6. szeminárium - Fehérjeszerkezethez kötött patológiás állapotok kémiája

Átírás

1 6. szeminárium Fehérjeszerkezethez kötött patológiás állapotok kémiája A fehérjék háromdimenziós, specifikus funkcióra alkalmas szerkezetét natív konformációnak nevezzük, melyet egy dinamikus feltekeredési (folding) folyamat során vesznek fel. Az ehhez szükséges információ az elsődleges szerkezetben kódolt és a folyamat termodinamikai kontroll alatt áll: a natív szerkezet egy energetikai (globális) minimumot képvisel. Ahhoz azonban, hogy a fehérje véletlenszerű ill. részben irányított szerkezeti változások révén elérje ezt az energiaminimumot, szükségszerűen nem-natív konformációk sorát kell hogy felvegye a folding során. A sejten belüli fehérje-foldingot sokszor egyéb fehérjék (molekuláris chaperonok vagy dajkafehérjék ) is segítik. A kezdeti gyors lépések során a hidrofób kölcsönhatások miatt a peptidlánc összeesik ( hidrofób kollapszus ), ezzel párhuzamosan kialakulnak a másodlagos szerkezetek is és egy éretlen harmadlagos szerkezet jön létre ( olvadt gombóc ). Ezt követik a lassabb befejező lépések, melynek eredményeképpen a fehérje eléri a végső, natív szerkezetét. Az esetleges negyedleges szerkezet felvétele az alegységek oligomerizációja és/vagy poszttranszlációs módosítása (transzláció=polipeptid-szintézis) révén történik. A poszttranszlációs módosítások során már meglévő kovalens kötések szakadnak fel és újak alakulnak ki, pl. egy hosszabb prekurzor fehérjéből (proprotein) a nem kívánt szakaszok lehasítódnak (de funkciós csoportok (leggyakrabban foszfát-csoport), prosztetikus csoportok (pl. hem vagy FAD) vagy egyéb molekulák (pl. cukor komponensek) kapcsolódhatnak is a fehérjékhez). A fehérje-folding folyamatában bekövetkező zavarok elégtelenül feltekeredő fehérjék képződéséhez és ennek következtében patológiás állapotok kialakulásához vezethetnek. Érdekes módon egyes fehérjék egynél több stabil harmadlagos szerkezet felvételére is képesek, mely konformációk közötti egyensúly felborulása súlyos patológiás következményekkel járhat. Prionoknak olyan fehérjéket nevezünk, melyek öngerjesztő módon képesek alternatív konformációt felvenni ( fertőző fehérjék ). Számos különböző, de elsősorban az idegrendszert érintő, patológiás állapotot képesek előidézni, melyek jelenleg gyógyíthatatlanok. A prionbetegségeket gyakran fertőző szivacsos agyvelőgyulladásoknak is nevezik (transmissible spongiform encephalopathies, TSE), ami az érintett agykéreg átlyuggatott, szivacs-szerű mikroszkópos képére utal. Az emberben előforduló prionbetegségre példa a Creutzfeldt-Jacob szindróma, míg a szarvasmarha szivacsos agyvelőgyulladás (bovine spongiform encephalopathy - BSE, a köznyelvben elterjedt nevén kergemarhakór ) a szarvasmarhákat érinti. TSE esetekről már 2500 évvel ezelőtt az Ókori Görögországban, valamint 1500 évvel ezelőtt a Római Birodalomban is beszámoltak. A betegség humán formáját elsőként Alfons Jacob írta le a XX. században. Nem sokkal később kezdte el tanulmányozni Shirley Lindenbaum, majd Michael Alpers és Daniel Gajdusek a Pápua Új Guinea területén élő Fore-törzs elsősorban gyermek és nő tagjai között előforduló szokatlan betegséget, a kurut. A törzs mindennapjaiban bevett szokás volt a szakrális kannibalizmus gyakorlása, azaz az elhunyt rokonok testét elfogyasztották. A rituáléban kizárólag a törzs női tagjai vehettek részt, akik azonban a gyerekeiket is gyakran bevonták ebbe. A betegség előfordulása egyértelműen az említett törzsi szokáshoz volt köthető és az agyszövet kiemelkedően fertőzőnek bizonyult. A lassú, több hónaptól akár több évig terjedő kórlefolyás miatt kezdetben lassú, vírusok-okozta fertőzésre gyanakodtak. A kuru kutatásában elért eredményeiért Gajduseket 1976-ban Orvosi Nobel-díjjal tüntették ki, de évtizedeknek kellett eltelnie, mire Stanley Prusiner bebizonyította, hogy sem vírus, sem más, nukleinsavval rendelkező 1

2 partikulum, hanem kizárólag fehérje vesz részt a TSE-k terjedésében. A prionok felfedezésért Prusiner ben Orvosi Nobel-díjat kapott. Emberben a prionok (fehérjeszerű fertőző ágensek - proteinaceous infectious particles) fő fehérje komponense az ún. prion-related protein (PrP), ami spontán módon képes egy döntően α-helikális, ún. PrP C (celluláris-prp) szerkezetből egy β-redőben gazdagabb, fertőző konformációba, a PrP Sc (scrapie-prp; a scrapie magyarul surlókór, a BSE-hez hasonló, juhokban előforduló prionbetegség) formába, átalakulni. A PrP Sc szerkezetben számos hidrofób aminosav-oldallánc a fehérje felszínére kerül, és ezáltal érintkezik a citoszol vizes közegével. Ezeken a hidrofób foltokon keresztül az egymás közelébe kerülő PrP Sc fehérjék aggregálódnak és lerakódnak az idegsejtekben (a neuronokban és a gliában egyaránt). Amennyiben az aggregálódott PrP Sc -k száma elér egy küszöbértéket, a folyamat autokatalikussá válik és egyre több, nagy stabilitású oligomer képződik, ami a neuronális szövet károsodásához és neurodegeneratív betegség kialakulásához vezet. Prionbetegségek leggyakrabban sporadikusan (elsősorban a PrP fehérjét kódoló gén mutációjából adódóan), ritkábban örökletes megbetegedés formájában fordulnak elő, és csak rendkívül ritkán történik tényleges fertőződés PrP Sc tartalmú táplálék elfogyasztása révén, a vér-agy gát működésének köszönhetően. 1. ábra. Alternatív konformációkkal rendelkező prion fehérje. Az α-hélixek β-redővé (zöld és narancssárga) alakulásával a fehérje fertőzőképes variánssá válik. Újabban egyre több bizonyíték utal arra, hogy a rendkívül ritka Creutzfeldt-Jacobs szindrómán felül prionok állhatnak számos más neurodegeneratív kórkép, úgymint az Alzheimer- és Parkinson-kór, továbbá a tauopátiák (a mikrotubulusokat stabilizáló tau proteinek aggregálódása az agyban) hátterében is. Ugyan az Alzheimer-kór pontos kiváltó oka továbbra sem tisztázott, a patomechanizmusban fehérje aggregátumok megjelenése bizonyítottan szerepet játszik. A β-amiloid oligomerek által alkotott plakkok ( szenilis plakkok ) a betegség késői stádiumában, a demencia kialakulásával együtt jelennek meg az extracelluláris térben. A β-amiloid fehérje a profehérjéből (amiloid prekurzor) enzimatikus hasítással keletkezik és a PrPhez hasonlóan olyan konformációs átalakuláson megy keresztül, melynek révén hidrofób oldalláncok kerülnek felszínre, ami a fehérjék aggregációját váltja ki. Az Alzheimer-kór előfordulása sporadikus, azonban néhány genetikai hajlamosító tényezőt sikerült azonosítani. A Parkinson-kór esetében az agy substantia nigra területén megjelenő α-synuclein fehérje mutat prion jelleget. Az említett fehérje aggregálódása (βredőben gazdag konformáció felvételét követően) a dopaminerg neuronok halálát és ezáltal a motoros funkciók zavarát okozza. A prionokkal összefüggésbe hozható betegségek csupán egy töredékét alkotják a fehérjeszerkezet megváltozásához kapcsolt kórképeknek. Sokkal gyakoribb, hogy a fehérje elsődleges szerkezetében megjelenő aminosav-csere konformációs változást okoz a vadtípusú enzim szerkezetéhez képest, de 2

3 ahelyett, hogy prionbetegség alakulna ki, a fehérje érési folyamata vagy funkciója szenved zavart. Egy rendkívül szigorú sejten belüli minőség-ellenőrző rendszer biztosítja azt, hogy a mutációk miatt megváltozott, nem megfelelő harmadlagos szerkezetű fehérjék a citoszolban megtalálható proteaszómában degradálódjanak, ami azonban teljes funkciókieséshez vezet. Továbbá azok a fehérjekomplexek, melyekből valamelyik alegység a degradálódás következtében hiányzik, képtelenek funkciójuk maradéktalan betöltésére. Amennyiben a mutáció csak kismértékű változást indukál a harmadlagos szerkezetben, a fehérje elkerülheti a teljes lebontást, viszont a megfelelő sejtorganellumba történő irányítása, a stabilitása és/vagy a funkciója továbbra is károsodásokat szenvedhet. A továbbiakban ezekre mutatunk példákat. A cisztás-fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) egy transzmembrán pórust képző fehérje (ioncsatorna), melyen keresztül klorid ionok tudnak az elektrokémiai grádiensüknek megfelelő irányban áramlani. Normális esetben a CFTR felelős az epitheliális folyadéktranszport szabályozásáért. A CFRT-t kódoló gén mutációi cisztás fibrózis (CF) kialakulásához vezetnek, amely az európai fehér népességben előforduló leggyakoribb letális genetikai betegség (előfordulási aránya kb. 1:2500). A CF egy komplex, gyógyíthatatlan kórkép, mely elsősorban a vízháztartás egyensúlyának felborulásában nyilvánul meg. A legfontosabb klinikai tünetek: a légutakban felhalmozódó - és ilyen módon bakteriális fertőzéseknek táptalajul szolgáló nyák; hasnyálmirigy diszfunkció, ami felszívódási és emésztési zavarokhoz vezet; a férfi betegek sterilitása. A leggyakoribb genetikai rendellenesség a CFTR fehérje 508-as pozíciójában megtalálható fenilalanin kódoló kodonjának teljes kiesése (deléciója) (ΔF508), amely a CFTR fehérje expresszióját és funkcióját egyaránt érinti. A betegség tüneteinek kialakulását azonban alapvetően az ioncsatorna plazmamembránból való szinte teljes hiánya okozza. Membránfehérje lévén a CFTR az endoplazmás retikulumban (ER) szintetizálódik. Ezt követően a megváltozott harmadlagos szerkezetű ΔF508 CFTR fehérjét a minőség-ellenőrző rendszer felismeri és a proteaszómába irányítja, ahol az degradálódik. Egyelőre nem tisztázott, hogy egy fehérje-felszínen elhelyezkedő aminosav kiesése miként képes a CFTR szerkezet-funkció kapcsolatában ilyen mértékű változást okozni. 2. ábra: A CFTR térszerkezete. A zebrahal CFTR fehérjéjének szerkezetét krio-elektron mikroszkópiával 3,7 Å felbontással határozták meg. A transzmembrán hélixek (ciánkék) a kloridion-csatornát veszik körbe, ami ATP-kötés hiányában zárva tart. Az ATP kötése és hidrolízise két nukleotid-kötő doménen (NBD), az NBD1- en (zöld) és az NBD2-n (kék) történik. Az F508 aminosav (lila) az NBD1-en lokalizálódik. Számos vérképzési zavar hátterében is a fehérjeszerkezet megváltozása áll, bár ezek prevalenciája meglehetősen alacsony. Leggyakrabban a hemoglobin szerkezete érintett ilyen esetekben. A felnőtt hemoglobin (HbA) két α- és két β-globinból felépülő heterotetramer. Mindegyik alegység egy hem prosztetikus csoportot köt. Az α- vagy a β-alegységeket kódoló génekben bekövetkező mutációk az érintett 3

4 alegység csökkent expresszióját vagy akár teljes hiányát okozzák és ezáltal ún. thalasszémiák (α vagy β thalasszémia) kialakulásához vezetnek. Ezekben az esetekben a hemoglobin-komplex mind az alegységösszetétel, mind pedig az oxigénkötő-kapacitás tekintetében eltér a natív formától. A thalasszémiák nem tévesztendőek össze az anémiákkal, amelyek esetében a vörösvértestek száma sok lehetséges okra visszavezethető módon csökken. A két patológiás jelenség azonban gyakran nem választható el egymástól: a thalasszémia következtében zavart szenvedő hemoglobin-szintézis gátolhatja az eritrogenezist és így anémia kialakulásához vezethet. Ha a β-globint kódoló génben olyan mutáció jelenik meg, amely a fehérjelánc 6-os pozíciójában levő glutaminsavat valinra cseréli (jelölés: E6V), a β-alegység felszínén egy hidrofób terület alakul ki. Ez a hemoglobin (hemoglobin S, HbS) a dezoxi-formájában a vörösvértesteken belül hosszú helikális rostokká polimerizálódhat, melynek eredményeképpen a vörösvértestek jellegzetes sarló alakot fognak felvenni. A két mutáns allélt hordozó homozigóta betegekben súlyos patológiás állapot, az ún. sarlósejtes anémia alakul ki. A HbS-t tartalmazó vörösvértestek oxigénkötő-képessége alacsonyabb és a lebomlásuk is gyorsabb (az eritrociták számának akut csökkenését hemolítikus krízisnek nevezzük). A vérpályában keringő kevéssé rugalmas, sarló alakú vörösvértestek a kapillárisok eltömődését és a lép károsodását okozzák. Az alacsony oxigén-koncentráció (pl. magaslati levegő) súlyosbítja a tüneteket, mivel a dezoxi-forma kedvez a polimerizációnak. Érdekes módon a mutációra heterozigóta egyének bizonyos fokú rezisztenciát mutatnak a maláriával szemben, mivel a malária parazita (Plasmodium) kisebb hatékonysággal képes csak a deformálódott vörösvértestekben szaporodni. 3. ábra: Sarlósejtes anémia. a sarló-alakú eritrociták a vérben. b sarlósejtek által okozott elzáródás a kapillárisokban. Habár a hemoglobin glikációja (egy poszttranszlációs modifikációs lépés) nem egy betegséget okozó folyamat, orvosi szempontból mégis igen releváns. A glikáció cukor-egységek fehérjék aminosav oldalláncaihoz történő nem-enzimatikus kapcsolódása szemben a glikozilációval, amely egy enzimkatalizált folyamat. Az eritrocitákban a teljes hemoglobin-mennyiség egy része glikálódik csupán, jellemzően a β-alegység N-terminálisán keresztül (az így kialakuló hemoglobint HbA1c-ként jelöljük). A keletkező HbA1c mennyisége arányos a vércukor koncentrációjával. Mivel a vörösvértestek átlagos életideje kb. 120 nap, a glikált hemoglobin-szint (a klinikai gyakorlatban HbA1c %) a vizsgálatot megelőző megközelítőleg három hónapra vonatkoztatva mint átlagérték lesz jellemző és ebből adódóan a diabétesz terápia monitorozásának egy hasznos eszköze. Hiperglikémia (tartósan fennálló magas vércukorszint kezeletlen diabéteszben) esetében nem csak a hemoglobin, hanem számos egyéb fehérje (és lipid) is glikálódik, késői glikációs termékek (advanced glycation end products, AGE-k) keletkeznek. Az extracelluláris mátrix glikálódott fehérjéi nagymértékben 4

5 károsítják a kapillárisok és a vese glomerulusok bazális membránját. Ezen felül a glikáció következtében nő a kollagén keresztkötések száma is, ami a vérerek falának vastagodását és a kis-sűrűségű lipoprotein (LDL) megakadását, ilyen módon pedig az ateroszklerózis kialakulásának megnövekedett kockázatát vonja maga után. Az AGE-k a makrofágok és az endotheliális sejtek felszínén jelen levő endogén receptorokhoz (RAGE) is kötődhetnek, amely gyulladásos válasz kiváltásán keresztül endotheliális diszfunkcióhoz vezet. Látható tehát, hogy az AGE-k kiemelkedő szerepet játszanak a diabétesszel összefüggő kardiovaszkuláris szövődmények kialakulásában. Összefoglalásképpen elmondható, hogy a fehérjék szerkezetének megváltozása számos kórképnek a kiváltó oka. Betegség kialakulásához vezethet egy fehérje és/vagy funkciójának részleges vagy teljes hiánya (pl. CF-ben) vagy az aggregációjához köthető citotoxikus hatása. Az aggregációt a fehérje felszínére kerülő és ezáltal a vizes közegnek kitett hidrofób felület megjelenése indítja el, amely bekövetkezhet egy fehérjetermészetű fertőző ágens (PrP Sc ) vagy pedig egy megváltozott szerkezetű endogén fehérje (βamiloid, α-synuclein, hemoglobin S) jelenléte miatt is. Végezetül pedig, bizonyos poszttranszlációs módosítások olyan faktorok képződéséhez vezethetnek (pl. glikáció révén kialakuló AGE-k), amelyek (elsősorban szív és érrendszeri) betegségek kialakulását indukálják vagy éppen a kórképet súlyosbítják. 5