergének Allergiás reakciók elkerülésének érdekében, meg kell határozni mely növény okozza a tüneteket Egy növény számos allergént tartalmazhat Kb. 350 ismert allergén létezik Leggyakrabban tároláshoz kapcsolódó fehérjék, enzimatikus és szerkezeti fehérjék okoznak allergiás reakciót

288 Allergének kimutatása: Western blot ELISA 2D PAGE + MS Protein microarray LC-MS/MS

289 Gyakori fehérje allergének: - patogenezishez kapcsolódó fehérjék (PR-10): alma, eper, cseresznye, répa, körte, mogyoró - profilin, aktin kötő fehérje: körte, ananász, banán, alma, eper, répa, cseresznye, mangó - nem-specifikus lipid transzfer fehérjék: barack, kivi, alma, mogyoró, kukorica, cseresznye

290 Témakörhöz kapcsolódó kérdések A hőkezelés miként befolyásolja az őszibarack proteomját? A környezet befolyásolja a gyümölcshéj fehérjéit? Felhasznált és ajánlott irodalom Tatiana Torres Toledoa és mtsai. (2012): Proteomic analysis of banana fruit reveals proteins that are differentially accumulated during ripening. Postharvest Biology and Technology 70, Vera Muccillia és mtsai. (2009): Proteome analysis of Citrus sinensis L. (Osbeck) flesh at ripening time. Journal of proteomics 73, Jian Xin Shi és mtsai. (2008): Effects of anaerobic stress on the proteome of citrus fruit. Plant Science 175, Ioannis S. Minas és mtsai (2012): Physiological and proteomic approaches to address the active role of ozone in kiwifruit post-harvest ripening. Journal of Experimental Botany, Vol. 63, No. 7, pp

291 Zöldségek fehérjéi élelmiszeripari szempontból

292 Az előadás vázlata Zöldségfogyasztás élettani hatásai Változások az érés során Tárolás hatása a fehérje összetételre Hagyományos vs. biotermelés Kombinatorikus peptid ligand könyvtárak

293 Zöldségfogyasztás Magyarország átlagfogyasztása: - 90kg/fő/év - Európában átlagosnak tekinthető - szegényes az összetétele: nagyrészt paradicsom, paprika, káposzta, vöröshagyma Világátlag: 1970 és 2000 között 60kg-ról 105kg/fő/évre nőtt Ajánlott napi bevitel: dkg

294 Élettani hatásuk Nem csak biológiai energiaforrás, hanem értékes tápanyag Általában fehérjékben szegények (kivéve: borsó, bab) Ásványi anyagok közül a kálium a legjelentősebb, ezenkívül: foszfor, kalcium, magnézium, nátrium, vas Vitaminok: D- és B12-vitamin kivételével az összes vitamin

295 Zöldségek termésének érése Biokémiai, fiziológiai és gén expressziós változások történnek Klorofillok degradálódnak Karotinoidok és antociánok szintetizálódnak Etilén receptorok degradálódnak Sejtfalak meglágyulnak A keményítő egyszerű cukrokká alakul Illóanyagok keletkeznek Ízanyagok akkumulálódnak

296 Paradicsom Világszerte elterjedt zöldségféle Régóta használják modell szervezetként: - genetikai - fiziológiai - fejlődéstani - termés érési vizsgálatokban

297 Éretlen, közepesen érett, érett: - pektinészteráz és GTP-kötő fehérje, ezek a sejtfalak puhulásában és ezáltal a paradicsom keménységében vesznek részt - specifikus marker fehérjék, mennyiségük nő az érés során

298 Koktélparadicsom: - fejlődés és érés vizsgálatok - a poliakrilamid gélen lévő fehérje spotok 8%-a mutatott expressziós különbséget az érés során - az érés kezdeti szakaszában: aminosav metabolizmus és fehérje szintézis - szénhidrát metabolizmushoz és oxidatív folyamatokhoz kapcsolódó fehérjék overexpressziója az érett gyümölcsben éri el a maximumot

299 Bab és borsó A két legfontosabb hüvelyes zöldségféle a humán táplálkozásban Mindkettőnek elkészült a 2D-PAGE térképe Borsó esetében több tanulmány a kórokozók (pl. lisztharmat) hatását vizsgálja a proteom összetételre Babszemben leggyakoribb fehérjék: phaseolin, fitohemagglutinin és a lektinhez kapcsolódó alfa-amiláz inhibitor

300 Oliva Gazdaságilag fontos növény, az olivaolaj alapanyaga Az olivaolaj zsírsavösszetétele (telítetlen zsírsavak aránya magas) miatt kedvelt tápanyagforrás, rákmegelőző hatása közismert Az olaj minősége a bogyóban lejátszódó felépítő és lebontó folyamatok függvénye

301 Olivabogyó különböző fejlődési szintjeinek összehasonlítása: - vizsgálati módszer: 2D PAGE + MALDI TOF - változások a fehérje expresszióban: +aminosav metabolizmus +sejtciklus +energia és szén metabolizmus +lipid szintézis +fotoszintézis +fehérje szintézis +stresszválasz +allergének +almasav enzim akkumulációja az olajképződéssel pozitív korrelációban van

302 45 nappal a virágzás után 110 nappal a virágzás után 150 nappal a virágzás után Forrás: Bianco L, Alagna F, Baldoni L, Finnie C, Svensson B, et al. (2013) Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e doi: /journal.pone

303 Forrás: Bianco L, Alagna F, Baldoni L, Finnie C, Svensson B, et al. (2013) Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e doi: /journal.pone A gélképen a különböző expressziós szintet mutató fehérjék vannak jelölve

304 Expressziós különbséget mutató fehérjék csoportosítás Forrás: Bianco L, Alagna F, Baldoni L, Finnie C, Svensson B, et al. (2013) Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e doi: /journal.pone

305 Paprika - hűtve tárolás - Leszedést követően amint lehet le kell hűteni (kb. 7,5 C-ra) A paprika érzékeny a hideg tárolásra Ha 7 C-nál alacsonyabb hőmérsékleten tartjuk: - lyukak jelennek meg a felszínén - magok megbarnulnak - elszíntelenedik - nedvességtartalma csökken - másodlagos hatás: reaktív oxigéngyökök szabadulnak fel

306 10 C-on tárolt vs. 1 Con tárolt Vizsgálati módszer: 2D DIGE + MALDI-TOF MS Szemmel látható változások az 1 C-on tárolt esetében + fokozott etilén termelés

307 Peroxiszómák száma csökken ezáltal az egyik antioxidáns enzimfehérje szintje is, mely a peroxiszómában lokalizálódik Fő különbségek: - redox homeosztázisban - szénhidrát metabolizmusban Glikolízis, Calvin-ciklus, Krebs-ciklus enzimjei gátlódnak a hűtve tárolás során

308 Enoláz és gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz fehérjék a fő okozói a hűtés során kialakuló károsodásokért Citoszolban lévő malát-dehidrogenáz (MDH) is részt vesz az abiotikus stressz kialakításában ebben a vizsgálatban bizonyították először, korábban csak a plasztiszokban lévő MDH-t tudták ehhez a stressz típushoz kapcsolni

309 Paradicsom esetén is megfigyelhető a hűtve tárolás káros hatása (pl.:gumiszerűvé válik) A hűtve tárolás hatása: - éréshez kapcsolódó fehérjék exp. csökken (pl. savas invertáz) - fagy toleranciáért felelős fehérjék exp. nő - kis hősokk fehérjék exp. Nő - sejtfal fehérjék exp. változik: β-galaktozidáz szint nő, poligalakturonáz szint csökken

310 Cukorrépa - só stressz - Hajtás és a gyökér setében vizsgálták a só stressz hatását Módszer: 2D-PAGE A legtöbb fehérje nem mutatott változást a só stressz hatására, expressziójuk stabil maradt Hajtás: 6 fehérje expressziója változott Gyökér: 3 fehérje expressziója változott De ezek nem kapcsolhatók a sóhoz való alkalmazkodáshoz

311 Burgonya - változások a tárolás során - A tárolás befolyásolja a rügyezést, mely a későbbi hozamra van hatással Vizsgálati módszer: 2D-DIGE + MS/MS Változások a tárolás során: - keményítő metabolizmusban - fehérje konformáció szabályozása - fehérjék újrahasznosításában - stressz válaszban Radikális szabadgyök semlegesítés, így az oxidatív károsodások nem halmozódnak fel a tárolás során

312 Hagyományos vs. bio termelés Bio termelés esetén: - magasabb szárazanyag tartalom - magasabb citromsav, fenol és cukor tartalom - kisebb nedvesség tartalom - kisebb nitrát és fehérje tartalom A bio termelés nagyon komplex hatással van a növények fiziológiás és minőségi tulajdonságaira, ezért nehéz vizsgálni

313 Burgonya esetén az szerves- és a műtrágya volt szignifikáns hatással a fehérje expresszióra: 160 fehérje esetén találtak expressziós különbséget: - 17 fehérje a műtrágyás csoportban mutatott overexpressziót fehérje expressziója növekedett meg a szerves trágyázás esetén

314 Különbségek: - fehérje szintézisben és turnover-ben - szén és energia metabolizmusban - védekezési válaszok, mely jelzi hogy a szerves trágyázás növeli a stressz választ

315 Káposzta minták esetén: - 58 fehérje esetében találtak expressziós különbséget a hagyományos és a bio termesztés összehasonlítása során - ez kb 5%-a az összes detektált fehérjének - ezek főleg a glikolízisben vesznek részt vagy ahhoz kapcsolódnak - a bio termelés esetén overexpresszálódtak - hagyományos termelés során a detoxikáláshoz kapcsolódó fehérjék expressziója nő

316 Répa: - 68 fehérje esetében találtak expressziós különbséget a hagyományos és a bio termesztés összehasonlítása során - szénhidrát és polipeptid metabolizmusra + a másodlagos metabolitok termelésére volt hatással a - bio termelés negatívan befolyásolja a chaperonok mennyiségét és a fehérjeszintézishez szükséges fehérjéket

317 Kombinatorikus peptid ligand könyvtár Zöldségekből származó minták esetében is komoly kihívás a nagy gyakoriságú fehérjék csökkentése, ill. a kis gyakoriságú fehérjék feldúsítása A kombinatorikus peptid ligand könyvtárak alkalmasak erre a feladatra: Gyöngyökhöz rögzített peptidek, melyekhez a mintában lévő fehérjék specifikusan tudnak kötődni (adszorpció)

318 3 típus: - hexapeptidek primer aminnal terminálva (ProteoMiner) - hexapeptidek carboxyl csoporttal - hexapeptidek harmadlagos amin csoporttal Spenót minták esetén sikeresen alkalmazták a kis gyakoriságú fehérjék esetén Olivabogyók esetén is sikerült feldúsítani a kisebb gyakoriságú fehérjéket ezzel a módszerrel

319 Témakörhöz kapcsolódó kérdések A paradicsom érettségét miként befolyásolják a fehérjék? A hűtve tárolás milyen változásokat okoz a zöldségek fehérje expressziójában? A biotermesztés befolyásolhatja a protemprofilt? Felhasznált és ajánlott irodalom Paloma Sánchez-Bel és mtsai. (2012): Understanding the mechanisms of chilling injury in bell pepper fruits using the proteomic approach. Journal of proteomics 75, Linda Bianco és mtsai. (2013): Proteome Regulation during Olea europaea Fruit Development. PLoS ONE 8(1): e doi: /journal.pone Arkadiusz Nawrocki és mtsai. (2011): Quantitative proteomics by 2DE and MALDI MS/MS uncover the effects of organic and conventional cropping methods on vegetable products. Journal of proteomics 74,

320 A hal, mint élelmiszer proteomikája

321 Az előadás vázlata Halfogyasztás Hamisítások kiszűrése Allergének vizsgálata Tenyésztett és vadvízi állományok összehasonlítása Post-mortem vizsgálatok Mikrobiális leromlás, patogének

322 Halfogyasztás Magyarországon évente átlagosan 4,5 kg/fő (élősúlyban) Európai Unióban évente átlagosan 22 kg/fő (élősúlyban) Világátlag: 13,5 kg/fő (élősúlyban)

323 Halfogyasztás pozitív élettani hatásai Magas az omega-3 zsírsavak aránya Magas fehérjetartalom Alacsony energiatartalom, mely az alacsony zsírtartalomnak köszönhető Vitaminok: A, D, E, B1, B2 Ásványi anyagok: jód, foszfor, nátrium, kálium, vas Szív- és érrendszeri megbetegedések megelőzésében fontos

324 Proteomikai módszerek felhasználásának lehetőségei Hamisítások kiszűrése Allergének vizsgálata Tenyésztett és vadvízi állományok összehasonlítása Post-mortem változások vizsgálata Mikrobiális leromlás, veszteség

325 Hamisítások kiszűrése Helyettesítés más fajjal Okok: olcsóbb, adók elkerülése Veszély!!! A különböző halfajták a leggyakoribb étel allergének! EU-ban szigorúan szabályozott jelölés a csomagoláson: - pontos fajmegnevezés - tenyésztett vagy vad vízi - származási hely

326 Néha még a szakértőknek is nehézséget okoz az azonos élőhelyen megtalálható nagyon közeli halfajok elkülönítése A feldolgozási eljárások során a külső anatómiai ismérvek alapján történő megkülönböztetés lehetetlenné válik Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a halfajok azonosítására

327 Fehérje alapú módszerek SDS-PAGE: Keenan és Saklee 164 különböző halfaj elkülönítése gyakori enzimfehérjék alapján - izomfehérjék alapján történő elkülönítés is lehetséges nyers és feldolgozott húsból egyaránt IEF: parvalbumin (Ca kötő fehérje az izmokban) nagyfokú variabilitást mutat a halfajok között

328 Standard Cápa Lazac Pisztráng Harcsa Tokhal Aktin és miozin Miozin nehéz lánc (210kD) Aktin (42kD) Tropomiozin (35kD) Miozin könnyű lánc 1 (21kD) Miozin könnyű lánc 2 (19kD) Audrey Dell Hammerich 10/2009

329 2D-PAGE: fehérje mintázatok összehasonlítása biomarkerek keresése - 3 tonhal faj elkülönítése, marker: triózfoszfát izomeráz - 4 sügér faj elkülönítése, marker: szarkoplazmatikus fehérjék - 9 laposhal faj elkülönítése, marker: szarkoplazmatikus fehérjék

330 Intens. [a.u.] MS alapú módszerekkel: MALDI-TOF, ESI-MS/MS - 25 kereskedelmi forgalomban kapható halfaj elkülönítése, marker: szarkoplazmatikus fehérjék - Merlucciidae család fajainak elkülönítése, marker: parvalbumin, nukleozid difoszfát kináz x m/z

331 Allergének A különböző halfajták nagyon gyakori étel allergének Immunoglobulin E által közvetített allergiás reakciók Életveszélyes is lehet (anafilaxiás sokk) EU-s szabvány: 14 leggyakoribb allergént fel kell tüntetni a csomagoláson Az élelmiszer feldolgozási folyamatok során kontamináció lehetséges

332 Feltétlenül szükséges a gyors, pontos, érzékeny és jó ismételhető allergén azonosítási módszerek kidolgozása A parvalbuminok (Ca kötő albumin) a legfontosabb allergének a halhúsban Biomarkerként használhatóak

333 MS-alapú módszerekkel parvalbumin szekvenciák monitorozása az élelmiszerekben Leggyorsabb és legmodernebb eljárás: High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) + Selected MS/MS Ion Monitoring (SMIM) + Linear ion trap (LIT) kevesebb mint 2 óra alatt elvégezhető

334 Tenyésztett vs. vadvízi Halak esetén is leggyakrabban az izomszövetet használják proteomikai vizsgálatokhoz: - könnyen begyűjthető - kereskedelmi szempontból is ez a szövet a legjelentősebb

335 A tenyésztett és vadvízi állományok izom proteomjának összehasonlítása során vizsgálhatjuk: - a tenyésztési módszerek - környezeti különbségek (víz minőség, hőmérséklet) - étrendek hatását Atlanti tőkehal: post-mortem degradáció a tenyésztettben gyorsabb, mivel genetikai távolság nincs köztük, ezért ez a különbség a környezeti különbségből adódik

336 Farkassügér: - Európa haltenyésztésének egyik fő terméke - kilenc fehérje expressziójában találtak különbséget - szénhidrát metabolizmus enzimjei a tenyésztett halaknál overexpresszálódtak - kreatin kináz, nukleozid difoszfát kináz B és a parvalbumin expressziója csökkent a tenyésztett állománynál tartási körülmények befolyásolják a tenyésztett állatok izom fejlődését

337 A vizsgálatok célja: termékek minőségének javítása

338 Tőkehal: - gyorsabb post-mortem degredáció a tenyésztett tőkehalban a húsa kevésbé kemény, magas a víztartalma, izomrostok szerkezete is különböző - lehetséges ok: tenyésztés során stressz - óriás laposhalban is ugyanezt figyelték meg - tenyésztett állatoknál különbségek a mitokondrium szerkezetében, megváltozott fehérje expresszió az metabolikus enzimek esetén, elégtelen zsírsav oxidáció, abnormális zsírsav lerakódás az izomban

339 Szivárványos pisztráng: dezmin fehérje (sejtváz fehérje) mennyisége kevesebb a tenyésztett állatokban, rosszabb húsminőség Tengeri sügér: glikolitikus enzimek és parvalbumin frakció között különbség, a tenyésztés hatással van az izom összetételre

340 Az izomszöveten kívül májból és vérből is lehetséges a fehérje vizsgálatok elvégzése. Szivárványos pisztráng: - az emelt szója tartalmú táp hatása a máj fehérje összetételére - rövid ideig tartó éhezés hatása a máj proteomra

341 Aranydurbincs: hideg hatására hogyan változik a máj proteomja hideg hatására a hepatocitákban oxidatív károsodások alakulnak ki Aranydurbincs: tenyésztés során fellépő stresszhatások következményeinek vizsgálata a máj proteom szintjén számos fehérje összefüggésbe hozható a stresszel

342 A vérplazma mintákat leggyakrabban az immunrendszer feltérképezésére használják a halak esetén.

343 Post-mortem változások Enzimatikus autolízis során a nagyméretű miofibrilláris fehérjék (miozin, aktin, titin) a proteázok enzimatikus aktivitásának hatására kis méretű peptidekre hasadnak Ez a folyamat nagymértékben meghatározza a hús ízét, textúráját és illatát A vágás előtti események (fizikai aktivitás, sűrűség, stressz) is hatással vannak az izom post-mortem tulajdonságaira (glikogén tartalom, ph csökkenés)

344 Nem enzimatikus módosítás: oxidáció - karboniláció, thiol-oxidáció, aromás hidroxiláció stb. - hatással vannak a halhús minőségére, mert megváltozhat a fehérjék oldahtósága, aggregációs képessége, hidrofobitása - 2D-PAGE segítségével detektálható a tárolás során növekedő oxidációs szint

345 Tárolási hőmérséklet: hatással van a proteolízis mértékére, alacsonyabb hőmérsékleten kevésbé aktívak a proteolitikus enzimek Tárolási idő: - Tőkehal: Mennyire friss a halhús? 16 kda nagyságú fehérje, mely a tárolási idő előrehaladtával degradálódik, eltűnik a gélképről - Durbincs: alfa-actin, tropomiozin 6. napig stabilak - Parvalbumin: allergén, mennyisége a tárolás során csökken

346 Különböző vizsgálatokból kiderült, hogy a tárolás időtartama nagyobb hatással van a halhús fehérje összetételére, mint a tárolási hőmérséklet

347 Különböző vágási technikák hatása az izomfehérjékre: - Asphyxia levegőn - Asphyxia jégben - Gerincvelő átvágása 2D-DIGE módszerrel vizsgálták Eredmény: gerincvelő átvágás biztosítja leginkább, hogy a fehérjék megőrizzék integritásukat (kevesebb stressz)

348 Mikrobiális leromlás, veszteség Az a folyamat, mely során különböző biokémiai változások történek mikrobiális aktivitás hatására Gazdasági veszteséget és súlyos élelmiszereredetű megbetegedéseket okozhatnak Aminok keletkeznek, melyek kellemetlen ízűek, vagy ízetlenné teszik a húst MS-alapú módszerekkel sokféle patogént lehet azonosítani nyers, füstölt, vákuum csomagolt halfélékből

349 Pl.: Listeria monocytogenes - liszteriózis kórokozója halálos kimenetel is lehetséges - egyik leggyakoribb élelmiszer útján terjedő baktérium - folyékony füst változást okoz a proteom összetételükben, csökkenti a növekedésüket és túlélésüket füsttel tartósított halfélék esetén ritka a liszteriózis

350 Egyéb, élelmiszer leromlást és emberi megbetegedést okozó baktériumok: Gram-negatív: Pseudomonas spp., Aeromonas hydrophila, Acinetobacter baumanii, Enterobacter spp., Campilobacter spp. Gram-pozitív: Carnobacterium spp., Clostridium spp., Staphylococcus spp.

351 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Mely területeken van indokoltsága a hal proteom vizsgálatának? A halfeldolgozás után (során) milyen fehérjeváltozások következnek be a halhúsban? Felhasznált és ajánlott irodalom Proteomics in foods Szerkesztők: Toldrá, Fidel; Nollet, Leo M. L. Mónica Carrera és mtsai. (2012): Proteomics for the assessment of quality and safety of fishery products. Food research international Tune Wulffa és mtsai. (2012): Time-dependent changes in protein expression in rainbow trout muscle following hypoxia. Journal of proteomics 75, Maria Filippa Addisa és mtsai. (2012): 2D DIGE/MS to investigate the impact of slaughtering techniques on postmortem integrity of fish filet proteins. Journal of proteomics 75,

352 Tömegspektrometriás alapok

353 Az előadás vázlata a tömegspektrometria helye a proteomikában tömegspektrometriás alapfogalmak a tömegspektrométer felépítése

354 A tömegspektrometria helye a proteomikában Gél alapú módszerek Tömegspektrometriás módszerek Egy- vagy kétdimenziós gélelektroforézis Fehérjék emésztése Peptidek elválasztása (kromatográfiás lépés) Fehérjék emésztése Fehérje mintázat vizsgálata Tömegspektrometriás analízis

355 Tömegspektrometria A tömegspektrométer felépítése Minta Elektronika Ionforrás Tömeg analizátor Detektor Adatfeldolgozó rendszer Vákuum rendszer Tömegspektrum

356 Tömegspektrometriás alapfogalmak a) Tömegspektrometriában használt tömegek Molekula tömegeket Da-ban vagy atomtömeg egységben mérik (amu) amu: 12 C atom 1/12-ed része Da: 16 O atom 1/16-od része. Relatív molekula tömeg (M r ) mértékegység nélküli, egy arány Th (Thomson): tömeg/töltés arány (m/z) tömeg tömeg/töltés probléma pl.1000 Da +1-es töltés esetén: = 1001 m/z +2-es töltés esetén: (1000+2):2 = 501 m/z Ionok m/z értéke: (Mw+n):n (n a töltések száma)

357 Tömegspektrometriás alapfogalmak b) Tömegpontosság a mért tömeg eltérése az igazi tömegtől Abszolút tömegpontosság: kísérleti - elméleti = ± X Da pl.: ± 0.2 Da Relatív tömegpontosság : relatív eltérés pl.: ± 200 ppm (± X Da / M elméleti) x 10 6 ppm pl. 100 Da tömegnél a ± 0.2 Da eltérés 20 ppm relatív eltérést eredményez: 0.2 Da / 100 Da x 10 6 = ± 20 ppm de 1000 Da esetében a ± 0.2 Da eltérés 200 ppm relatív eltérést eredményez: 0.2 Da / 1000 Da x 10 6 = ± 200 ppm

358 Tömegspektrometriás alapfogalmak c) Felbontás (R) R = m/z Δm/z A tömegspektrométerek felbontó képessége azt jelenti, hogy milyen tömegkülönbségű ionokat, egymástól milyen távolságra levő csúcsokat tud egymástól megkülönböztetni. Csúcs definíció: Peak width at half-height/ Full width at half maximum (FWHM) csúcsszélesség az intenzitás 50%-nál. Int (intenzitás) Int max Int max /2 FWHM x 1 x 2 x (m/z)

359 Intenzitás Tömegspektrometriás alapfogalmak Nagyobb felbontás jobb tömegpontosságot eredményez FWHM = 0,633 Th R = 4500 FWHM = 0,2 Th R = m/z

360 Tömegspektrometriás alapfogalmak d) Izotópok A legtöbb elemnek több mint egy stabil izotópja van pl. a C atomok 98,9%-nak tömege 12 Da és 1,1%-nak 13 Da. Miért fontos ez? Ha a tömegspektrométer felbontása elég jó, akkor ezeket az izotópokat is detektálja. Ha elég jó a felbontás, akkor az izotópok segítségével jobb tömegpontosság is meghatározható.

361 Tömegspektrometriás alapfogalmak Néhány elem izotópjainak előfordulása Elem Tömeg Előfordulási arány (%) H 1, ,985 D 2,0141 0,015 C 12,000 98,89 13,0034 1,11 N 14, ,64 15,001 0,34 O 15, ,73 16,9991 0,04 17,9992 0,20

362 Intentzitás C 1 elméleti spektruma Tömegspektrometriás alapfogalmak Izotóp klaszter C 10 elméleti spektruma C 100 elméleti spektruma Természetes előfordulás: 12 C: 98.9 % 13 C: 1.1 % Az atomok számának növekedésével nő annak a valószínűsége, hogy izotóp atomok legyenek jelen a molekulában. m/z

363 Intentzitás Tömegspektrometriás alapfogalmak Az izotóp mintázat változik a tömeg változásával m/z Ahogy a C-atomszám növekszik, úgy nő a nagyobb izotóp tömegű csúcsok relatív intenzitása is.

364 Intentzitás Intentzitás Intentzitás Tömegspektrometriás alapfogalmak Az izotópeloszlás segítségével meghatározható a töltés +1 0,5 0, ,5 1 m/z m/z 0,3 0,4 +3 0,3 0,3 m/z

365 Intentzitás Tömegspektrometriás alapfogalmak Monoizotópos tömeg Monoizotópos tömeg A legkönnyebb izotóp tömegével számolt tömeg A legpontosabb tömeg ( 1 H= , 12 C= , 16 O= ). Ez a legpontosabb tömeg és ha a készüléknek elég jó a felbontása, akkor ezt használják. m/z

366 Intentzitás Tömegspektrometriás alapfogalmak Átlagos tömeg Átlagos tömeg Az így számolt tömeg nem lehet olyan pontos, mint a monoizotópos tömeg A molekulát felépítő atomok átlagos tömegéből számolható. Az így kapott érték a természetes izotóp eloszlást tükrözi, a H =1.0080, C = , m/z O= stb. tömegeket használja.

367 Intentzitás Tömegspektrometriás alapfogalmak 2 x C 13 Az inzulin spektruma C 13 C 12 : 5730,61 Inzulin 257 C-atomos. Ezen tömeg felett a monoizotópos csúcsok intenzitása már túl kicsi ahhoz, hogy elég információval szolgáljanak, ezért már az átlagos molekulatömeget használják m/z

368 Intenzitás (%) Tömegspektrometriás alapfogalmak e) A tömegspektrometriás spektrum Báziscsúcs Átlagos tömeg Monoizotópos tömeg Báziscsúcs: a legintenzívebb csúcs ha az intenzitás %- ban van megadva, akkor a báziscsúcs intenzitása 100% m/z

369 A tömegspektrometriás analízis paraméterei - összefoglalás tömegpontosság: a mért tömeg eltérése az igazi tömegtől felbontás: két hasonló tömegű ion (csúcs) megkülönböztethetősége érzékenység: a mérendő anyag legalacsonyabb még detektálható mennyisége tömeg tartomány: a mérhető tömeg alsó és felső határa dinamikus tartomány: az a koncentráció tartomány amelyben az analit ion intenzitása lineárisan változik a koncentrációval mérési sebesség: adott idő alatt lemérhető minták száma izotóp klaszter: az elemek állandóan jelenlevő izotópjaiból származó eltérő tömeg sorozat monoizotópos és átlagos tömeg Tömegspektrometriás alapfogalmak

370 A tömegspektrométer felépítése 1.Minta Elektronika 2.Ionforrás 3.Tömeg analizátor 4.Detektor 5.Adatfeldolgozó rendszer Vákuum rendszer Tömegspektrum

371 A tömegspektrométer felépítése 1. A minta Minta típusa Minta bejuttatási formája Bejuttatás módja gáz gáz Elválasztást követően GC-MS Minta folyadék folyadék Elválasztást követően Közvetlenül (infúziós pumpa) LC-MS szilárd szilárd Közvetlenül (mintatartó lemez) MALDI-MS Proteomikában használatos mintabeviteli módok

372 a mintát alakítja át gáz fázisú ionokká A tömegspektrométer felépítése 2. Az ionforrás többféle ionizációs technika létezik mindig a szükséges információ és a minta jellege határozza meg az alkalmazott módszert Elektron ütközéses ionizáció (EI) Kémiai ionizáció (CI) Gyors atom bombázásos ionizáció (FAB) Atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (APCI) Termospray ionizáció (TS) Elektrospray ionizáció (ESI) Mátrix segített lézer deszorpciós ionizáció (MALDI) Deszorpciós elektrospay ionizáció (DESI)

373 A tömegspektrométer felépítése * Elektrospray ionizáció (ESI) szárító gáz (N 2 ) orifice (mintabemenet) minta oldat elektrospray kapilláris nagy feszültség (+) légköri nyomás nyomás, feszültség és hőmérséklet gradiens MS analizátor nagy vákuum a minta folyékony halmazállapotú többszörösen töltött ionokat eredményez nagy térfogattartományban (nl-ml) használható szükség van szárító gázra (nitrogén) lágy ionizációs technika oldószer cseppek párolgás szétrobbanása + + további robbanások és deszolvatált ionok keletkezése [M + nh] n+

374 Mintatartó lemez Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) - MALDI Minta A tömegspektrométer felépítése Lézer * MH Analizátor Detektor kv Mátrix mintát mátrixal együtt kristályosítják szilárd halmazállapotú a minta ionizációját a mátrix ionok segítik egyszeres vagy kétszeres töltésű ionok keletkeznek ún. lágy ionizációs technika

375 A tömegspektrométer felépítése 3. Az analizátor Tömeg analízist tesznek lehetővé, az ionokat m/z szerint elválasztják egymástól Többféle típus ismeretes pl. : Mágneses és elektrosztatikus Repülési idő analizátor (TOF) Quadrupole Ion csapda (3D, hibrid és lineáris) Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia Kiválasztásuk függ a(z): alkalmazástól költségtől kívánt teljesítménytől

376 Az ionok útja a repülési idő (Time-Of-Flight) TOF analizátorban A TOF analizátorban az ionok a kinetikus energiájuk és nagyságuk alapján vándorolnak A kisebb m/z-vel rendelkező ionok gyorsabban, a nagyobb m/z-vel rendelkező ionok lassabban mozognak az analizátorban Minél hosszabb az ionok útja, annál szebb elválást eredményez A TOF analizátor felbontása jó A tömegspektrométer felépítése TOF analizátor Ionforrás Detektor

377 A tömegspektrométer felépítése * A kvadrupól analizátor A kvadrupól négy elektródából áll, amelyekre feszültség kapcsolható A V RF és V DC feszültségek megfelelő kombinációja révén megadható, hogy a kvadrupól milyen ionokat enged át A kvadrupól felbontása nem olyan jó mint pl. a repülési idő analizátoré

378 Az ionok útja a kvadrupólban A kvadrupól elektródáira kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat enged át a kvadrupól A tömegspektrométer felépítése Kvadrupól Detektor A kvadrupól szelektíven stabilizál

379 A tömegspektrométer felépítése Az ionok útja az ioncsapdában Az ioncsapda stabilizálja minden bejutott ion mozgását és az elektródákra kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat destabilizál és enged ki Az ioncsapda szelektíven destabilizál Detektor

380 A tömegspektrométer felépítése Az ionok útja az Orbitrap analizátorban Az ionok többé-kevésbé körpályán mozognak Az ionok mozgása által keltett áramokat a külső elektród érzékeli (detektor) A regisztrált frekvenciákat Fourier transzformáció segítségével alakítják át spektrummá Nagyon jó felbontást lehet elérni en.wikipedia.org

381 A tömegspektrométer felépítése Egyszerű vs. tandem tömegspektrométer Egyszerű tömegspektrométer Ionforrás Tömeg analizátor Detektor

382 A tömegspektrométer felépítése Egyszerű vs. tandem tömegspektrométer Tandem tömegspektrométer Ionforrás Tömeg analizátor Ütközési cella Tömeg analizátor Detektor

383 A tömegspektrométer felépítése Tömegspektrométerek fajtái a készülékben alkalmazott ionforrás és tömeg analizátor típusa szerint lehet: MALDI-TOF MALDI-TOF-TOF MALDI/ESI-QTOF ESI-tripleQuad MALDI/ESI-Trap (3D, hibrid v. lineáris) ESI-Orbitrap ESI-FTICR..

384 Témakörhöz kapcsolódó kérdések A tömegspektrométer felépítése Az egyszerű és tandem tömegspektrométerek közötti különbség A tömegspektrometriás analízis paraméterei Felhasznált és ajánlott irodalom Michael Kinter, Nicholas E. Sherman: Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, Wiley-Interscience, New York, Chabil Dass: Principles and Practice of Biological Mass Spectrometry, Wiley- Interscience, 2001

385 A tömegspektrometria adta lehetőségek a fehérjék vizsgálatában, különös tekintettel az élelmiszerek ellenőrzésére

386 Az előadás vázlata fehérjék azonosítása tömegspektrométer segítségével fehérjék kvantitálása tömegspektrométer segítségével tömegspektrometriás technikák alkalmazása az élelmiszerek vizsgálata során baktériumok gyors azonosítása tömegspektrométer segítségével

387 Az élelmiszerek minőségének ellenőrzése rendszeres laboratóriumi vizsgálatokat igényel Élelmiszerbiztonság Élelmiszer előállítása Megfelelő biztonsági előírások betartása (HACCP) Rendszeres laboratóriumi vizsgálat A jelzett összetétel biztosítása Megfelelő tájékoztatás, eredetiségvizsgálat

388 Élelmiszerbiztonság Az a tudományág, amely az ételmérgezések elkerülése érdekében az élelmiszerek biztonságos tárolásával, előállításával és kezelésével foglalkozik en.wikipedia.org Ételmérgezés: élelmiszer eredetű megbetegedés, amely az élelmiszerek rendeltetésszerű használata esetén következik be. Okozhatják fizikai, kémiai és biológiai ágensek.

389 Tömegspektrometriás vizsgálatok az élelmiszerek ellenőrzése során Fehérje azonosítás: fajmeghatározás (pl. húskészítmények esetén) allergének meghatározása patogének meghatározása toxinok meghatározása

390 Tömegspektrometriás vizsgálatok az élelmiszerek ellenőrzése során Fehérje módosulások vizsgálata: élelmiszerek érésének nyomon követése (pl. sonka, kolbász, sajtok stb. érése során) különböző feldolgozási és tárolási folyamatok során bekövetkező esetleges minőségromlás vizsgálata

391 intenzitás intenzitás intenzitás Fehérjék azonosítása Intakt fehérje M W alapján Túl sok variációs lehetőség ritkán használható Fehérje azonosítás m/z m/z Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek m/z alapján PMF: peptide mass fingerprint Több variációs lehetőség ha van előzetes információ, használható. Közléshez nem elfogadott. Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek fragmentációja segítségével megállapított szekvencia alapján. Pontos információ, közléshez is elfogadott. m/z

392 Fehérje azonosítás tömegspektrometriával A fehérjéket tripszinnel emésztik Peptideket ionizálják és pontos tömegüket meghatározzák, hogy így azonosítsák a peptideket és fehérjéket (PMF), vagy ionokat választanak ki (anya ion/prekurzor ion) és fragmentálják őket (MS/MS spektrum) A keletkezett egyszeres töltésű ionokat (leány ionok) analizálják hogy a szekvenciát meghatározzák és azonosítják a peptidet, majd a peptidek segítségével a fehérjéket

393 Peptidek fragmentációja Az ütközési cellában történik, általában ütközés hatására Több típusa létezik, leggyakrabban a CID collision induced dissotiation ütközés indukálta disszociációt alkalmazzák Amikor a peptidek belépnek az ütközési cellába, akkor főként a peptid kötés mentén fragmentálódnak Minden egyes peptidre optimalizálni kell az ütközési energiát Ütközéses fragmentációkor főleg b és y típusú leány ionok keletkeznek

394 A b és y fragmens ionok y3 y2 y1 H 2 N Aminosav 1 Aminosav 2 Aminosav 3 Aminosav 4 COOH b1 b2 + + b3 H 2 N Aminosav 1 Aminosav 2 Aminosav 3 Aminosav 4 COOH b ion y ion y 4 y 3 y 2 y 1 MINTAPEPTID b 1 b 2 b 3 b 4

395 intenzitás intenzitás Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Komplex minta Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor MS spektrum MS/MS spektrum fragmentáció m/z m/z b és y sorozatok azonosítása Peptid szekvencia megállapítása Fehérje azonosítása

396 Komplex minta Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 1. Tömegspektrum (MS) felvétele Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor MS spektrum Prekurzor ion kiválasztása

397 Komplex minta Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 2. Töltöttségi fok meghatározása Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor +2 - Töltöttségi fok megállapítása - Megfelelő ütközési energia kiszámolása

398 Komplex minta Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 3. MS/MS spektrum felvétele Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor MS/MS spektrum Peptid fragmens ionok analízise

399 Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Információ függő adatgyűjtés: IDA information dependent aquisition/dda data dependent aquisition MS (EMS) Kizárási listák Töltöttségi fok Megállapítása (ER) MS/MS (EPI)

400 Intenzitás Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével A szekvencia meghatározása a spektrumban látható csúcsok különbségéből EPTID PEPTID PEPTI b 1 y b Glu(E) y b 3 3 Pro(P) b 5 y Ile/Leu Thr(T) b b 6 Glu(E) Pro(P) Thr(T) Ile/Leu Asp(D) 97 (I/L) Pro(P) m/z y 5 y 6 y 7 Aminosavak monoizotópos tömege Glicin Alanin Szerin Prolin Valin Treonin Cisztein Izoleucin Leucin Aszparagin Aszpartát Glutamin Lizin Glutamát Metionin Hisztidin Fenilalanin Arginin Tirozin Triptopfán

401 intenzitás MS/MS spektrum Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálás és adatbázisok segítségével Adatbázis (pl. NCBInr, UniProt) m/z Keresőprogram (pl. MASCOT) De novo szekvenálás Peptid szekvenciák Fehérjék

402 intenzitás intenzitás intenzitás intenzitás intenzitás Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálással - áttekintés Tripszines emésztés Fehérje Triptikus fragmensek (peptidek) m/z LC-MS Fehérje Peptid szekvencia Peptid szekvencia Peptid szekvencia Peptid szekvencia m/z m/z m/z MS spektrum m/z MS/MS spektrum

403 Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Sertéshús állása során bekövetkező folyamatok nyomon követése DIGE és MS/MS fehérjeazonosítás segítségével Fehérje azonosítás LC-MS/MS 2D-DIGE Di Luca A, Elia G, Mullen AM, Hamill RM.: Monitoring post mortem changes in porcine muscle through 2-D DIGE proteome analysis of Longissimus muscle exudate. Proteome Sci Mar 20;11(1):9. doi: /

404 Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis MRM Multiple Reaction Monitoring/SRM Selected Reaction Monitoring Nagyon érzékeny és szelektív módszer Csak tripla kvadrupólokon lehet alkalmazni A Q1 és a Q3 m/z adatok megadásával detektálni lehet meghatározott anyagokat Kis mennyiségű ismert fehérje kimutatására alkalmas Jól használható mennyiség meghatározására, a görbe alatti terület arányos a bejuttatott anyag mennyiségével Fehérjék poszt-transzlációs módosulásainak kimutatására használható (foszforiláció, ubikvitináció, metiláció stb.)

405 Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis MRM/SRM működési elve Specifikus fragmensek/formák célzott azonosítására alkalmas, elengedhetetlen a megfelelő Q1 és Q3 értékek (MRM átmenetek) beállítása m/z m/z ESI ionforrás Q1 Ütközési cella Q3 Detektor

406 Intentzitás Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis MRM/SRM működési elve m/z m/z ESI ionforrás Komplex fehérje elegy Q1 Ütközési cella Meghatározott m/z-jű ionok kiválasztása és fragmentációja Q3 Detektor Meghatározott m/z-jű ionok kiválasztása és detektálása Görbe alatti területből (AUC) koncentráció számítás min

407 Célzott MRM/SRM alapú tömegspektrometriás analízis Mikrocisztin kimutatása MRM módszerrel (Waters) Mikrocisztin algák által termelt erősen toxikus (hepatotoxikus) anyag Analit MRM átmenet Mw Q1 Q3 MCYST-RR ,6 MCYST-LW 1025,8 891,7 1024,5 MCYST-LF 986,8 852,5 985,5

408 Fehérjék relatív kvantitálása Izobár kémiai jelölés A fehérjék meghatározott funkciós csoportjaihoz kémiai jelölő ágenseket kapcsolnak A jelölés során a különböző mintákból származó jelölt fehérjék tömege azonos, de az MS/MS során olyan ionok keletkeznek, amelyek csak az illető jelölő anyagra jellemzők Izobár jelölést alkalmazó módszerek: itraq izobár jelölés abszolút és relatív kvantitáláshoz (isobaric tag for relative and absolute quantitation) TMT tandem tömeg jelölés (tandem mass tag) Multiplex (4-6-8) mérésre alkalmasak

409 Fehérjék relatív kvantitálása itraq izobár jelölés abszolút és relatív kvantitáláshoz (isobaric tag for relative and absolute quantitation) Jelölő csoport (114, 115, 116, 117) Kiegyenlítő csoport Fehérjéhez való kötődésért felelős csoport Izobár csoport A fehérjék Lys oldalláncaihoz és az N-terminális amin csoporthoz kapcsolódik Bármilyen biológiai mintát lehet jelölni Hátrány A kapcsolódás hatékonysága sosem 100% itraq 4plex itraq 8plex Drága

410 intenzitás intenzitás Fehérjék relatív kvantitálása itraq izobár jelölés abszolút és relatív kvantitáláshoz (isobaric tag for relative and absolute quantitation) Kontroll Minta 1 Minta 2 Minták feldolgozása, összekeverése MS 117 Minta 3 m/z fragmentáció 115 Fehérje mennyiségi adat a görbe alatti területből számolva m/z

411 Fehérjék relatív kvantitálása Jelölés TMT - tandem mass tag segítségével A TMT szerkezete: M F N R Fehérjéhez kötődő csoport Jelölő csoport Kiegyenlítő/normalizáló csoport Linker régió A fehérjék Lys oldalláncaihoz és az N-terminális amin csoporthoz kapcsolódik Bármilyen biológiai mintát lehet jelölni Hátrány A kapcsolódás hatékonysága sosem 100% TMT zéró TMT duplex TMT hatplex Drága

412 Fehérjék relatív kvantitálása Enzimatikus O-18 jelölés Kontroll (H 2 16 O) Kezelt (H 2 18 O) Tripszines emésztés 1:1 arányú keverés Az enzimes emésztés során a beépült OH csoportok 16 O ill. 18 O izotópokat tartalmaznak Szükséges a proteáz gyors inaktiválása Hátrány Csak két proteóm hasonlítható össze A kis tömegkülömbség a természetben előforduló izotópokkal interferálhat MS/MS analízis

413 Fehérjék relatív kvantitálása Jelölés nélküli kvantitálás Label-free quantitation Teljes mértékben tömegspektrometriás módszer Nem alkalmaz jelölő anyagot A vizsgálat során bekövetkező MS/MS események számát használja a kvantitáláshoz. Minél több MS/MS készül egy fehérjéről, annál nagyobb koncentrációban van jelen. Megfelelő optimalizálással jól használható Hátrány Csak a nagyon érzékeny készülékek esetében alkalmazható (Orbitrap, FTICR-MS)

414 Fehérjék relatív kvantitálása Különböző szója variációk fehérjéinek vizsgálata itraq jelölés segítségével Hobbit szója Zao5241 szója itraq jelölés keresztezés LC-MS/MS Jidou17 szója Eltérő mennyiségben jelen levő fehérjék vizsgálata J Qin. et. al Proteome Sci.

415 Fehérjék relatív kvantitálása Különböző csillagfürt fajták bioaktív fehérjéinek vizsgálata jelölés nélküli kvantitálás segítségével A táplálkozás szempontjából fontos csillagfürt (Lupinus albus) fehérjék vizsgálata, a különböző fajták fehérjéinek kvantitatív analízise Adam Arés Lucky Multitalia fajták Jelölés nélküli kvantitálás HPLC-Chip - ITMS A fehérjék kvantitatív analízise Brambilla F, Resta D, Isak I, Zanotti M, Arnoldi A. A label-free internal standard method for the differential analysis of bioactive lupin proteins using nano HPLC-Chip coupled with Ion Trap mass spectrometry. Proteomics Jan;9(2): doi: /pmic

416 Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása Bakteriológia kenet levétele baktériumok tenyésztése baktériumok azonosítása Egy/több nap Minden baktériumnak van egy csak rá jellemző, ún. spektrum-lábnyoma BioTyper (Bruker Daltonix) baktériumok és bizonyos gombák gyors analízise Minta Azonosított baktérium Szoftver MALDI-TOF Adatbázis baktérium spektrumok

417 Témakörhöz kapcsolódó kérdések Hogyan azonosíthatók a fehérjék MS/MS spektrumok segítségével? Milyen módszereket használnak a fehérjék kvantitálására? Mire használhatók a tömegspektrometriás elemzések az élelmiszerek vizsgálata során? Felhasznált és ajánlott irodalom Salvatore Sechi: Quantitative Proteomics by Mass Spectometry, Humana press, 2007 Pedro R. Cutillas, John F. Timms: LC-MS/MS in Proteomics, Humana press, 2010

418 Kromatográfia, immunológiai módszerek és aminosav analízis alkalmazása az élelmiszerek vizsgálata során

419 Az előadás vázlata Kromatográfia Immunológiai módszereken alapuló technikák Aminosav analízis

420 Kromatográfia kroma szín és grafein írás görög szavakból származik Általános jellemző, hogy az oldószerben (mozgó fázis) feloldott elválasztandó anyagok áthaladnak az ún. álló fázison (papír, oszloptöltet stb.) és eközben elválnak egymástól Típusai: preparatív vegyületek tisztítására, dúsítására analitikai vegyületek kimutatására

421 Kromatográfia Osztályozása: Állófázis alapján: Oszlopkromatográfia Síkkromatográfia Papírkromatográfia Vékonyréteg kromatográfia Elválasztás alapján: Ioncserés kromatográfia Affinitáskromatográfia Méretkizárásos kromatográfia Mozgófázis alapján: Gázkromatográfia Folyadékkromatográfia

422 Kromatográfia HPLC nagy teljesítményű folyadékkromatográfia high performance liquid chromatography Vegyületek elválasztására, azonosítására és mennyiségi meghatározására gyakran használt kromatográfiás eljárás HPLC részei: oszlop vagy kolonna a kromatográfiás töltetet (állófázist) tartalmazza pumpa és kapillárisok a mozgó fázist, eluenst juttatja át az oszlopon detektor a kromatogrammot generálja a molekulák retenciós idejét jelzi

423 intenzitás Kromatográfia HPLC nagy teljesítményű folyadékkromatográfia high performance liquid chromatography Kromatogramm A retenciós idő az adott anyagnak adott körülmények között a rendszeren való áthaladásához szükséges időtartam retenciós idő (min) az álló fázis, a vizsgált molekula és a mozgó fázis közötti kölcsönhatásoktól függ

424 Kromatográfia HPLC nagy teljesítményű folyadékkromatográfia high performance liquid chromatography A hatvanas években Prof. Horváth Csaba (Yale Medical School) fejlesztette ki Molnár Imre és Wayne Melander segítségével kifejlesztették a reverz fázisú HPLC-t Waters 1967 első kereskedelmi HPLC Prof. Horváth Csaba Molnár Imre

425 Inetnzitás Szerves oldószer % Kromatográfia Reverz fázisú HPLC Az egyes komponensek a hidrofobicitásuk alapján elválaszthatók egymástól Állófázis: C4-18 töltet, mozgófázis: víz/acetonitril vagy metanol gradiens A hidrofób részecskék jobban kötődnek az oszlophoz és csak magasabb szerves oldószer koncentráció mellett távolíthatók el Komplex minta C 18 -szilika szemcse min

426 Kromatográfia A bivalytej fehérje tartalmának vizsgálata reverz fázisú HPLC segítségével Az egyes kazein típusok mennyisége hogyan befolyásolja az alvadási paramétereket? αs1-kazein 621 bivalytej minta RP-HPLC β-kazein κ-kazein mennyiségének meghatározása Kazein tartalom függvényében változnak az alvadási paraméterek Bonfatti et. al. (2013) Protein composition affects variation in coagulation properties of buffalo milk. J. Diary Sci. 96:

427 Inetnzitás Kromatográfia Méretkizárásos kromatográfia Az egyes komponensek a méretük alapján elválaszthatók egymástól A pórusméretnél kisebb méretű részecskék a porózus anyag szemcséibe jutnak, ott vándorolnak és ezáltal hosszabb utat tesznek meg, később eluálódnak az oszlopról, míg a pórusméretnél nagyobb méretű részecskék a szemcsék között, rövidebb utat megtéve, hamarabb hagyják el az oszlopot. Fehérje oldat Fehérje oldat Fehérje oldat Fehérje oldat min

428 Inetnzitás Kromatográfia Affinitáskromatográfia Az egyes komponensek specifikus kötődési tulajdonságaik alapján elválaszthatók egymástól Immobilizált ligand A megfelelő fehérje hozzákötődése az oszlopon immobilizált ligandhoz A nem kötődött fehérjék lemosása A specifikusan kötődött fehérjék specifikus elúciója min

429 Kromatográfia Különböző, kereskedelmi forgalomban lévő lizozim preparátumok tisztaságának vizsgálata HPLC segítségével Lizozim antibakteriális tulajdonságokkal rendelkező fehérje Felhasználás: a tejsavas erjedés leállítása (bortermelés) a vajsavas erjedés gátlása (sajtgyártás) Preparátum 1. Preparátum 2. Standard Brasca M, et.al Molecules;18: doi: /molecules

430 Immunológiai alapfogalmak Az antitestek szerkezete F ab régió elsődleges szerep az antigén felismerése és megkötése Fc régió szerep: opszonizáció, effektor funkciók Szupervariábilis régió F ab régió variábilis régió Könnyű lánc konstans régió Hinge régió Fc régió variábilis régió konstans régió Nehéz lánc Diszulfid hidak

431 Immunológiai alapfogalmak Antigén antitest kölcsönhatás Az antitest és az antigén között specifikus kapcsolat alakul ki, az antitest felismeri és hozzákötődik az antigén megfelelő epitópjához Epitóp antigén determináns, az antigén egy része, amelyet az immun rendszer felismer Antigén olyan molekula, amely az immunválasz aktiválását eredményezi Epitóp Antigén Antitest

432 Immunológiai alapfogalmak Monoklonális és poliklonális antitestek Poliklonális antitest immunoglobulinok kombinációja ( antigén koktél ), amelyek az antigén több epitópját ismerik fel Monoklonális antitest egyetlen fajta immunoglobulin, amely az antigén egy epitópját ismeri fel Y Antitest Antigén Antigén Y Epitóp Epitóp

433 Immunológiai módszereken alapuló technikák 1. ELISA enzyme linked immunosorbent assay Meghatározott fehérjék/antigén kimutatására és mennyiségének meghatározására szolgál Lépései: Abszorbancia leolvasása Kromogén szubsztrát Mosás Másodlagos antitest Mosás Elsődleges antitest Blokkolás Antigén felvitele A reakció oldatban megy végbe Specifikus antitestek szükségesek Mikrotiter lemez

434 Elsődleges antitest specifikusan felismeri és hozzákötődik az antigénhez Lehet enzimmel vagy fluorofór csoporttal konjugált Lehet monoklonális vagy poliklonális Másodlagos antitest specifikusan felismeri az elsődleges antitest Fc régióját Általában enzimmel vagy fluorofór csoporttal konjugált Lehet monoklonális vagy poliklonális Leggyakrabban használt enzimek ALP alkalikus foszfatáz HRP - tormaperoxidáz Immunológiai módszereken alapuló technikák 1. ELISA enzyme linked immunosorbent assay

435 Immunológiai módszereken alapuló technikák 1. ELISA enzyme linked immunosorbent assay Direkt ELISA Indirekt ELISA Szendvics ELISA Y Y Y Y Y Y Y Y

436 Immunológiai módszereken alapuló technikák GMO termékek kimutatása és kvantitálása A Bacillus thuringiensis Cry1Ab fehérje ellenes antitest és ELISA alkalmazásával kimutatható A Bt-Cry1Ab jelenléte GMO-ra utal Dupla antitest szendvics ELISA (DAS) Y Y Y Y Y Y Y Y

437 Immunológiai módszereken alapuló technikák Allergének, mikotoxinok kimutatása és kvantitálása ELISA alapú módszerrel Gyors, érzékeny módszer allergének (tojás, mogyoró, mustár, tej, gliadin stb.), mikotoxinok azonosítására és tengeri ételek hisztamin tartalmának vizsgálatára

438 Immunológiai módszereken alapuló technikák 2. Western blot Meghatározott fehérjék/antigén kimutatására szolgál Lépései: Előhívás (filmre) Kemilumineszcens szubsztrát Mosás Másodlagos antitest Mosás Elsődleges antitest Blokkolás Blottolás Gél Film A reakció szilárd felületen (membránon) megy végbe Specifikus antitestek szükségesek Membrán (nitrocellulóz, PVDF)

439 Immunológiai módszereken alapuló technikák 3. Immunkromatográfia Antigén-antitest kölcsönhatás és a kromatográfia ötvözése Egyszerű kivitelezni, laboratóriumi háttér nélkül is használható napjainkban kiszorította a Western blot-ot QuickStix AP Kit (Nuscana) GMO Allergén tesztek

440 A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis A fehérjék összetételének és biológiai értékének megállapítása céljából szükséges Az egyes fehérjék eltérő arányban tartalmazzák az aminosavakat, az eszenciális és szemieszenciális aminosav tartalmuk nagyon változó lehet táplálkozási szempontból nagy jelentőség Biológiai érték: BV = ( Nr / Na ) * 100 Na = a teszt alatt diétából felvett nitrogén; Nr = a teszt alatt szervezetbe beépült nitrogén Egy fehérje számunkra annál magasabb biológiai értékű, minél kevesebb kell belőle a N egyensúly fenntartásához, abban az esetben, ha csak az adott fehérjével táplálkoznánk.

441 A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis Esszenciális aminosavak: aminosav, amit a szervezetünk nem tud szintetizálni, ezért a táplálékkal kell bevinni: fenilalanin, valin, treonin, triptofán, izoleucin, metionin, leucin és lizin Szemieszenciális aminsoavak: szintézis lehetséges, de bizonyos esetekben a táplálékból kell pótolni Hisztidin: Biokémiai szintézise nem lehetséges, de bélbaktériumok szintetizálják számunkra. Arginin: Szintézise lehetséges, de nem elégséges fokozott fehérjebeépítéssel járó életszakaszokban. Tirozin, cisztein: Szintetizálódnak, de szintézisük egy másik esszenciális aminosav jelenlétéhez kötött Minél közelebb áll az adott fehérje esszenciális aminosav összetétele az emberi szükséglethez, és minél jobban emészthető, annál magasabb a biológiai értéke.

442 A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis 1. Hidrolízis A fehérjéket aminosavakra kell bontani (gyakran savas hidrolízis) 2. Derivatizáció Az aminosavak nem detektálhatók HPLC segítségével derivatizálni kell, megfelelő kémiai reagensekhez kell kötni a detektálás érdekében 3. HPLC elválasztás Megfelelő oszloptöltetet alkalmazva folyadékkromatográfia segítségével az aminosavak elválasztása 4. Detektálás A derivatizáláshoz használt csoport függvényében a megfelelő hullámhosszon az egyes aminosavak detektálása, kromatogramm felvétele 5. Koncentráció számítás Kromatogram alapján, standardok felhasználásával

443 A fehérjék aminosav összetételének meghatározása Aminosav analízis P Hidrolízis Derivatizálás P P P P P P P Fenil-izotiocianát (PITC) HCl D Dabszil-klorid (DABS-Cl) D D D D D D D