Lehet ségek és kihívások a modern bionmr spektroszkópia területén

Átírás

1 Lehet ségek és kihívások a modern bionmr spektroszkópia területén Perczel András és munkatársai Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium és ELTE-MTA Fehérjemodellez Kutatócsoport ELTE/TTK/FI/ Ortvay kollokvium december 9. 1

2 The Nobel Prize in Physics 1952 "for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith Felix Bloch ( ) Edward Mills Purcell ( ) 2

3 The Nobel Prize in Chemistry 1991 "for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy" Richard R. Ernst 3

4 Fehérjék oldatban: NMR-spektroszkópia Fehérje NMR: kémiai Nobel-díj, 2002 Kurt Wüthrich A dinamikára és a bels mozgásra is reflektáló szerkezeti sokaság 4

5 NMR spektrum spinrendszerek azonosítása sa spinrendszerek szekvenciális rendezése kényszerfeltételek telek alapján szerkezetszámol molás 5

6 Miért az NMR? Powerful modern structural tools for looking at complexes (OHFWURQ PLFURVFRS\ a &U\VWDOORJUDSK\ a VWUXFWXUHV 0RGHOOLQJ 1XFOHDU 0DJQHWLF 5HVRQDQFH a 6 FDQ DOVR JLYH. G DQG N

7 Az NMR-spektroszkópia szükséges feltétele a nullától különböz magspin (I 0) 1) I=0, ha mind a protonok mind a neutronok száma páros: ( 12 C, 16 O) 2) I=1/2, ha tömegszáma páratlan ( 1 H, 3 H, 13 C, 15 N, 19 F, 57 Fe, 113 Cd) vagy a protonok, vagy a neutronok száma páratlan. 3) I=k (k=1,2,..) mind a protonok mind a neutronok száma páratlan ( 2 H, 14 N) Küls mágneses tér tér hatására hiányában rendez dött a magok és spinjei precesszáló rendezetlenül magok állnak 7

8 Feles spin esetén az impulzusmomentum (perdület) z-komponensének operátora: Î Z - két sajátfüggvénye: +½ és ½ - két sajátértéke van: +½ és ½ A megfelel két sajátérték egyenlet: Î Z +½ = +½ +½ és Î Z ½ = +½ ½ vagy röviden Î Z m = m m ahol m ±½. A feles-spin Hamilton-operátorának sajátértékei: Az impulzusmomentum z-komponense (Î Z ) és a B 0 indukciójú mágneses tér (B 0 z) kölcsönhatását egyetlen spin esetében leíró H-operátor: egy-spin = B 0 Î z ( ahol = giromágneses együttható) a +½ és ½ függvények a egy-spin nek is sajátfüggvényei (hiszen Î Z t l csak a B 0 konstansban tér el. ). A megfelel egyik sajátérték egyenlet tehát : one-spin +½ = B 0 [Î Z +½ ] = B 0 [+½ +½ ] = ½ B 0 +½ Tehát egy-spin egyik sajátfüggvénye a +½, melyhez tartozó sajátérték a ½ B 0, míg a másik sajátfüggvénye a ½, melyhez tartozó sajátérték a +½ B 0. 8

9 Az egy-spin spektruma: Spin ½ esetén tehát 2 energiaszint van: E m = m B 0 Tehát E +½ = ½ B 0 (E vagy spin up), illetve E ½ = +½ B 0. (E vagy spin down) ahol m ±½. A kiválasztási szabály értelmében (mivel m = +1 vagy -1) a m = ( ½) +(½) = 1, tehát az az -ból -ba való átmenet megengedett. 0 = B 0 /2 E β E 0 E =E E = +½ B 0 ( ½ B 0 ) = B 0 h = (h/2 ) B 0 = 0 = B 0 /2 ami a Larmor-frekvencia E β E B0 Pl. Ha B 0 = 9,4T és = 2, rad s -1 T -1 (protonra) akkor a Larmorfrekvencia = 4, Hz ~ 400MHz 9

10 Két csatolt spin spektruma: Ha az egy-spin: egy-spin = 0 Î z, akkor két csatolatlan spin esetében: két-spin, csatolatlan = 0,1 Î 1z + 0,2 Î 2z = I Î z + S z, illetve két csatolatlan spin esetében: két-spin, csatolat = I Î z + S z + J 12 Î z z, ahol J 12 a skaláris csatolási állandó spin1 és spin2 között. Két-spin rendszer energiadiagramja, a megengedett átmenetek és a spektrum: α β β β β α átmenet spin állapotok frekvencia 12 αα S ½J S +½J I ½J I +½J 12 α α J 12 J 12 I S 10

11 Küls B 0 indukciójú mágneses térben a makroszkopikus mágnesezettség (M) gerjesztése, annak precessziójához vezet, amely mérhet indukált feszültséget (mv) eredményez. 11

12 A Vektor modell és a Bloch-egyenletek z-irányú mágnesezettség id beni alakulása: dm z' /dt= (M z' M o )/T 1 M z' (t)=m o (1 exp( t/t 1 ) az x,y-síkban zajló csillapított amplitúdójú precesszió alakulása: dm x' /dt= (ω o ω)m y' M x' /T 2 dm y' /dt= (ω o ω)m x' M y' /T 2 Csatolt differenciál-egyenletrendszer megoldásaként a következ t kapjuk: M x' (t)=m o exp( t/t 2 )sin(ω o ω) M y' (t)=m o exp( t/t 2 )cos(ω o ω), ahol (ω o ω) a forgó referencia rendszerben a precesszió szögsebessége. A nagy felbontású NMR-spektrumok öt jellemz paramétere: csatolási állandó (J érték) félértékszélesség multiplicitás terület kémiai eltolódás δ=[(υ M -υ R )/ υ R ]

13 13

14 spinrendszerek azonosítása sa 1 H-spektrum I I z és S z S -I y és -S y és I x sin(ω I t 2 ) S x sin(ω S t 2 ) I S F1(ppm) 14 A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk

15 spinrendszerek azonosítása sa Egy ~17 kda globuláris fehérje 1 H-spektruma H 2 O/D 2 O 9/1, T=300K, c 1mM amid aromás H α alifás metil (ppm)

16 1. spinrendszerek azonosítása sa 2. spinrendszerek szekvenciális rendezése 3. kényszerfeltételek telek alapján szerkezetszámol molás 16

17 spinrendszerek azonosítása sa Homonukleáris eljárás (homonukleáris 3 J, M<8kDa) ( 1 H- 1 H COSY, 1 H- 1 H RELAY, 1 H- 1 H TOCSY ) Heteronukleáris eljárás (heteronukleáris 1 J, 2 J, 3 J) 15 N-szerkesztés (M <15kDa) ( 1 H- 15 N TOCSY-HSQC, 1 H- 15 N NOESY-HSQC ) 15 N, 13 C-szerkesztés (M <20kDa) (HNCA, HNCOCA,.) 15 N, 13 C-szerkesztés ( 2 H) (M <30kDa) 17

18 spinrendszerek azonosítása sa Peptidekben és s a fehérj rjékben az aminosavak hidrogénatomjai elkülönül spinrendszereket alkotnak 13 J Ala Ser Glu Gly Phe Cys 18

19 A Vektor modell és a Bloch-egyenletek helyett a szorzatoperátor-elmélet Alapfogalmak: magspin-operátor vagy impulzusnyomaték-operátor: Î Î = Î x, Î y, Î z az id t l függ spins r ség-operátor az id t l függ Hamilton-operátor az id t l függ, normalizált állapotfüggvény σ(t) (t) ψ(t) Az alapegyenlet: dσ(t)/dt = i 1 [ (t),σ(t)] Liouville- von Neumann-egyenlet Mi kerül a Hamilton-operátorba? Az I és S spinek (AX spinrendszer) esetén, oldatfázisban: Zeeman-effektust + a skaláris csatolást + a rádiófrekvenciás gerjesztést leíró három tag. = ω 1 Î x ω 2 x + JÎ z z Ω I Î z Ω S z 19

20 Cél a mérhet makroszkopikus mágnesezettség-vektor (M) nagyságának és moduláltságának meghatározása: A megfigyelhet makroszkopikus mágnesezettség pl. M y következ : M y (t) = Nγ Tr[ΣI ky σ(t)] k összetev je a ahol γ és mellett, N az egységnyi térfogatban vett spinek darabszáma. A feladat: A magspin operátor (I) valamint a s r ségoperátor {σ(t)} szorzatának valamilyen bázison vett mátrixreprezentációjának a spurját (Tr) kell meghatároznunk! A nagy kérdés: mi legyen az alkalmas bázis? Mi legyen az s elemb l álló báziskészletet (B s )? σ(t) =Σ b s (t)b s s A megoldás: a B s báziskészlet legyen a spin impulzusmomentum-operátor. Sorensen korábbi javaslata értelmében a Descartes-típusú I kl bázisoperátorok használata az alábbiak szerint felettébb eredményes: B s = n ( q 2 1 ) k = 1 ( I ) kl a sk 20

21 Az I és S spinek (AX spinrendszer) 16 bázisoperátort táblázatos alakban: E E E S x S x S y S y S z S z B s elemeihez milyen fizikai kép rendelhet? mágnesezettség (populáció, NOE) I x I x 2I x S x 2I x S y 2I x S z szin-fázisú egyszeres kvantumkoherenciáik. I y I z I y I z 2I y S x 2I z S x 2I y S y 2I z S y 2I y S z 2I z S z S spinen lokalizálható ellentétesfázisú koherenciák I spinhez tartozó ellentétesfázisú koherenciák 21

22 Tipikus transzformációk a 16 bázisoperátor által kifeszített koherencia-térben: σ (t=0) = hb 0 (γ I I y + γ S S z )/(8πkT) H = Ω I I z + Ω S S z πj IS I z S z σ (t=0) S z [Ω s t] I y σ (t=0) σ (t) σ (t) I z [Ω I t] + I y cos(ω I t) - I x sin(ω I t) 2I z S z (J IS πt) + I y cos(ω I t)cos(j IS πt) - 2I x S z cos(ω I t) sin(j IS πt) - I x sin(ω I t) cos(j IS πt) - 2I y S z sin(ω I t) sin(j IS πt) I y I y 22

23 + I y cos(ω I t)cos(j IS πt): cos(a)cos(b) = 1/2[cos(A+B)+cos(A B)] következ en a spektrum alakja: +1/2I y [ +cos{(ω I +πj IS )t} + cos{(ω I πj IS )t} ] I y [ +a, +a] Ω I kémiai eltolódásértéknél memo: az spektrum a Bloch-egyenlet alapján: S(t) = C*exp( t/t 2 )cos(ω I t). I 1 H-spektrum I z és S z S -I y és -S y és I x sin(ω I t 2 ) S x sin(ω S t 2 ) I S F1(ppm) A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk 23

24 spinrendszerek azonosítása sa I 1 H- 1 H COSY (homonukleáris korrelációs spektrum) 2I z S y sin(ω I t 1 ) S Ω S I y S x sin(ω I t 1 )cos(ω S t 2 ) Ω I 2I y S z sin(ω I t 1 ) Ω I Ω S 24

25 spinrendszerek azonosítása sa 1 H- 1 H COSY NH Hγ2 γ2 H H γ1 H β H β H γ1 H γ2 H F 1 (ppm) Ω S NH Ω I Ω I Ω S F 2 (ppm) 25 A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk

26 spinrendszerek azonosítása sa Fehérje modul 1 H- 1 H COSY spektruma 26

27 spinrendszerek azonosítása sa 1 H- 1 H TOCSY protonok teljes korrelációját létrehozó spektrum I NH H γ1 Hγ2 γ2 H S 1 S 2 H β 3S H 4 γ1 H3S γ2 3 I y K H H β F 1 (ppm) S kx β od sin(ω I t 1 )cos(ω S t 2 ) k=1 diagonális jelek diagonálison kívüli jelek NH β od = diagonálison F 2 (ppm) kívüli intenzitások 27 A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk

28 spinrendszerek azonosítása sa Fehérje modul 1 H- 1 H TOCSY spektruma 28

29 Heteronukleáris egyszeres-kvantum koherencia spektrum HSQC = Heteronuclear Single-Quantum Coherence 1,1 J~90Hz H z Ω N -2H z N y +2H z N y cos(ω N t 1 ) H x cos(ω N t 1 ) H x cos(ω N t 1 )cos(ω H t 2 ) Ω H 29

30 A kalmodulin 1 H- 15 N HSQC spektruma (ppm) A kalmodulin 1 H spektrumának amid NH és aromás tartománya J 90 Hz (ppm) (ppm)

31 spinrendszerek azonosítása sa 15 N-szerkesztéssel 3D-TOCSY-HSQC 2I z β od cos(ω K t 1 ) 2I z cos(ω I t 1 ) I x β od cos(ω K t 1 )cos( N t 2 ) I x β od sin( I t 3 ) cos( N t 2 ) cos(ω K t 1 ) -I y N K I Ω H 2I z N y β od cos(ω K t 1 ) 2I z N y β od cos(ω K t 1 )cos( N t 2 ) Ω N Ω NH 31 β od = off diagonális intenzitás A J IK okozta modulációtól eltekintünk

32 spinrendszerek azonosítása sa 15 N-szerkesztett TOCSY spektrum 1 H- 1 H TOCSY amid NH (ujjlenyomat) tartománya Homonukleáris 2D TOCSY 32

33 spinrendszerek azonosítása sa 15 N-szerkesztett 2D TOCSY 1 H 1 H- 1 H TOCSYamid NH (ujjlenyomat) tartománya 1 H 15 N 1 H- 15 N 3D TOCSY-HSQC csíkok EVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAACTLKACPQ 33

34 (AMX) Ser (AX) Gly 1. spinrendszerek azonosítása sa (A 3 X) Ala (A 2 M 2 X) Glu 2. spinrendszerek szekvenciális rendezése 3. kényszerfeltételek telek alapján szerkezetszámol molás 34

35 A szekvenciális hozzárendel rendelés és s a szerkezetszámol molás s alapja a nukláris Overhauser- effektus (NOE) 6Å (NOE) Távolság jelleg adatok 35

36 spinrendszerek azonosítása sa Fehérje modul 1 H- 1 H NOESY spektruma 36

37 spinrendszerek szekvenciális rendezése A spinrendszereks szekvenciális rendezését biztosító H α i-1 -HNH NH i NOE-k Ala Ser Glu Gly Phe Cys 37

38 spinrendszerek szekvenciális rendezése Ala Glu Ser A szekvenciális hozzárendel rendelés Phe Gly Cys Ala Ser Glu Gly Phe Cys 38

39 (AMX) Ser (AX) Gly 1. spinrendszerek azonosítása sa (A 3 X) Ala (A 2 M 2 X) Glu 2. spinrendszerek szekvenciális rendezése - Ala Ser Glu - Gly - 3. kényszerfeltételek telek alapján szerkezetszámol molás 39

40 szerkezetszámol molás Fehérje modul 1 H- 1 H NOESY spektruma 40

41 Fehérjék NMR-szerkezetvizsgálata Kurt Wüthrich (ETH, Zürich) OmpX bakteriális membránfehérje térszerkezete Mozgékony szekvenciarésszel rendelkez prion fehérje 41

42 Biomolekulák dinamikai vizsgálata GCN4 éleszt transzkripciós faktor gerinc-dinamikájának vizsgálata Arthur G. Palmer III (Columbia University) 42

43 Fehérje feltekeredés vizsgálatok (ns és ms id skálán) Alan Fersht (Cambridge University) 43

44 Our most recent targets: dutpase Beáta Vértessy Calpastatin Péter Tompa MASP-2 Péter Gál CCP Péter Gál APPase László Polgár Peptides and miniproteins Gábor Tóth Homeodomains Botond Penke P DLC László Nyitray Calmodulin Ovádi Judit 44 Inhibitors László Gráf

45 (Emil Fischer) 45

46 A kalmodulin reorientációja célfehérje vagy antagonista hatására a molekula összecsuklik, - az N- és C-terminális közel kerül egymáshoz, - ám a D és az E -hélixeket összeköt részr l az alacsony elektrons r ség miatt nincs krisztallográfiai információ együttm ködésben Ovádi Judittal és munkatársaival (MTA SZBK Enzimológiai Intézet) 46

47 Vinca alkaloidok (biszindol) mint CaM antagonisták Catharantus (Vinca) roseus alkaloidjai (vinblasztin, vinkrisztin) VBL - sejtosztódásgátló hatás (kemoterápia) - célpontjuk a sejt mikrotubuláris hálózata - jelent s mellékhatások (neurotoxicitás) Vinblasztin KAR - In vivo kísérletekben ugyanolyan hatékonynak bizonyult, mint a természetes vinca alkaloidok - Mellékhatása jóval kisebb KAR-2 Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, 947 Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, Orosz és mts. British J.Cancer 1999, 79, 1356

48 A kalmodulin 1 H- 15 N HSQC spektruma (ppm) A kalmodulin 1 H spektrumának amid NH és aromás tartománya J 90 Hz (ppm) (ppm)

49 A kalmodulin KAR2 vel való titrálása során kapott 1 H- 15 N HSQC spektrumok összevetése l5 N 49 l H

50 Ligandkötés azonosítása 50

51 Az ERD-14 egy szerkezetnélküli fehérje: lombiktól az él sejtig G Tompa 51Péter Szalainé Ágoston Bianka

52 Dehidrin = abiotikus stressz (abszcizinsav) hatására fejez dik ki a növényben: vízhiány, magas sótartalom (NaCl), hideg ERD14 = Early Response to Dehydration aminosav, 20 kda rendezetlen fehérje sok poláris, töltött aminosav kevés hidrofób aminosav 52

53 TROSY-HSQC spektrum 15 N J 90 Hz 1 H 800 MHz 10 mm MES ph K 53

54 Az ERD14-nek nincs oldatban térszerkezete (valójában túl sok is van neki) Relaxációs mérések: hetnoe 5 régió, amely 5-25 % helikális hajlammal rendelkezik 54

55 Vizes oldat vagy puffer sejt Ez különösen igaz rendezetlen fehérjékre: A fehérjezsúfoltság / crowding a sejten belül sokat számíthat! Él sejtben kell mérni! E.coli az NMR cs ben 55

56 NMR él E.coli-ban in cell NMR E.coli ERD14 kifejeztetés S r sejtszuszpenzió az NMR cs ben 500 MHz sejtekben 277 K Pufferben Él sejtekben Sejtek felülúszója üres spektrumot ad 56

57 Kontroll az in cell NMR-hez Dextrán: Sejten belüli állapotot (fehérjes r séget és viszkozitást) utánoz Itt nem t nnek el a jelek Puffer Puffer + 150g/L dextrán => Puffer Amit látunk, + 300g/L tényleges köt dés, dextrán kölcsönhatás! 57

58 Szerkezet sejtben = Rendezetlen Elt n Elmozduló Helyükön maradó csúcsok 5 régió, amely valamihez köt dik a sejtben 58

59 A molekuláris mozgás id skálái hurkok és kanyarok záródása 0.1ms 10ms másodlagos szerkezeti elemek 10ns 1ms feltekeredés 1ms 1h H/D R ex Rot. Dif. korrel. id 1ns<τ c < 10ns gerinc dinamika 1ps 10ns τ lokális aggregáció 1 s 1 év Kiss Róbert τ effektiv = τ C +τ lok. oldallánc forgás 0.1ps 1059 ps

60 ~ 1s ~ 100 ezer 1h ~ 30 millió 1év 60

61 A fehérjék bels dinamikája NMR ps 10-9 ns 10-6 µs 10-3 ms 10 0 s 10 2 ~min sec feltekeredés kötések mozgásai domének, nagyobb szerkezeti egységek mozgásai Shifman J M et al. PNAS 2006;103:

62 A fehérjék bels dinamikája NMR ps 10-9 ns 10-6 µs 10-3 ms 10 0 s 10 2 ~min sec R 1, R 2, NOE R 1 ρ CPMG Line-shape analízis ZZ- csere 62

63 Fehérjék mozgása; µs-ms id skála Bels dinamikája lefedi a különböz partnerfehérjékkel alkotott komplexeiben észlelt konformációs variációkat. R 1, R 2, NOE R 1 ρ NMR /RDC X-ray különböz partnerfehérjékkel µs-ms id skálájú mozgások alapján számolt S 2 Ubiquitin; a halál csókja Lange és mts., Science, 2008, 320,

64 Fehérjék mozgása; ns-ps id skála NMR /NOE + S 2 MUMO szerkezeti sokaság Gáspári Zoltán X-ray a komplexr l R 1, R 2, NOE R 1 ρ f komponens-elemzés Az inhibitor bels dinamikájával számolt térszerkezetek lefedik az enzimmel alkotott komplexben (3 eltér komplex) mért röntgen konformereket. 64 Gráf László

65 Köszönet minden munkatársamnak és barátomnak 65

66 Fehérjék szerkezete: mit rejt a kristály? Fehérje röntgenkrisztallográfia: kémiai Nobel-díj, 1962 Max Perutz, John Kendrew kristályban az egyes atomok helye térben jól meghatározott részletgazdag szerkezet 66

67 spinrendszerek azonosítása sa 2H z N x C (i-1) z cos( N t 1 ) és 2H z N x C (i) 3D-NHCA z cos( N t 1 ) 2H z N y cos( N t 1 ) H z H x cos( N t 1 ) cos( C (i) t 2 ) cos( H t 3 ) és H x cos( N t 1 ) cos( C (i-1) t 2 ) cos( H t 3 ) 2H z N y Ω C (i) C α(i- 1) H N C α(i) 2H y N x C y (i-1) cos( N t 1 ) és 2H y N x C y (i) cos( N t 1 ) 2H y N x C (i-1) y cos( N t 1 ) cos( C (i) t 2 ) és 2H y N x C (i) y cos( N t 1 ) cos( C (i-1) t 2 ) Ω NH Ω C (i-1 Ω N 67 A skaláris csatolás okozta modulációktól eltekintünk