Proteinchip technológia - alkalmazások

Átírás

1 Proteinchip technológia - alkalmazások Fehérje felfedezés Fehérje tisztítás Fehérje azonosítás peptidtérképezés, bio / betegség markerek Fehérje karakterizálás (epitóp térképezés, foszforilációs, glikolizációs analízis) Assay fejlesztés, pl. fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára

2 Fehérje felfedezés, biomarker keresés 2 szérum minta cseppentése, (beteg-egészséges / kezeltkezeletlen) mosás, leolvasás B kivonása A-ból szoftver segítségével Egyedi fehérje azonosítása

3 Fehérje tisztítás Mikroliternyi mennyiség Mikrokromatográfiás előtisztítás Egyre erőteljesebb mosás a csipen Homogén tisztaság pikomól mennyiségben Néhány óra hónapok helyett

4 Ellenanyag kötése a csip felszínére In situ emésztés Nemkötődött fragmensek mosása Kötődött fragmensek leolvasása Epitóp térképezés

5 Fehérje-fehérje kölcsönhatások 12,938 pont Minden pötty ~ 30 fg-50 pg proteint tartalmaz Különböző fehérje minták nyomtatva a felszínre (A fehérjéket megtoldották GSTpoli-His-taggal, majd Ni 2+ -en át a felülethez kötötték)

6 P-P interakciók elemzése microarray-jel Array+biotinilált kalmodulin Új kalmodulin-kötő fehérjék felfedezése Új inozitol-foszfát-kötő fehérjék felfedezése

7 Metabolomika Metabolomika: egy szervezet összes metabolitjának egyidejű összehasonlító vizsgálata, mennyiségi változások követése Metabolom: a szervezet anyagcseréjében részt vevő összes kismolekula Metabolitok: az anyagcserefolyamatok köztes-, vagy végtermékei (zsírok, aminosavak, cukrok, antibiotikumok, pigmentek stb)

8 Metabolomika elválasztás Gázkromatográfia(GC) Kapillárelektroforézis (CE) Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Ultrahatékony folyadékkromatográfia (UPLC) GC-MS HPLC-MS Detektálási módszerek NMR, MS

9 Metabolomika elválasztás Adatok értékelése összehasonlítás, differencia analízis stb. Alkalmazások - Kábítószer azonosítás (igazságügyi orvos, vegyész) - Klinikai toxikológia - Táplálkozásgenetika - Funkcionális genomika

10 Biológiai útlevél Sportolóknál, doppingvizsgálatoknál alkalmazzák Biomarkerek segítségével építenek fel egy, a sportolóra jellemző hematológiai és szteroid profilt: A sportoló így önmaga referenciaértéke is egyben saját határértékeket állapítanak meg, ami rá jellemző A gyanús változások orvosi vagy dopping eredetét tisztázzák, ha tudják

11 8. A kémiai biológia alapfogalmai Bioortogonalitás. Jelölési technikák (fluoreszcens, PET, MRI)

12 8. Kémiai biológia Szintetikus Kémia N N N N OAc Fluorofórok Kémiai biológia N 3 SO 2 R HOH HO HO H H H OH OH OH Bioortogonalitás Biokémia

13 Kémiai biológia Természetes, vagy mesterségesen előállított biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák) Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI) Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)

14 Bioortogonalitás Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív) Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba nincs keresztreakció, szervezetidegen funkciók Gyors, kvázi kvantitatív ( klikk -reakciók) - Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális ártalmatlan melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus

15 Bioortogonális modulok Célvegyület (biomolekula) Kémiai hírvivő bifunkciós, biokompatibilis mesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolható a cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedi motívumok, géntechnológia) Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)

16 Bioortogonális reakciók Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin) Staudinger ligáció (azid + foszfin) Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)

17 Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció Gyors Szelektív Fluoreszcens termék (nincs háttérfluoreszcencia) UV fény

18 Biokompatibilis Lassú Spontán foszfin oxidáció Staudinger ligáció

19 Staudinger ligáció

20 Azid-alkin 1,3-dipoláris cikloaddíció, Huisgen reakció magas hőmérséklet regioizomerek (1,4 és 1,5)

21 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Szerves oldószerek, vizes közeg, ph: 3-10 ~100 % Nagyon gyors, regiospecifikus Cu toxicitás

22 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin) Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexál, vagy egyéb adalélok (TBTA) TBTA

23 23 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Glikoproteid jelölés Metabolikus módosítás (Ac 4 ManAz)

24 Vörös, közeli IR, mega-stokes klikk festékek l max /l em 523/630 nm 544/680 nm 588/744 nm

25 Nem citosztatikusak CHO sejtek jelölése: A, B, C: azidomannozaminnal nem kezelt sejtek festés után D, E, F: azidomannozaminnal kezelt sejtek festés után G, H, I: azidomannozaminnal kezelt sejtek a festés után 5, 25 és 60 perccel

26 Cu(I) mentes klikk reakció R 1 R 1 + R 2 N 3 R 1 r.t. N N N R 2 + N N N R 2 1,4 triazol 1,5 triazol -C(sp 3 )-C(sp)- = ~75,3 kj/mol gyűrűfeszültség Nem szükséges Cu(I) Lassabb, bonyolult reagensek

27 27 Ciklooktin reagensek F F R DIFO DIBO R R endo/exo BCN DIFBO F F N R O BARAC CO 2 Me COMBO 0.08 [a] 0.05 [a] 0.14 / 0.11 [b] 0.22 [a] 0.96 [a] 0.24 [a] 0.29 / 0.19 [c] 0.80 [d] c logp = 4,8 c logp = 1,9 [a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril (3:4 v/v)

28 Koncentrációfüggés / szelektivitás O N N O HO O O COMBO-Flu U937 sejtek, FACS B. R. Varga. M. Kállay, K. Hegyi, Sz. Béni, P. Kele (2011) Chem. Eur. J. in press. 28

29 Membrán glikoproteid festés (ManNAz) 12.5 µm COMBO-Flu A-C ManNAz + D-E ManNAz 30 min 45 min 60 min A B C Magfesték (Hoechst 33342) Mosás nélkül!! 30 min 60 min D E

30 Diels-Alder reakció Biokompatibilis Gyors Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)

31 Diels-Alder reakció

32 Kémiai hírvivők Kötődés a célterülethez - Ritka funkciós csoportokon át kémiai úton - Metabolizmus segítségével (módosított metabolittal) - Bioortogonalizált építőelemek genetikai bevitele (STOP kodonhoz kötődő trns-en át) Reakció a jelzővegyülettel (bioortogonális reakcióval)

33 Jelzés bevitele egy lépésben Előre jelzett kémiai hírvivő (egylépéses jelzés) - Kémiai funkció módosulhat - Lipofilitás túl nagy lehet (penetrációs tulajdonságok) - Háttérzaj (pl. háttérfluoreszcencia) rosszabb jel/zaj arány

34 Jelzés bevitele két lépésben - Először a kémiai hírvivő, majd a jelzés - Kisebb módosítás, kevésbé befolyásolja a tulajdonságokat, könnyebb bevinni - Fluoreszcens jelzésnél lehet pl. fluorogén jelzést alkalmazni (nincs háttérfluoreszcencia)

35 Fluorogén jelzővegyületek Fluorogén: csak a kapcsolást követően lesz fluoreszcens Minimális háttérfluoreszcencia Jobb jel / zaj arány Herner et al. Org. Biomol. Chem., 2014, 11, 3297 Herner et al. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1370

36 Fluorogén jelzések 1,00 Normalized fluorescence intensity / a.u. 0,75 0,50 0,25 0, l / nm A. Herner, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2013) Org. Biomol. Chem. 11, 3297.

37 Jelzések Fluoreszcens jelzés - Nagyon érzékeny (femtomól, 1 molekula) - Jó felbontás (~1-100 nm térbeli, ns, ps időbeli) - Olcsó - Korlátok: - mélység (UV legrosszabb, NIR nagyon jó) - Nem túl jó kontraszt

38 Pozitron jelzés (PET) Jelzések - Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18 F) - Az annihiláció eredménye nagy energiájú foton - Érzékeny, jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága, egészségre káros, gyengébb felbontóképesség

39 Jelzések NMR aktív nuklid (MRI) - pl. Gd 3+ komplexek, mágneses nanorészecskék - jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: - NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny, gyengébb felbontás

40 Jelzések Kombinált jelzések NIR fluorofór + PET Jó kontraszt + érzékeny detektálás

41 Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan Metabolikus Módosított metabolittal (pl. azido-cukor) Glikoziláció követése Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

42 Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan Metabolikus Módosított metabolittal (pl. azido-cukor) Glikoziláció követése Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

43 Glikolizáció követése az embrionális fejlődés során Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

44 Glikolizáció követése Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

45 Bioortogonális funkciók genetikai bevitele

46 A transzláció Genetikai kód: a DNS-en tárolt genetikai információ fehérjére való átírásának szabályrendszere A fehérjére átírandó gén a DNS-ről mrns-re másolódik Az mrns-ról a riboszómák végzik a fehérjeszintézist A képződő fehérjéhez az aminosavakat a trns-ek szállítják (aminoacil) A trns-ek kodonokat ismernek fel az mrns-en Kodon: egy aminosavat kódoló bázishármas (64) az mrnsen Antikodon: a kodonnal komplementer bázishármas a trnsen

47 A STOP kodon Terminációs/nonszenz kodonok Nincs olyan trns, melynek antikodonja komplementer lenne velük nem kötődik hozzá trns leáll a fehérjeszintézis STOP kodont felismerő trns: a genetikai kód kiterjesztése 3 típus: UAG: amber ( különutas baktériumoknál pl. Pyl) UGA: opal UAA: ochre

48 Nem-természetes aminosavak bevitele fehérjékbe

49 A genetikai kód kiterjesztéséhez szükséges Ortogonális trns-szintáz/trns pár Amber stop kodon a fehérjében Nem természetes aminosav

50 Ortogonális trns UAG -aminoacil-trnsszintáz pár Ortogonális: olyan trns-szintáz, mely nem aminoacilezi a sejt többi trns-ét+olyan trns mely nem szubsztrátja a sejt többi szintázának Az ortogonalitás mindig csak adott gazdaszervezetre érvényes

51 Gyakorlatban használt ortogonális trns/trnsszintáz párok Methanococcus janaschii tirozil-trnsszintáz/trns CUA -MjTyrRS (E. coli) E. coli leucil-trns-szintáz/trns CUA EcLeuRS (élesztő, emlős) E. coli tirozil-trns-szintáz/trns CUA -EcTyrRS (élesztő, emlős) Methanosarcina pirrolizil-trns-szintáz/trns CUA - pyirs (E. coli, élesztő, emlős, C. elegans)

52 Ortogonális trns/trns-szintáz kifejlesztése

53 Amber stop kodon bevitele fehérjékbe: Site-directed mutagenesis Vagy meglevő Amber kodonra viszek be, vagy beépítek egy Amber kodont Szükséges egy rövid oligonukleotid DNS primer: megfelelő helyen tartalmazza a kívánt mutációt (amber stop kodon) és komplement a mutálandó DNS-sel DNS-hibridizáció: a DNS kettős szála hő hatására szétválik, majd a primer a megfelelő génszakaszhoz kötődik (annealing), azzal duplexet képez A (már a mutációt tartalmazó gént) DNS-polimeráz írja tovább A mutált gén klónozzák (PCR), majd elválasztják a mutációt nem tartalmazóktól

54 Helyspecifikus mutagenezis pl. Val cseréje Ala-ra

55 Kémiai hírvivő genetikai beépítése Plass et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3878

56 Inzulin receptor - expresszió követése Nikic et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 2245

57 Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Amfifil fehérjék szintézise baktériumban A kódoló gén bevitele (transzgenikus baktérium) A kifejeződő fehérjék önszerveződése vezikulumokká A szerveződési folyamat valós idejű követése A hidrofil részhez GFP-t is toldanak Egyéb funkcióval való felruházás bizonyítása Nem természetes bioortogonális- aminosav beépítése és jelölése Hatóanyagok direkt szintézise a betegben Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: /NMAT4118

58 Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: /NMAT4118

61 Kémiai módosítás Egyedi motívumok reaktivitása -SH, Ar-OH, Trp-indol Natív kémiai ligáció

62 Tyrosine specific tagging mega-stokes, near infra-red dye HSA HSA labs = 560 nm l em = 700 nm G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

63 Tyr specifikus jelölés HSA HSA G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

64 Cys jelölés HSA HSA G. B. Cserép, Zs. Baranyai, D. Komáromy, K. Horváti, Sz. Bősze, P. Kele Under review

65 Natív kémiai ligáció N-terminális Cys 1. Transztioészterifikálás (nukleofil támadás: lágy nukleofil Cys SH) C-term N-term 2. S N acil transzfer (amid stabilabb) Rekombináns, hely-specifikus módosítást (pl. poszttranszlációs) tartalmazó ciklikus peptidek, fehérjék szintézise Kemoszelektív reakció egy tioészter-tartalmú és egy N-terminális Cys-t tartalmazó peptidfragmens között Hátrány: természetes Cys kis száma