7. Rendszerszemléletű biológia a kémikus szemével. Genomika, proteomika, metabolomika

Átírás

1 7. Rendszerszemléletű biológia a kémikus szemével Genomika, proteomika, metabolomika

2 7. Rendszerszemléletű biológia Redukcionista vs. Holisztikus szemlélet A rendszerszemléletű biológia (systems biology) a biológiai jelenségeket hálózati rendszerként értelmező megközelítés Paradigmaváltás a szemléletmódban, a rész helyét az egészben, a rész kapcsolatát az egésszel keresi Multidiszciplináris tudomány, kialakulása köszönhető: -a hatalmas mennyiségű tudás (adatbázisok) szabad és gyors áramlásának -nagyteljesítményű technológiák (pl. chip array) kialakulásának (gyors információgyűjtés) -a bioinformatika fejlődésének (információhalmaz feldolgozása)

3 Bioinformatika Nem kizárólag nagymennyiségű adat statisztikai feldolgozásáról szól Komplex (globális) következtetéseket szeretnénk Hálózatok kialakítása Az eredmények behelyezése a már ismert tudásbázisba,a tudásbázisok integrációja (pl. egy genetikai elem eddig nem ismert funkciójára is rájöhetünk)

4 Bioinformatika Az összefüggések prioritását is vizsgálni kell pl. mennyi az esély arra, hogy ha A változik B, C is egyidejűleg módosul ezek a módosulások közvetlenül vagy áttételesen következnek-e be milyen közbenső, esetleg gyógyszerrel célba vehető elemek léteznek; milyen mértékű és milyen irányú, s reverzibilis vagy irreverzibilis-e a változás (Pl. reakció-útvonalak felismerését, az útvonal-analízist, útvonal-térképezést) Egyes adatcsoportok kiemelése szükséges (klaszterek)( pl. egyes betegcsoportok mely génjei reagálnak hasonlóan a kezelésre)

5 Bioinformatika Egyes paramétercsoportok közös tulajdonságainak definiálása, oksági hálók kialakítása E kérdések megválaszolása megfelelő tervezést igényel Alkalmazás pl. gyógyszertervezés (pl. hol lehet hatni, mire hat még) Gyógyszerek együttes tesztelése, optimális mérésszámhoz kísérletek tervezése In silico kutatás pl. nemzetközi adatbázisokhoz kapcsolódva Kísérleti és a tudásbázisból eredő adatok bioinformatikai elemzésével értelmezni tudjuk a komplex jelenséget

6 Rendszerszemléletű biológia Redukcionista szemlélet: egy adott gént kiemelve a környezetéből vizsgálok hipotézis, kísérlettervezés, kivitelezés, értékelés Holisztikus szemlélet: kb. mindent vizsgálok egyszerre, mintha nem lenne szükség hipotézisre, csak az adatok / eredmények értékelésére Fontos tudni, hogy mit akarok vizsgálni, mi a módszerem, melyek az adott módszer korlátai, milyen következtetéseket tudok levonni az eredmények halmazából (ez segíti a hipotézisalkotást) Ludwig von Bertalanffy a rendszerelmélet atyja Hegyi Krisztina pedig a magyar elnevezés anyja

7 Genomika Egy sejt / szervezet teljes génkészlete (DNS állományban tárolt információja) a genom A genomot, a gének kölcsönhatását vizsgáló tudomány Teljes genom-meghatározás (DNS szekvencia), gének azonosítása (annotáció), géntérképezés A géncsoportok, hálózatok komplex, egységes mintázatvizsgálata Funkcionális genomika: a genomika dinamikus aspektusaival foglalkozik (pl. transzkripció, transzláció) Nagy teljesítményű technikák (high throughput screening) segítségével genomméretű vizsgálatokat (egyszerre több száz gént is) vizsgál

8 Genomika Az egész genom vizsgálata - Kódoló és nem kódoló szakaszok működése - Génvariációk, génkópiák azonosítása - Funkcióvizsgálat génmódosításokkal (természetes vagy mesterséges) Funkcióvizsgálatok - Mutáció, pontmutáció (SNP) - Génexpresszió

9 Genomika DNS szintű vizsgálatok - Génkölcsönhatások (gének páronkénti kiiktatásával vizsgálják azok fenotípusra gyakorolt hatását ) - Gének funkcionális azonosítása (ENCODE project, fehérje kódoló, mirns-t kódoló, transzkripciós szabályzó helyek) RNS szint (génexpresszió) - mrns szekvenálás - Microarray (mrns cdns próba hibridizáció)

10 Microarray technika Különböző sejttípusokból vett RNS (cdns) minták azonosítására, mennyiségére képes információt adni DNS-RNS (cdns-dns) hibridizáción alapul A sejtekből kinyerik az mrns-t, átírják cdns-re (stabil), fluoreszcens jelzéssel látják el (pl. a különböző sejtekből származókat különböző színnel) A chip felületére meghatározott mintázat szerint (array) ismert próba DNS-t rögzítenek (pico-mólnyi mennyiségben) robotok végzik a felvitelt (imprinting) A próba-dns-t meghatározott helyekre (spot) viszik fel, ezek mérete kisebb, mint 200 mikron (egy chipen több ezer spot

11 Microarray gene expression

12 Microarray gene expression Az intenzitásokból lehet következtetni pl. mrns koncentrációra (mrns-cdns módszernél) De, akár genomanalízisre is jó, pl. génkópiák azonosítására is alkalmas (denaturált DNS- mintákból)

13 Proteomika Genomika: Gén-expresszió, DNS polimorfizmus vizsgálata egyedi diagnózis, egyedi gyógyszertervezés DE! nem ad információt a funkcióról Proteomika: Fehérjeszintézis, funkcionális fehérjék, a dolgozók biomarkerek diagnózishoz, célmolekulák gyógyításhoz

14 Proteomika Wilkins: a genomika expresszált fehérje kiegészítője Burgess: minden, ami posztgenomika és a funkcionális genomika tárgyköre Burgess: mi-a-csudát-kéne-csinálni, hogy-értelmetadjunk-az-egész genomikának

15 A proteom komplexitása Sokféle lehetőség az mrns szabászatban Sokféle szintézis utáni módosítás (foszforiláció, glikoziláció) Nagyságrenddel több funkcionális fehérje, mint gén Sokféle fehérje-fehérje interakció

16 A proteomika célkitűzései Fehérjék karakterizálása és katalogizálása Fehérje expresszió összehasonlítása különböző körülmények között (egészséges-beteg) Fehérjefunkciók azonosítása Fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálata Jelátviteli utak elemzése Fehérjék térszerkezete Fehérje adatok bioinformatikai elemzése

17 A proteomika helye a biokémiában Proteomika Rendszerbiológiai szemlélet Rész helye az egészben Fehérjefunkciók komplex sejtkörnyezetben Klasszikus fehérjekémia Hipotézis irányított kérdés Egy funkció vizsgálata Izolált fehérje funkciója

18 Proteomika és hatóanyag tervezés PROTEOMIKA Genom CÉL-MOLEKULA Validálás HTS RDD Vezető molekula Optimalizálás

19 A proteom vizsgálata Fehérjék elválasztása lizátumból A szétválasztott fehérjék karakterizálása Kutakodás a meglévő adatbázisokban a kapott adatok alapján

20 A proteomika eszközei 2D gélelektroforézis Tömegspektrometria (MS) ProteinChip Protein microarray-k

21 2D elektroforézis Fehérjék szétválasztása két független tulajdonság alapján - molekulatömeg - izoelektromos pont 1. dimenzió: izoelektromos fókuszálás - Amfolitok és elektromos áram segítségével ph gradienst hoznak létre a gélben - A fehérjék az izoelektromos pontjukig vándorolnak (nettó töltés 0)

22 2D elektroforézis 2. dimenzió: Az izoelektromos pont szerint szétválasztott fehérjék kiválasztott sávjait SDS-gélre viszik át és gél-elektroforézissel tovább szeparálják egymástól csíkok helyett foltok Elvárások: - Maximális reprodukálhatóság referencia térképek - Optimális felbontás - Nagy kapacitás tisztítási, mikropreparatív célok - Egyszerű, automatizált nagyléptékű analízis

23 2D adatok elemzése Pontok vizualizálása: pl. festés Pontok detektálása Mennyiségi elemzés Mintázatok illesztése Adatbázis létrehozása Automatizálás Viszonypontok kijelölése Pontok illesztése kontroll-kezelt összehasonlítás, expressziós mintázat, betegség-összefüggések

24 2D képek és illesztésük Fehérje expressziós mintázat 2D gélelektroforézissel: különböző körülmények között Számítógépes összehasonlításuk: a zöld ill. lila a különböző körülmények fehérjemintázata, fekete: különböző mennyiségű fehérjék, szürke: azonos mennyiségű fehérje

25 Tömegspektrometriás analízis Előkészítés: - fehérjék darabolása (pl. tripszines emésztés) - tisztítás (pl. gélelektroforézis) Tömegspektrometriás analízis - MALDI-TOF A peptidkészlet tömegprofilja, fehérje ujjlenyomat (adattár) Fehérje azonosítás szekvenálás nélkül: emésztés in silico is összehasonlítás az adatbázissal kb 4-5 peptid stimmeljen, min. 20% szekvencia átfedés legyen, nagy pontosság és nagy felbontás Fehérje azonosítás szekvenálással: post-source decay tandem MS

26 Tömegspektrometriás analízis korlátai Nem egyenlő mértékben ionizálódnak az adott fragmensek Kevés fehérjére nem alkalmazható Nagyon tiszta mintára van szükség

27 Proteinchip technológia Fehérje-halászat, tisztítás, analízis és feldolgozás Kis mennyiségű mintára is alkalmas (atto, femtomól) Tű a szénakazalban

28 Proteinchip technológia Chip: különböző felülettel kaphatók (hidrofób, hidrofil, kation, anion-cserélő stb.) Egy chipen 8 lyuk, különböző affinitással (pl. receptor, ellenanyag, DNS, fehérje) Akár 1 ml durva minta (lizátum, szérum) is felvihető Az adott fehérje a neki jó helyen kötődik (ami nem az lemosódik)

29 Proteinchip technológia - analízis Felület-erősített lézer abszorpciós-ionizációs (SELDI) módszerrel ionizálás (közben kristályosítják a fehérjéket, így kerülnek a vákuumcsőbe (MS) TOF detektálás Tömegmintázat megkapható

30 Proteinchip technológia

31 Proteinchip technológia - alkalmazások Fehérje felfedezés Fehérje tisztítás Fehérje azonosítás peptidtérképezés, bio / betegség markerek Fehérje karakterizálás (epitóp térképezés, foszforilációs, glikolizációs analízis) Assay fejlesztés, pl. fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára

32 Fehérje felfedezés, biomarker keresés 2 szérum minta cseppentése, (beteg-egészséges / kezeltkezeletlen) mosás, leolvasás B kivonása A-ból szoftver segítségével Egyedi fehérje azonosítása

33 Fehérje tisztítás Mikroliternyi mennyiség Mikrokromatográfiás előtisztítás Egyre erőteljesebb mosás a csipen Homogén tisztaság pikomól mennyiségben Néhány óra hónapok helyett

34 Ellenanyag kötése a csip felszínére In situ emésztés Nemkötődött fragmensek mosása Kötődött fragmensek leolvasása Epitóp térképezés

35 Fehérje-fehérje kölcsönhatások - 12,938 pont Minden pötty ~ 30 fg-50 pg proteint tartalmaz Különböző fehérje minták nyomtatva a felszínre (A fehérjéket megtoldották GSTpoli-His-taggal, majd Ni 2+ -en át a felülethez kötötték) microarrayk

36 P-P interakciók elemzése microarray-jel Array+biotinilált kalmodulin Új kalmodulin-kötő fehérjék felfedezése Új inozitol-foszfát-kötő fehérjék felfedezése Biotin-(strept)avidin kapcsolat!

37 Metabolomika Metabolomika: egy szervezet összes metabolitjának egyidejű összehasonlító vizsgálata, mennyiségi változások követése Metabolom: a szervezet anyagcseréjében részt vevő összes kismolekula Metabolitok: az anyagcserefolyamatok köztes-, vagy végtermékei (zsírok, aminosavak, cukrok, antibiotikumok, pigmentek stb)

38 Metabolomika elválasztás Gázkromatográfia(GC) Kapillárelektroforézis (CE) Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Ultrahatékony folyadékkromatográfia (UPLC) GC-MS HPLC-MS Detektálási módszerek NMR, MS

39 Metabolomika elválasztás Adatok értékelése összehasonlítás, differencia analízis stb. Alkalmazások - Kábítószer azonosítás (igazságügyi orvos, vegyész) - Klinikai toxikológia - Táplálkozásgenetika - Funkcionális genomika

40 Biológiai útlevél Sportolóknál, doppingvizsgálatoknál alkalmazzák Biomarkerek segítségével építenek fel egy, a sportolóra jellemző hematológiai és szteroid profilt: A sportoló így önmaga referenciaértéke is egyben saját határértékeket állapítanak meg, ami rá jellemző A gyanús változások orvosi vagy dopping eredetét tisztázzák, ha tudják

41 Bölömbika