MÁGNESES MAGREZONANCIA A KÉMIÁBAN, GYÓGYSZERÉSZETBEN, ORVOSTUDOMÁNYBAN

Átírás

1 MÁGNESES MAGREZONANCIA A KÉMIÁBAN, GYÓGYSZERÉSZETBEN, ORVOSTUDOMÁNYBAN 1) A jelenség 2) Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 3) Magnetic Resonance Imaging (MRI) 4) Magnetic Resonance Spectroscop (MRS)

2 NMR és Nobel díj 1952 Fizika Módszer és elméleti alapok Feli Bloch Edward Mills Purcell 1991 Kémia Nag felbontású NMR spektroszkópia Fourier transzformáció, 2D technika Richard Ernst 2002 Kémia Biológiai makromolekulák 3D szerkezete Kurt Wüthrich 2003 Orvosi MRI (Magnetic Resonance Imaging) felfedezése Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield

3 Atommagok mágneses tulajdonságai spin Mag Proton Kvark fel Kvark fel Kvark le Töltések: Kvark fel : +2/3 Kvark le : -1/3 1/2 1/2 Neutron Kvark fel Kvark le Kvark le Proton : +1 Neutron : 0 1/2 1/2 Spin: saját, belső impulzusmomentum (perdület megtévesztő, mert azt sugallja, hog a részecske saját tengele körüli forgásából adódik) A protonok és neutronok a legalacsonabb energiaszintű pálákat igekeznek elfoglalni (ebben az elektronokkal megegeznek), és az ellentétes spinűek igekeznek párosítódni (ebben az elektronoktól eltérnek).

4 A protonok és neutronok saját impulzusmomentumának következméne az atommag saját impulzusmomentuma (spinje), ennek nagsága kvantált. Spinimpulzus-momentum nagsága= I(I 1) h 2 I: a mag spinkvantumszáma, függ a magban lévő protonok és neutronok számának típusától Mag Protonszám Neutronszám I Példa páros páros 0 12 C, 16 O páratlan páratlan 1 Az egik páros, a másik páratlan (2,3..) 14 N.,5 1, 13 C, 19 F, 31 P 23 Na (1,5) NMR inaktív magok NMR aktív magok 17 O (2,5)

5 A spinimpulzus momentum vektormenniség: irána és nagsága is kvantált. Eg I spinű mag I impulzusmomentumának (vektor félkövér!) eg tetszőlegesen választott (pl. a z) tengelre nézve 2I+1 számú merőleges vetülete van. Azaz, I z komponense, I z kvantált: I z m m: a mag mágneses kvantumszáma, melnek értéke lehet: -I, -I+1,, I-1, I cos 1 (I I I z m I I(I 1) 0.5) : 54.7 m I I(I 1) I=0,5 I=1 A mag mágneses momentuma, m szintén vektormenniség arános I-vel. A g aránossági ténezőt giromágneses (csavarómágneses) hánadosnak nevezzük. m = g I

6 Eges izotópok mágneses magrezonanciás tulajdonságai Izotóp I Természetes előfordulás % m magmagneton g radian/ Tesla sec NMR frekvencia [Mz] 4,7 Tesla térerőnél Kémiai eltolódás tartomán [ppm] Relatív érzékenség Egenlő számú magra Természetes izotóp-arán mellett 1 1/2 99,9844 2,7927 2, ,000 1, ,0156 0,8574 0, ,7 10 9, , B 3/2 81,17 2,6880 0, , ,165 0, C 1/2 1,108 0,7022 0, , , , N 1 99,635 0,4036-0, , , , N 1/2 0,365-0,2830-0, , , , O 5/2 0,037-1,8930-0, , ,0291 1, F 1/ ,6273 2, ,833 0, Na 3/ ,2161 0, ,095 0, Si 1/2 4,70-0,5548-0, , , , P 1/ ,1305 1, ,0663 0, Cl 3/2 75,53 0,8209 0, ,6 7, ,

7 Mágneses energiaszintek E mb0 mgb 0 Példa: I=1/2 E 1 b antiparallel 13 C b m= -1/2 E=0,5għB 0 13 C a m= +1/2 E=-0,5għB 0 1 a parallel B 0 E= għb 0 N N a b e E kt pl.: B 0 = 11,74 Tesla (500 Mz) 1 (500 Mz) N totál = N a = N b =

8 B 0 precesszió z eredő mágnesezettség z B 0 a különböző fázisú spinek egenletes eloszlása a precesszió szöge q M z M XY B 0 >>>>M z (mérhetetlen) 0 0

9 A precesszió frekvenciája: 1 2 g B0 g B0 ertz radián sec Larmor frekvencia = f (g, B 0 ) A rezonancia (a spinek parallel állapotból antiparallel állapotba jutnak): a besugárzás frekvenciája egezzen meg a Larmor frekvenciával. E = h = għb 0 Rezonancia frekvencia: 1 g 2 B 0 CW NMR (continuous wave, -t (B 0 -t) fokozatosan változtatják, pásztázzák) PFT NMR (pulse Fourier transformation, az összes átmenetet egszerre gerjesztik eg rövid pulzussal)

10 g-sugarak Az elektromágneses spektrum röntgensugarak Mössbauer ultraibola látható infravörös elektrongerjesztési rezgési F 31 P mikrohullámú C rádiófrekvenciás forgási NMR /Mz /z

11 z z B 0 B 0 B 1 M z eredő mágnesezettség rezonancia fázis-koherencia (kötegelődés) M eredő mágnesezettség

12 Az eredő mágnesezettség megváltozása B 0 B 1 Rezonancia: M z 0, M alakul ki Relaáció: M z visszaépül, M 0 B 0 >>>> B 1

13 FT FID: free induction deca szabad indukciós lecsengés szinuszoid oszcilláló FT FT B 1 Idő Frekvencia

14 korrekciós tekercs forgó légpárna

15 vákuum folékon N 2 -kamra (-70 C) vákuum folékon e-kamra (-269 C) szupravezető tekercs

16 900 Mz 3500 e USD 600 Mz 750 e USD 200 Mz 250 e USD

17 A rezonancia frekvencia függ: - a mag fajtájától - a mag kémiai körnezetétől Mágneses térerő eg adott mag körnezetében: B heli B B0 B0(1 : árnékolási ténező 0 ) 1 g 2 Bheli Kémiai eltolódás 1729,6 z 502,4 z 6,136 ppm 4324 z 1256 z 6,136 ppm megfigelt spektromét er TMS 6 10 ppm, dimenzió nélküli C 3 C 3 Si C3 C 3 O 2 C C 2 2 C O C 2 3 C C C 3 O C 3 TMS dioán tercier-butanol

18 Legfontosabb NMR jellemzők: 1) Kémiai eltolódás 2) Spin-spin csatolás (csatolási állandók, multiplicitás) 3) Intenzitás/terület 4) Relaációs idő 1) Kémiai eltolódás 1 NMR: 10 ppm 13 C NMR: 250 ppm 19 F NMR: 800 ppm 31 P NMR: 700 ppm N DO C C 2 C 3 TMS ppm Magasabb heli tér Magasabb frekvencia Kisebb árnékolás Alacsonabb elektronsűrűség

19 p A p változtatás hatása a kémiai eltolódásra savas karakterű molekulák esetén Ecetsav 1 NMR titrálása L L az 1 kémiai eltolódást meghatározó egik fő faktor a heli elektronsűrűség a savi disszociáció növeli az elektronsűrűséget a savi csoport körnezetében a szomszédos szénhez kapcsolódó protonok NMR jele alacsonabb ppm felé tolódik chemical shift (ppm) köztes p értékeknél a savi és bázikus forma kiátlagolt jele látható obs L L L L

20 Ecetsav NMR-p titrálási görbéje 2.2 obs (ppm) L pk a 4.64 L p p pk a log obs L L obs

21 2) Spin-spin csatolás: aktív magok közötti kölcsönhatás, ami jelfelhasadást okoz (multiplicitás) Csatolás: 1) direkt (D, dipoláris), téren keresztüli (szilárd fázisú NMR-ben) 2) indirekt (J, skaláris, független B 0 -tól), kötő elektronokon keresztüli csatolási állandók 3 J 2 (vicinális) J C (geminális ) A 3-kötéses csatolási állandók fontos jelzői a konformációnak Összefüggés a diéderes szög és 3 J csatolási állandók között (Karplus) q C z C 3 J (ertz) 1 J C transz q mágnesesen ekvivalens magok: azonos kémiai eltolódással és csatolási állandókkal (kémiailag ekvivalens magoknál a csatolási állandók eltérőek) multiplicitás 2 n : nem ekvivalens magok (három kötésen belül) (a csúcsok száma) n+1: ekvivalens magok (három kötésen belül)

22 Multiplicitás egenértékű szomszédokkal Az NMR csúcs: Lorentz görbe a) F C Nincs szomszédos mag: szingulet b) F C Eg szomszédos mag: dublet 1:1 c) d) B B F C F C C A A Két szomszédos mag: A a a b b B a b a b triplet árom szomszédos mag: kvartet A B C a a a a a b a b a b a a a b b b a b b b a b b b n+1 1:2:1 1:3:3:1 Intenzitások: Binomiális egütthatók (összegük 2 n ) Eg spin energiája függ a szomszédos spinek orientációjától

23 Multiplicitás nem-ekvivalens szomszédos magok esetén: ABX spinrendszer ppm 3 C O N A X S COO B N-acetilcisztein A B 3 J AX 3 J AX 3 J BX 3 J BX 3 J BX 2 J AB 2 J AB 2 J AB 2 J AB ppm Ez elsőrendű (Δ AB /J AB > 7) spektrumokra igaz, a másodrendű spektrumok bonolultabbak (háztető effektus, a csúcsok összeolvadása) B o legen nag

24 1 -NMR spektrum: N-acetilcisztein D 2 O-ban pd~ Mz 3 C O N a COO b S d-d t-but

25 h 1h 1h 3h 3h DO Terc-butanol Efedrin-hidroklorid D 2 O-ban (360 Mz) C O C N C C 3 3 A B D 2 D ) Intenzitás/terület

26 4) Relaációs idő E 2 b 90 B 0 E1 a z z z z 90 1,2 M z 1 0,8 spin-rács 0,6 0,4 0,2 Mz Ml Mzma idő M A populáció különbség visszaáll zma gerjesztés relaáció e t T 1 1,2 1 M 0,8 0,6 0,4 0,2 0 spin-spin M M ma idő t M e A fázis-koherencia megszűnik t T 2

27 A térerő hatása a spektrumra c a COO 1,88 Tesla b d OCOMe ertzben a skála ~3-szorosára növekedett, a vonalszélesség ppm-ben 1/3-ára csökkent. 5,87 Tesla c a COO b d OCOMe

28 ertz = f(b 0 ) J ertz = f(b 0 ) Me O 18 Me 19 O 1-dehidrotesztoszteron

29 Érzékenség növelés spektrum akkumulációval Jel/zaj S/N ~ ncg g B ec det 0

30 Mag Overhauser hatás (NOE - Nuclear Overhauser effect) NOE: az I spin intenzitásának megváltozása, ha az S spint telítésbe visszük. Mágneses dipólusok relaációján alapul, a molekulák rotációs mozgása révén Két térközeli mag J (kötéseken keresztüli) csatolás nélkül besugárzás telítés S telítése, I nagsága nő vag csökken a) b)

31 I I I 0 0 molekulatömeg 1000 gors bukfencezés lassú bukfencezés A molekulák átfordulási sebességét befolásolja a) őmérséklet b) Oldószer (viszkozitás) A NOe arános r -6 -nal 5 Å távolságon belül érvénesül A NOe és annak 2D változata a fő eszközök a a) 3D konformáció b) atóanag-receptor kölcsönhatás meghatározására.

32 Dinamikus NMR Kémiai csere: olan folamat, amel során az atommag cserélődik két olan körnezet között, amelben NMR paraméterei eltérőek - intramolekuláris folamatok: proton átadás (pl. keto-enol tautoméria), konformációs változások (pl. rotamerek egmásba alakulása) - intermolekuláris folamatok: kis molekulák kötődése makromolekulákhoz, protonálódási folamatok Kicserélődési sebességek az NMR kémiai eltolódás skálához viszonítva - lassú csere: k << AB ( A - B ) a két rezonancia láthatóan elkülönül k - gors csere: k >> AB A B csak eg átlagos rezonancia figelhető meg k observed = A A + B B 3 C O 3 C k N N N N 3 C k 3 C O

33 őmérsékletfüggő spektrumsorozat Kémiai csere A k k B k << AB k >> AB

34 Több-pulzusos technikák 1) Inverziós visszaépülés Pulzusszekvencia t D Felvétel 2) ahn spin echo 3) 2D NMR t D t D Felvétel

35 Inverziós visszaépülés B 0 z z t D Felvétel z /2 z t D z /2 z t D z /2 T 1 relaációs idő mérése z t D z /2

36 DO O m C 2 R Magok relaációs tulajdonságainak (T 1 ) mérése A relaációs idő az 1 és 13 C NMR spektroszkópiában másodperc tartománba esik.

37 ahn spin echo: T 2 relaációs idő mérése, spinek refókuszálása z z /2 t D z B 0 z t D z z 3 spin z z

38 2D NMR A kísérlet 3 (4) fázisa: 1) Előkészítés /2 2) Kifejlődés: 1D kísérletek sorozata t D t D +i t D +i+i t D +i+i+i tipikusan 256 i 3) Keverés (nem feltétlenül) 4) Detektálás: az utolsó /2

39 B 0 z z /2 t 1 z z t 1. /2 Felvétel M M Mtsin(2π νt1 M cos(2π ν t M t 1 t M ) ) 0 e 2π νt 1 t T 1 2 (t 2 )

40 t 1 t 1 =0 t 1 2

41 COSY Correlation Spectroscop Kontúr plot átlón kívüli off-diagonális

42 DNS-RNS oligonukleotid 500 Mz NOESY Diagonális Off-diagonális

43 Aszpirin kis-felbontású 400 Mz-es COSY spektruma c a COO 1 b d OCOMe 2

44 COSY Gl Tr Gl COSY TOCSY NOESY

45 Térbeli információ in vivo Egész test képalkotás NMR képalkotó technikák 1 31 P NMR mikroszkópia mm felbontás 2 O Mágneses Rezonancia Képalkotás Magnetic Resonance Imaging MRI Térerő B 01 B 02 B 0 gradiens ν γ B 2π 0 ω γ B0 ω 1 γ B 01 ω2 γ B02 Frekvencia

46 in vivo MRI 1, 31 P Morfológiai profil Valós idejű, non-invazív A tumor sejtekhez kötött víz relaációs ideje eltérő Kontraszt anagok: Emberi fej MRI felvétele Szerv-specifikus Gd 3+ kompleek E E rtg MRI Agtumor diagnosztizálása MRI-vel

47 A képalkotó technikákban T 1 vag T 2 relaációs időt vizsgálunk. A relaációs idő megmutatja: 1) og a víz kötött -e 2) og van e jelen valamilen fémion (főként paramágneses) Kötött víz: lassú átfordulás (bukfencezés) Paramágneses fémionok: gors víz relaáció Íg daganatokat, főként körülírt (solid ) daganatokat lehet diagnosztizálni. agtumor májtumor

48 in vivo MRS magnetic resonance spectroscop Kémiai és metabolikus profil Valós idejű Non-invazív, non-destruktív 1, 31 P, 19 F, 23 Na, 13 C kreatin-foszfát PO 4 3- Emberi felkar 40 Mz-es 31P NMR spektruma nehéz fizikai munka elött és után.

49 Kreatin-foszfát szintje galoglás előtt és után

50 in vivo MRS Emberi máj in vivo (2,1 T) 13 C MR spektruma. Etanol 1 NMR spektruma, amelben külön láthatók az O, C 2 és C 3 protonok jelei (balról jobbra.)

51 Kvantitatív NMR - qnmr Ténleges koncentráció meghatározása Relatív koncentráció meghatározása A módszer alapja: Az NMR jelek alatti terület (integrál) arános a jelet adó magok számával O C 2 C

52 A qnmr előne más analitikai módszerekkel szemben Univerzálisan alkalmazható hiszen minden szerves molekula ad NMR jelet ( 1, 13 C). Az integrál jel nagsága csak a megfigelt NMR aktív magok számától függ Az azonosításhoz más NMR paraméterek (pl. a kémiai eltolódás és a csatolási állandók) szolgáltatnak információt Egetlen NMR spektrum felvételével lehetővé válhat többkomponensű rendszerek menniségi analízise a komponensek előzetes elválasztása nélkül.

53 Kvantitatív NMR spektrum felvétel pw Aq 1 NMR 13 C lecsatolással a 13 C szatellit jelek kiküszöbölésére 13 C NMR 1 lecsatolással az 1 csatolások megszüntetése, NOe effektus kiküszöbölése 1 13 C 13 C 1 d1

54 Ténleges koncentráció meghatározása qnmr-el Ismert koncentrációjú standard anag alkalmazása szükséges Standard anagok kritériumai: nag tisztaságú olcsó stabil COO NO 2 kémiailag inert nem illékon nem higroszkópos O OOC COO NO 2 O 1,3,5-benzol-trikarbonsav 1,4-dinitrobenzol 1,4-dioán OOC C C COO C 3 3 C C C3O maleinsav tercier-butanol

55 Levodopa, karbidopa és metildopa meghatározása egmás mellett gógszerkészítménben O C N 2 O COO O metildopa C 3 N N 2 O O karbidopa COO N2 O COO levodopa Talebpour Z., aghgoob S., Shamsipur M. Anal. Chim. Acta 506 (2004)

56 Levodopa, karbidopa és metildopa meghatározása egmás mellett gógszerkészítménben OOC C C COO Talebpour Z., aghgoob S., Shamsipur M. Anal. Chim. Acta 506, , 2004.

57 NMR-t tartalmazó cikkelek a Ph.Eur. 5.1-ben Azonosítás Buserelinum ( 1 ) - a gonadotropinreleasing hormon szintetikus analógja Goserelinum ( 13 C) eparina massae molecularis minoris ( 13 C) Tobramcinum Kvantitatív meghatározás droproplbetadeum Poloamera Salmonis domestici oleum Azonosítás: összehasonlítás Ph.Eur. referencia spektrummal vag CRS spektrummal Poliszacharidok azonosítása vakcinákban Vaccinum haemophili stirpe b coniugatum Vaccinum meningococcale classis C coniugatum Vaccinum pneumococcale polsaccharidicum coniugatum adsorbatum

58 RO RO O idroipropilbetade moláris szubsztitúciójának meghatározása O RO RO O O RO O O OR RO OR OR OR O O O OR RO RO RO RO OR O O O OR O OR RO O OR b-ciklodetrin részlegesen szubsztituált poli(hidroipropil)-étere. OR R=-[C 2 -C(C 3 )-O] n - n=0, 1, 2... Moláris szubsztitúció (MS): az anhidroglükóz egségekre jutó hidroipropil-csoportok száma

59 idroipropilbetade moláris szubsztitúciójának meghatározása O O O O O O C 2 C C 3 O MS A1 3 A 2 A 1 : az 1,2 ppm-nél lévő metil csoportok dublet jeleinek területe A 2 : az 5 és 5,4 ppm közötti glikozidos protonok jeleinek területe

60 Oipropilén-oietilén arán meghatározása Poloamérekben A 1 O dublet, ~1,08 ppm csak az oipropilén egségekből, egségenként 3 proton, összesen 3 b proton C 3 O O Etilén-oid és propilén-oid O a b a szintetikus polimerje összetett jelcsoport 3,2 és 3,8 ppm között az oipropilén egségekből 3 proton, az oietilén egségekből 4 proton, összesen 3 b+4 a proton A 2 m% oietilén 100 ( A 2 ( A 2 A 4 1 A1 ) 44 4 ) A ( A 2 ( A2 A 1 A1 ) 33 ) 33 A 1 58

61 E vivo NMR Élő szervezetből nert testfoladékok és szöveti kivonatok komponenseinek közvetlen NMR spektroszkópiás vizsgálata (előzetes elválasztás nélkül) agi és gerincvelői liquor nál vér izzadtság magzatvíz vizelet ondófoladék

62 Vizeletanalízis

63 Valproinsav-mérgezés diagnózisa NMR spektroszkópiával Egészséges ember vizelete 3 C C 2 C 2 C C 3 C 2 C 2 COO Mérgezett ember vizelete C, kreatinin U, urea L, lactát G, glicin T, trimetilamin oid Ci, citrát, hippurát Al, alanin 2,3,4,5, a valproinsav protonjai 1,2,3,4,5, glukuronsav protonjai Azaroual N. et al. Magn Reson. Mater. Phs. Biol. Med. 10, , 2000