A BioNMR spektroszkópia alapjai

Átírás

1 A BioNMR spektroszkópia alapjai

2 Az NMR-spektroszkópia szükséges feltétele a nullától különböző magspin (I 0) 1) I=0, ha mind a protonok mind a neutronok száma páros: ( 12 C, 16 O) 2) I=1/2, ha tömegszáma páratlan ( 1, 3, 13 C, 15 N, 19 F, 57 Fe, 113 Cd) vagy a protonok, vagy a neutronok száma páratlan. 3) I=k (k=1,2,..) mind a protonok mind a neutronok száma páratlan ( 2, 14 N) klasszikus modell: atommag egy töltéssel rendelkező részecske, mely továbbá egy adott tengely mentén forog. Töltéssel rendelkező mag + forgás = köráram létesítése köráram mágneses momentum (µ). Bio-NMR : Feles spin kvantumszámú (I=1/2) magok, ahol a µ egy mágneses dipolmomentum vektorral (rúdmágnessel) modellezhető. A mágneses dipólmomentum (µ) arányos a szögimpulzus-momentum vektorral (I). Giromágneses állandó (γ) egy, az atommagra jellemző mennyiség: µ =γ I.

3 Külső mágneses tér hiányában a magok spinjei rendezetlenül állnak kérdés: Egy ilyen elemi dipólmomentum vektor (µ) a külső térerőnek (B o ) megfelelően, azzal párhuzamos irányba rendeződik-e? válasz: Nem! magyarázat: Az említett atommagokhoz mágnese tulajdonsága mellett forgó mozgást is rendeltünk, ezért az elemi mágneses dipólmomentum vektorok (µ) a külső sztatikus mágneses térre (B 0 ) merőleges sík szerinti forgó mozgást, úgynevezett precessziót fognak végezni.

4 B 0 Külső mágneses tér hatására rendeződött és precesszáló magok z y B 0 x Külső mágneses tér hatására rendeződött és precesszáló spinek (közös origóból ábrázolva)

5 B 0 és B 1 után a helyzet: (búgócsiga modell) Impulzusmomentum ω o szögsebesség nagysága arányos a külső statikus térerő nagyságával: ω o = γb o. Az ω o szögsebességgel arányos ν o (Larmor-frekvencia): ν o = ω o /2π. A mágneses dipólmomentum vektor (µ) időbeli változását a következő vektoriális szorzat írja le: dµ/dt = γ B o µ Forgásirány Forgó korong impulzusmomentuma

6 A makroszkopikus-, globális- vagy mérhető-mágnesezettség (M), a megfelelő elemi vagy mikroszkopikus mennyiség additív összege: M = Σ µ i Ennek segítségével a Larmor-precesszió átírható makroszkopikus alakba: d M /dt = -γ B o M A µ i vektoroknak kizárólag a B o -al párhuzamos, szokásosan z irányúnak nevezett komponensei adódnak konstruktívan össze. A termikus egyensúly állapotában tehát, a M z = Σ (µ z ) i a tehát I =1/2 (pl. 1, 13 C, stb.) akkor a (2I+1)=2, azaz két állapot; két kvantumállapotot α> és β> két energia (E α és E β ) két betöltöttségek (N α és N β ) N / N β α = exp (- E/kT). Az egy átmenet (Zeeman-átmenet) energiakülönbsége ( E): E=hγΒ /2π ο

7 A BLOC-egyenletek z-irányú mágnesezettség időbeni alakulása: dm z' /dt= (M z' M o )/T 1 Az egyszerű differenciál-egyenletet megoldásaként a következő függvényt kapjuk: M z' (t)=m o (1 exp( t/t 1 ) az x,y-síkban zajló csillapított amplitúdójú rotációt precesszió alakulása: dm x' /dt=(ω o ω)m y' M x' /T 2 dm y' /dt= (ω o ω)m x' M y' /T 2 Csatolt differenciál-egyenletrendszer megoldásaként a következőt kapjuk: M x' (t)=m o exp( t/t 2 )sin(ω o ω) M y' (t)=m o exp( t/t 2 )cos(ω o ω), ahol (ω o ω) a forgó referencia rendszerben a precesszió szögsebessége.

8 Ennek a függvény a Fourier-transzformáltja az NMR-spektrum.

9 Külső mágneses térben a makroszkopikus mágnesezettség gerjesztése annak precessziójához vezet, amely mérhető indukált feszültséget eredményez

10

11 A nagy felbontású NMR-spektrumok öt jellemző paramétere: csatolási állandó (J érték) félértékszélesség multiplicitás terület kémiai eltolódás δ=[(υ M -υ R )/ υ R ]10 6 Jellegzetes proton kémiaieltolódás értékek COO CO N=C Ar RCONQ Ar-O C=C RO RQN C C 2 C 3 TMS

12

13 Spin-spin csatolás (a színkép finomszerkezete) a b A B A és B magok indirekt módon a és b elektronokon keresztül csatoltak. A jelenség a spin-spin felhasadás, a skaláris csatolás vagy a J-csatolás dublet mintázat

14 triplet mintázat kvadruplet mintázat

15

16

17

18

19

20 Jellegzetes 13 C kémiaieltolódás értékek CO CO COO COOQ CONQ CN Ar alkin alkilhalogenid alkilamin alkén alkán CO (alkohol, éter)

21

22

23 Solvent dependence of chemical shifts *chemical shift changes with solvent used*

24 p dependence of chemical shifts 13 C-NMR spectra of wild type BCX (xylanase from Bacillus circulans) recorded as function of p at 25C. Peaks corresponding to E78 and E172 are highlighted black to emphasize the titration of these residues. McIntosh, L.P. et al. Biochemistry 35 (1996) 9958.

25 p dependence of chemical shifts 13 C-NMR spectra of wild E172Q BCX recorded as function of p at 25C. The peak corresponding to E78 is highlighted in black. McIntosh, L.P. et al. Biochemistry 35 (1996) 9958.

26 Temperature dependence of chemical shifts double stranded single stranded (imino protons exchange with water protons) O O N N N N 2 N N N guanine N N N N 2 N N N O N O N cytosine imino resonance signals of d(gcgcgcgc) 2 in water

27 Peptid és fehérje NMR-spektroszkópia alapjelenség eltérő kémiai környezet eltérő rezonancia frekvencia N α- β- γ-

28 Peptid és fehérje NMR-spektroszkópia 1. jelhozzárendelés a jelhozzárendelés vagy spektrum asszignáció ez előbbi megfigyelésen alapszik eltérő rezonancia frekvencia eltérő kémiai környezet N α- β- γ-

29 omonukleáris NMR-spektroszkópia egy dimenzióban N(W indol) N(amid gerinc) N(amid oldallánc) (aromás) C(α) C(ε) C(β) C(δ) C(γ) C 3 TMS

30 omo- vagy eteronukleáris NMR-spektroszkópia két dimenzióban

31 DQF-COSY = Double-Quantum Filtered- COrrelated SpectroscopY TOCSY =TOtal-Correlated SpectroscopY NOESY = Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY

32 Ala A 3 X COSY * N C C C 3 O α β TOCSY Gly COSY α 1 α 2 AX TOCSY * O N C C

33 Val A 3 B 3 MX COSY * O N C C C C 3 C 3 α β γ 1 γ 2 TOCSY Lys COSY A 2 (F 2 T 2 )MPX * O N C C C C 2 C 2 α ε β 1 β 2 γ δ TOCSY C 2 N 2

34 Leu A 3 B 3 MPTX COSY α β 1 β 2 γ δ 1 δ 2 TOCSY * N O C C C C C 3 C 3 Ile A 3 MPT(B 3 )X COSY α β γ 11 γ 12 γ 2 δ TOCSY * N O C C γ 2 C C 3 C γ 11 γ 12 C 3

35 J típus COSY AMX O N * C C C R α β 1 β 2 TOCSY R = O Ser S Cys COO Asp CON 2 Asn C 6 5 Phe C 6 5 O Tyr C 3 3 N 2 is C 8 6 N 1 Trp

36 Phe gyűrű COSY AA XX M N * O C C δ C 2 ε ζ δ ε ζ TOCSY Tyr gyűrű COSY AA XX * O N C C C 2 δ δ ε TOCSY ε O

37 is gyűrű COSY AX O N C C * C 2 N δ 2 ε 1 N * TOCSY Trp gyűrű COSY A(X)MP + A * N O C C C 2 N * δ ζ 2 ε 3 ε 3 η 2 ζ 2 ε 3 δ ε 3 η 2 TOCSY

38 NOESY B D β Ala A G F C α Ala β1 Ser β2 Ser E α Ser N Ser N Ala TOCSY E C CO F C C N G D CO O Ser intrareziduális NOE (A,B,E,F,G) A C N B C 3 Ala interreziduális NOE (C,D)

39 omonukleáris NMR-spektroszkópia Jelhozzárendelés

40 Peptid és fehérje NMR-spektroszkópia 2. szerkezetmeghatározás Távolság jellegű adatok (NOE) 3D-szerkezet

41 1-1 -NOESY

42 Schistocerca gregaria kimotripszin inhibitor (SGCI) hidrofób magja

43 Makromolekulák 3D szerkezetének meghatározása NMR adatok alapján NMR spektrumok NMR jelhozárendelés távolság jellegű kényszerfeltételek torziószög típusú kényszerfeltételek Kezdeti szerkezet distance geometry restrained dynamics simulated annealing IGEN Konvergencia? Restrained dynamics Restrained minimization NEM 3D szerkezet

44 Egy helikális fragmens szerkezetének finomítása

45 Makromolekulák 3D szerkezetének Meghatározása NMR adatok alapján

46 Miért NMR? Powerful modern structural tools for looking at complexes Electron microscopy ~190 Crystallography ~ 45,000 structures Modelling Nuclear Magnetic Resonance ~7,500 - can also give Kd and k

47 eteronukleáris egyszeres-kvantum koherencia spektrum SQC = eteronuclear Single-Quantum Coherence z -2 z N y +2 z N y cos(ω N t 1 ) x cos(ω N t 1 ) x cos(ω N t 1 )cos(ω t 2 ) Ω N Ω

48 3D-NOESY-SQC

49 2D és 3D NMR-spektrumok összevetése omonukleáris 2D TOCSY omonukleáris 2D TOCSY amid N (ujjlenyomat) tartománya 1-15 N 3D TOCSY csíkok (strips) EVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAACTLKACPQ

50 A proteomika és genomika korát éljük több mint 800 organizmus teljes genom ismert az emberi genom gén fehérje a gyümölcsök nem maguktól érnek meg új közelítésmód szükséges: szerkezeti genomika (structural genomics) Mi a szerkezeti genomikában az NMR szerepe: fehérje szerkezet található a PDB, ebből 17% NMR (2200) és 82% Röntgen (2001 január) célkitűzés: minden szerkezet minden fehérjecsalád egy-egy reprezentatív elemének meghatározása (Prestegard et al. Biochem. 2001, 40,

51 A program: Nagy mennyiségű fehérje expresszálása - Európa (einemann Nat. Struct. Biol. 2000) - Japán (Yokoyama et al. Prog. Biophys.Mol.Biol.2000) - USA (NI) 7 kiemelt centrum (Terwillinger Nat. Struct. Biol. 2000) Legfontosabb eszközök: - röntgenkrisztallográfia - NMR spektroszkópia Az NMR szerepe: - kristályosítás peremfeltételeinek optimálása - a helyes feltekeredés társmolekuláinak azonosítása - alternatív szerkezetmeghatározó eszköz - ha nincs egykristály - aggregáció esetén - poszttranszlációs módosítás esetén - membrán fehérje esetén Japán RIKEN (39 spektrométer) pl. hélix köteg (helical bundle) fehérjék 75 millió $/év a teljes genom 15 milliárd Ft/év akár % ilyen fehérje

52 Az NMR mint szerkezetmeghatározó eszköz: - NOE alapú közelítés (mérethatár <50kDa) (nem deuterált de 15 N és 13 C jelölt minta <25kDa) molekulatömeg vonalszélesség spektrális felbontás Kedvező tény: fehérjék átlagos doménjének mérete: 17kDa ( 150 aminosav) atékonyság: csúcs: egy 90 aminosav hosszú fehérje esetében plazmidtól a 3D szerkezetig mindössze 30 nap (Kozlov et al. J.Biomol.NMR 2000) stratégia: automatizáció

53 Az NMR mint rosta (screening tool): -az amidok N frekvenciáin keresztül kiszűrjük a fehérje rendezetlen részeit (CLEANEX wang et al. J.Am.Soc.Chem. 1997, 119, 6203) - a kémiai eltolódásban rejlő információk kiaknázása ( 1-15 N correlation (e.g. SQC)

54 The Nobel Prize in Chemistry 1991 Richard R. Ernst "for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy"

55 The Nobel Prize in Chemistry 2002 Kurt Wüthrich "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules"

56 Magnetic Resonance Imaging (MRI) a gyógyászatban előnyök: - nem használ ionizáló sugárzást mint a röntgen - nem kell festék vagy kontrasztanyagot bevinni - lágy-szövetek kontrasztosabbak kivitelezés: tipikus 1 -NMR kisérlet ahol a szöveteket felépítő sejtek protonjait figyeljük meg. képalkotás függ: az adott szövetben lévő protonok számától, az adott protonok relaxációs idejétől (T1 spin-mátrix relaxációs idő és T2 spin-spin relaxációs idő) felhasználási terület: tumor sejtek, ödémák, koros elváltozások azonosítása 31 P-NMR sejt-metabolizmusok követése

57 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2003 Paul C. Lauterbur The Lancet, : "for their discoveries concerning magnetic resonance imaging" Sir Peter Mansfield RepProgPhys, :