Lehetőségek és kihívások a modern bionmr spektroszkópia területén

Átírás

1 Lehetőségek és kihívások a modern bionmr spektroszkópia területén Perczel András és munkatársai Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratórium és ELTE-MTA Fehérjemodellező Kutatócsoport 1

2 The Nobel Prize in Physics 1952 "for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith Felix Bloch ( ) Edward Mills Purcell ( ) 2

3 The Nobel Prize in Chemistry 1991 "for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy" Richard R. Ernst 3

4 Fehérjék oldatban: NMR-spektroszkópia Fehérje NMR: kémiai Nobel-díj, 2002 Kurt Wüthrich A dinamikára és a belső mozgásra is reflektáló szerkezeti sokaság 4

5 NMR spektrum spinrendszerek azonosítása spinrendszerek szekvenciális rendezése kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás 5

6 Miért az NMR? Powerful modern structural tools for looking at complexes Crystallography ~ 45,000 structures Molecular modelling Electron microscopy ~190 Nuclear Magnetic Resonance ~7,500 - can also give 6 K d and k

7 Az NMR-spektroszkópia szükséges feltétele a nullától különböző magspin (I 0) 1) I= 0, ha mind a protonok mind a neutronok száma páros: ( 12 C, 16 O) 2) I= 1/2, ha tömegszáma páratlan ( 1 H, 3 H, 13 C, 15 N, 19 F, 57 Fe, 113 Cd) vagy a protonok, vagy a neutronok száma páratlan. 3) I= k (k=1,2,..) mind a protonok mind a neutronok száma páratlan ( 2 H, 14 N) B 0 Külső mágneses tér tér hatására hiányában rendeződött a magok és spinjei precesszáló rendezetlenül magok állnak 7

8 Feles spin esetén az impulzusmomentum (perdület) z-komponensének operátora: Î Z - két sajátfüggvénye: ψ +½ és ψ ½ - két sajátértéke van: +½ћ és ½ћ A megfelelő két sajátérték egyenlet: Î Z ψ +½ = +½ћ ψ +½ és Î Z ψ ½ = +½ћ ψ ½ vagy röviden Î Z ψ m = mћψ m ahol m ±½. A feles-spin Hamilton-operátorának sajátértékei: Az impulzusmomentum z-komponense (Î Z ) és a B 0 indukciójú mágneses tér (B 0 z) kölcsönhatását egyetlen spin esetében leíró H-operátor: Ĥ egy-spin = γb 0 Î z ( ahol γ = giromágneses együttható) a ψ +½ és ψ ½ függvények a Ĥ egy-spin nek is sajátfüggvényei (hiszen Î Z től csak a γb 0 konstansban tér el. ). Az egyik (m= +½) sajátérték egyenlet tehát : Ĥ one-spin ψ +½ = γb 0 [Î Z ψ +½ ] = γb 0 [+½ћ ψ +½ ] = ½ ћ γb 0 ψ +½ Tehát Ĥ egy-spin egyik sajátfüggvénye a ψ +½, melyhez tartozó sajátérték a ½ ћ γb 0, míg a másik sajátfüggvénye a ψ ½, melyhez tartozó sajátérték a +½ ћ γb 0. 8

9 Az egy-spin spektruma: Spin ½ esetén tehát 2 energiaszint van: E m = m ћγb 0 Tehát E +½ = ½ ћγb 0 (E α vagy spin up), illetve E ½ = +½ ћγb 0. (E β vagy spin down) ahol m ±½. A kiválasztási szabály értelmében (mivel m = +1 vagy -1) a Δm α β = ( ½) (+½) = 1, tehát az az α-ból β-ba való átmenet megengedett. υ 0 = γb 0 /2π E b E α υ 0 ΔE α β =E β E α = +½ ћγb 0 ( ½ ћγb 0 ) = ћγb 0 hυ α β = (h/2π)γb 0 υ α β = υ 0 = γb 0 /2π ami a Larmor-frekvencia E b E α B0 Pl. Ha B 0 = 9,4T és γ= 2, rad s -1 T -1 (protonra) akkor a Larmorfrekvencia = 4, Hz ~ 400MHz 9

10 Két csatolt spin spektruma: Ha az egy-spin: Ĥ egy-spin = υ 0 Î z, akkor két csatolatlan spin esetében: Ĥ két-spin, csatolatlan = υ 0,1 Î 1z + υ 0,2 Î 2z = υ I Î z + υ S Ŝ z, illetve két csatolt spin esetében: Ĥ két-spin, csatolat = υ I Î z + υ S Ŝ z + J 12 Î z Ŝ z, ahol J 12 a skaláris csatolási állandó spin1 és spin2 között. Két-spin rendszer energiadiagramja, a megengedett átmenetek és a spektrum: b b 4 Sm =-1 Sm =0 24 a b b a átmenet spin állapotok frekvencia 12 aa αβ υ S ½J βα ββ υ S +½J αα βα υ I ½J αβ ββ υ I +½J 12 Sm =+1 a a J J υ I υ S 10

11 Külső B 0 indukciójú mágneses térben a makroszkopikus mágnesezettség (M) gerjesztése, annak precessziójához vezet, amely mérhető indukált feszültséget (mv) eredményez. 11

12 A Vektor modell és a Bloch-egyenletek z-irányú mágnesezettség időbeni alakulása: dm z' /dt= (M z' M o )/T 1 M z' (t)=m o (1 exp( t/t 1 ) az x,y-síkban zajló csillapított amplitúdójú precesszió alakulása: dm x' /dt= ( o )M y' M x' /T 2 dm y' /dt= ( o )M x' M y' /T 2 Csatolt differenciál-egyenletrendszer megoldásaként a következőt kapjuk: M x' (t)=m o exp( t/t 2 )sin( o ) M y' (t)=m o exp( t/t 2 )cos( o ), ahol ( o ) a forgó referencia rendszerben a precesszió szögsebessége. A nagy felbontású NMR-spektrumok öt jellemző paramétere: csatolási állandó (J érték) félértékszélesség multiplicitás terület kémiai eltolódás =[( M - R )/ R ]

13 13

14 spinrendszerek azonosítása 1 H-spektrum I I z és S z S -I y és -S y és I x sin( I t 2 ) S x sin( S t 2 ) Ω I Ω S F1(ppm) 14 A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk

15 spinrendszerek azonosítása Egy ~17 kda globuláris fehérje 1 H-spektruma H 2 O/D 2 O 9/1, T=300K, c 1mM amid aromás H a alifás metil ( p p m )

16 1. spinrendszerek azonosítása 2. spinrendszerek szekvenciális rendezése 3. kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás 16

17 spinrendszerek azonosítása Homonukleáris eljárás (homonukleáris 3 J, M<8kDa) ( 1 H- 1 H COSY, 1 H- 1 H RELAY, 1 H- 1 H TOCSY ) Heteronukleáris eljárás (heteronukleáris 1 J, 2 J, 3 J) 15 N-szerkesztés (M <15kDa) ( 1 H- 15 N TOCSY-HSQC, 1 H- 15 N NOESY-HSQC ) 15 N, 13 C-szerkesztés (M <20kDa) (HNCA, HNCOCA,.) 15 N, 13 C-szerkesztés ( 2 H) (M <30kDa) 17

18 spinrendszerek azonosítása Peptidekben és a fehérjékben az aminosavak hidrogénatomjai elkülönülő spinrendszereket alkotnak 13 J Ala Ser Glu Gly Phe Cys 18

19 A Vektor modell és a Bloch-egyenletek helyett a szorzatoperátor-elmélet Alapfogalmak: magspin-operátor vagy impulzusnyomaték-operátor: Î Î = Î x, Î y, Î z az időtől függő spinsűrűség-operátor az időtől függő Hamilton-operátor az időtől függő, normalizált állapotfüggvény (t) Ĥ(t) (t) Az alapegyenlet: d (t)/dt = i 1 [Ĥ(t), (t)] Liouville- von Neumann-egyenlet Mi kerül a Hamilton-operátorba? Az I és S spinek (AX spinrendszer) esetén, oldatfázisban: Zeeman-effektust + a skaláris csatolást + a rádiófrekvenciás gerjesztést leíró három tag. Ĥ = 1 Î x 2 Ŝ x + JÎ z Ŝ z I Î z S Ŝ z 19

20 Cél a mérhető makroszkopikus mágnesezettség-vektor (M) nagyságának és moduláltságának meghatározása: A megfigyelhető makroszkopikus mágnesezettség pl. M y összetevője a következő: M y (t) = N Tr[SI ky (t)] k ahol és mellett, N az egységnyi térfogatban vett spinek darabszáma. A feladat: A magspin operátor (I) valamint a spinsűrűség-operátor { (t)} szorzatának valamilyen bázison vett mátrixreprezentációjának a spurját (Tr) kell meghatároznunk! A nagy kérdés: mi legyen az alkalmas bázis? Mi legyen az s elemből álló báziskészletet (B s )? (t) =S b s (t)b s s A megoldás: a B s báziskészlet legyen a spin impulzusmomentum-operátor. Sorensen korábbi javaslata értelmében a Descartes-típusú I kl bázisoperátorok használata az alábbiak szerint felettébb eredményes: B s = n ( q- 2 1 ) k = 1 ( I ) kl a sk 20

21 Az I és S spinek (AX spinrendszer) 16 bázisoperátort táblázatos alakban: E S x S y S z B s elemeihez milyen fizikai kép rendelhető? mágnesezettség (populáció, NOE) E E S x S y S z I x I x 2I x S x 2I x S y 2I x S z I y I y 2I y S x 2I y S y 2I y S z I z I z 2I z S x 2I z S y 2I z S z szin-fázisú egyszeres kvantumkoherenciáik. S spinen lokalizálható ellentétesfázisú koherenciák I spinhez tartozó ellentétesfázisú koherenciák 21

22 Tipikus transzformációk a 16 bázisoperátor által kifeszített koherencia-térben: (t=0) = hb 0 ( I I y + S S z )/(8 kt) H = I I z + S S z J IS I z S z (t=0) S z [ s t] I y (t=0) (t) (t) I z [ I t] + I y cos( I t) - I x sin( I t) 2I z S z (J IS t) + I y cos( I t)cos(j IS t) - 2I x S z cos( I t) sin(j IS t) - I x sin( I t) cos(j IS t) - 2I y S z sin( I t) sin(j IS t) I y I y 22

23 + I y cos( I t)cos(j IS t): cos(a)cos(b) = 1/2[cos(A+B)+cos(A B)] következően a spektrum alakja: +1/2I y [ +cos{( I + J IS )t} + cos{( I - J IS )t} ] I y [ +a, +a] I kémiai eltolódásértéknél memo: az spektrum a Bloch-egyenlet alapján: S(t) = C*exp( t/t 2 )cos( I t). I 1 H-spektrum I z és S z S -I y és -S y és I x sin( I t 2 ) S x sin( S t 2 ) Ω I Ω S F1(ppm) A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk 23

24 spinrendszerek azonosítása 1 H- 1 H COSY (homonukleáris korrelációs spektrum) I 2I z S y sin( I t 1 ) S S I y S x sin( I t 1 )cos( S t 2 ) I 2I y S z sin( I t 1 ) I S 24

25 spinrendszerek azonosítása 1 H- 1 H COSY NH H 2 H α H 1 H b H b H 1 H 2 H α F 1 (ppm) S NH I I S F 2 (ppm) 25 A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk

26 spinrendszerek azonosítása Fehérje modul 1 H- 1 H COSY spektruma 26

27 spinrendszerek azonosítása 1 H- 1 H TOCSY protonok teljes korrelációját létrehozó spektrum I NH H 1 H 2 H α S 1 S 2 H b 3S H 4 1 H3S 2 3 I y K H α H b F 1 (ppm) ΣS kx b od sin( I t 1 )cos( S t 2 ) k=1 diagonális jelek diagonálison kívüli jelek NH b od = diagonálison F 2 (ppm) kívüli intenzitások 27 A spektrumban a J IS okozta modulációtól eltekintünk

28 spinrendszerek azonosítása Fehérje modul 1 H- 1 H TOCSY spektruma 28

29 Heteronukleáris egyszeres-kvantum koherencia spektrum HSQC = Heteronuclear Single-Quantum Coherence 1,1 J~90Hz H z -2H z N y +2H z N y cos( N t 1 ) H x cos( N t 1 ) N H x cos( N t 1 )cos( H t 2 ) H 29

30 A kalmodulin 1 H- 15 N HSQC spektruma A kalmodulin 1 H spektrumának amid NH és aromás tartománya J 90 Hz ( p p m )

31 spinrendszerek azonosítása 15 N-szerkesztéssel 3D-TOCSY-HSQC 2I z b od cos( K t 1 ) 2I z cos( I t 1 ) I x b od cos( K t 1 )cos(ω N t 2 ) I x b od sin(ω I t 3 ) cos(ω N t 2 ) cos( K t 1 ) -I y N K I H 2I z N y b od cos( K t 1 ) 2I z N y b od cos( K t 1 )cos(ω N t 2 ) N NH 31 b od = off diagonális intenzitás A J IK okozta modulációtól eltekintünk

32 spinrendszerek azonosítása 15 N-szerkesztett TOCSY spektrum 1 H- 1 H TOCSY amid NH (ujjlenyomat) tartománya Homonukleáris 2D TOCSY 32

33 spinrendszerek azonosítása 15 N-szerkesztett 2D TOCSY 1 H 1 H 1 H- 15 N 3D TOCSY-HSQC csíkok 1 H- 1 H TOCSYamid NH 15 N (ujjlenyomat) tartománya EVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAACTLKACPQ 33

34 (AMX) Ser (AX) Gly 1. spinrendszerek azonosítása (A 3 X) Ala (A 2 M 2 X) Glu 2. spinrendszerek szekvenciális rendezése 3. kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás 34

35 A szekvenciális hozzárendelés és a szerkezetszámolás alapja a nukláris Overhauser- effektus (NOE) 6Å (NOE) Távolság jellegű adatok 35

36 spinrendszerek azonosítása Fehérje modul 1 H- 1 H NOESY spektruma 36

37 spinrendszerek szekvenciális rendezése A spinrendszerek szekvenciális rendezését biztosító H a i-1-h NH i NOE-k Ala Ser Glu Gly Phe Cys 37

38 spinrendszerek szekvenciális rendezése Ala Glu Ser A szekvenciális hozzárendelés Phe Gly Cys Ala Ser Glu Gly Phe Cys 38

39 (AMX) Ser (AX) Gly 1. spinrendszerek azonosítása (A 3 X) Ala (A 2 M 2 X) Glu 2. spinrendszerek szekvenciális rendezése - Ala Ser Glu - Gly - 3. kényszerfeltételek alapján szerkezetszámolás 39

40 szerkezetszámolás Egy fehérje modul 1 H- 1 H NOESY spektruma 40

41 Fehérjék NMR-szerkezetvizsgálata Kurt Wüthrich (ETH, Zürich) OmpX bakteriális membránfehérje térszerkezete Mozgékony szekvenciarésszel rendelkező prion fehérje 41

42 Biomolekulák dinamikai vizsgálata GCN4 élesztő transzkripciós faktor gerinc-dinamikájának vizsgálata Arthur G. Palmer III (Columbia University) 42

43 Fehérje feltekeredés vizsgálatok (ns és ms időskálán) Alan Fersht (Cambridge University) 43

44 Our most recent targets: dutpase Beáta Vértessy Calpastatin Péter Tompa MASP-2 Péter Gál CCP Péter Gál APPase László Polgár Peptides and miniproteins Gábor Tóth Homeodomains Botond Penke P DLC László Nyitray Calmodulin Ovádi Judit 44 Inhibitors László Gráf

45 A kulcs & zár modell (Emil Fischer) Hogyan tervezzünk gyógyszert? Minél többet meg kell tudnunk a 45 fehérjék dinamikus téralkatáról!

46 A kalmodulin reorientációja célfehérje vagy antagonista hatására a molekula összecsuklik, - az N- és C-terminális közel kerül egymáshoz, - ám a D és az E α-hélixeket összekötő részről az alacsony elektronsűrűség miatt nincs krisztallográfiai információ együttműködésben Ovádi Judittal és munkatársaival (MTA SZBK Enzimológiai Intézet) 46

47 Vinca alkaloidok (biszindol) mint CaM antagonisták Catharantus (Vinca) roseus alkaloidjai (vinblasztin, vinkrisztin) VBL - sejtosztódásgátló hatás (kemoterápia) - célpontjuk a sejt mikrotubuláris hálózata - jelentős mellékhatások (neurotoxicitás) Vinblasztin KAR - In vivo kísérletekben ugyanolyan hatékonynak bizonyult, mint a természetes vinca alkaloidok - Mellékhatása jóval kisebb KAR-2 Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, 947 Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, Orosz és mts. British J.Cancer 1999, 79, 1356

48 A kalmodulin 1 H- 15 N HSQC spektruma A kalmodulin 1 H spektrumának amid NH és aromás tartománya J 90 Hz ( p p m )

49 A kalmodulin KAR2 vel való titrálása során kapott 1 H- 15 N HSQC spektrumok összevetése l5 N l H 49

50 Felület, nmr színezés alapján (két szín) ( KAR2 yes) Ligandkötés azonosítása 50

51 Az ERD-14 egy szerkezetnélküli fehérje: lombiktól az élő sejtig ΔG Tompa 51 Péter Szalainé Ágoston Bianka

52 Dehidrin = abiotikus stressz (abszcizinsav) hatására fejeződik ki a növényben: vízhiány, magas sótartalom (NaCl), hideg ERD14 = Early Response to Dehydration aminosav, 20 kda rendezetlen fehérje sok poláris, töltött aminosav kevés hidrofób aminosav 52

53 TROSY-HSQC spektrum 15 N J 90 Hz 1 H 800 MHz 10 mm MES ph K 53

54 hetnoe Az ERD14-nek nincs oldatban térszerkezete (valójában túl sok is van neki) Relaxációs mérések: merev flexibilis 5 régió, amely 5-25 % helikális hajlammal rendelkezik 54

55 Vizes oldat vagy puffer sejt Ez különösen igaz rendezetlen fehérjékre: A fehérjezsúfoltság / crowding a sejten belül sokat számíthat! Élő sejtben kell mérni! E.coli az NMR csőben 55

56 NMR élő E.coli-ban in cell NMR E.coli ERD14 kifejeztetés Sűrű sejtszuszpenzió az NMR csőben 500 MHz sejtekben 277 K Pufferben Élő sejtekben Sejtek felülúszója üres spektrumot ad 56

57 Kontroll az in cell NMR-hez Dextrán: Sejten belüli állapotot (fehérjesűrűséget és viszkozitást) utánoz Itt nem tűnnek el a jelek Puffer Puffer + 150g/L dextrán => Puffer Amit látunk, + 300g/L tényleges kötődés, dextrán kölcsönhatás! 57

58 Szerkezet sejtben = Rendezetlen Eltűnő Elmozduló Helyükön maradó csúcsok 5 régió, amely valamihez kötődik a sejtben 58

59 A molekuláris mozgás időskálái hurkok és kanyarok záródása 0.1ms 10ms másodlagos szerkezeti elemek 10ns 1ms feltekeredés 1ms 1h H/D R ex Rot. Dif. korrel. idő 1ns<t c < 10ns gerinc dinamika 1ps 10ns t lokális aggregáció 1 s 1 év Kiss Róbert t effektiv = t C +t lok. oldallánc forgás 0.1ps 1059 ps

60 A mozgás időskálái ~ 1s ~ 100 ezer 1h ~ 30 millió 1év 60

61 A fehérjék belső dinamikája NMR ps 10-9 ns 10-6 ms 10-3 ms 10 0 s 10 2 ~min sec feltekeredés kötések mozgásai domének, nagyobb szerkezeti egységek mozgásai Shifman J M et al. PNAS 2006;103:

62 A fehérjék belső dinamikája NMR ps 10-9 ns 10-6 ms 10-3 ms 10 0 s 10 2 ~min sec R 1, R 2, NOE R 1 r CPMG Line-shape analízis ZZ- csere 62

63 Fehérjék mozgása; ms-ms időskála Belső dinamikája lefedi a különböző partnerfehérjékkel alkotott komplexeiben észlelt konformációs variációkat. R 1, R 2, NOE R 1 r NMR /RDC X-ray különböző partnerfehérjékkel ms-ms időskálájú mozgások alapján számolt S 2 Ubiquitin; a halál csókja Lange és mts., Science, 2008, 320,

64 Fehérjék mozgása; ns-ps időskála R 1, R 2, NOE R 1 r NMR /NOE + S 2 MUMO szerkezeti sokaság Gáspári Zoltán X-ray a komplexről főkomponens-elemzés Az inhibitor belső dinamikájával számolt térszerkezetek lefedik az enzimmel alkotott komplexben (3 eltérő komplex) mért röntgen konformereket. 64 Gráf László

65 Fehérjék szerkezete: mit rejt a kristály? Fehérje röntgenkrisztallográfia: kémiai Nobel-díj, 1962 Max Perutz, John Kendrew kristályban az egyes atomok helye térben jól meghatározott részletgazdag szerkezet 65

66 spinrendszerek azonosítása 2H z N x C α(i-1) z cos(ω N t 1 ) és 2H z N x C α(i) 3D-NHCA z cos(ω N t 1 ) 2H z N y cos(ω N t 1 ) H z H x cos(ω N t 1 ) cos(ω Cα(i) t 2 ) cos(ω H t 3 ) és H x cos(ω N t 1 ) cos(ωc α(i-1) t 2 ) cos(ω H t 3 ) 2H z N y Cα(i) C a(i- 1) H N C a(i) 2H y N x C y α(i-1) cos(ω N t 1 ) és 2H y N x C y α(i) cos(ω N t 1 ) 2H y N x C α(i-1) y cos(ω N t 1 ) cos(ω Cα(i) t 2 ) és 2H y N x C α(i) y cos(ω N t 1 ) cos(ωc α(i-1) t 2 ) NH Cα(i-1 N 66 A skaláris csatolás okozta modulációktól eltekintünk