Immunológia II GY 1. Bevezetés 2018. febr. 16. Bajtay Zsuzsa
Tankönyv: Immunológiai módszerek szerkesztette: Erdei Anna (Medicina, 2006) Laboratóriumi gyakorlatok MSc MIM: - halim1mb17lm Haladó immunológiai gyakorlatok I. GY - himmgymb17lm Haladó immunológiai gyakorlatok II. GY Letölthető tananyag: http:/immunológia.elte.hu
Immunológia II. - tematika 1. 2018. 02. 16. Kísérleti állatok tartása, kezelése, immunizálása. Az immunizálás menete. Adjuvánsok alkalmazása. Állatmodellek. Sejtvonalak alkalmazása. 2. 2018. 02. 23. Ellenanyagok szerkezete és módosítása enzimatikus hasítással. Ellenanyag reagensek előállítása I. Monoklonális ellenanyagok jellemzése és előállítása. Molekuláris biológiai módszerekkel módosított ellenanyagok. 3. 2018. 03. 02. Ellenanyag reagensek előállítása I. Poliklonális ellenanyagok jellemzése és előállítása. Immunelektroforézis. Ellenyag tisztítási módszerek; kisózás, ioncserélő kromatográfia, gélszűrés, affinitás kromatográfia. 4. 2018. 03. 09. Antigén ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek I. A kapcsolódás kimutatásán alapuló jelöléses módszerek; ELISA, Western blot, immunprecipitáció. 5. 2018. 03. 16. Munkaszüneti nap 6. 2018. 03. 23. Antigén ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek II. A kapcsolódást követő másodlagos reakciókon alapuló módszerek; precipitáció, agglutináció, komplement mediált lízis. A komplementrendszer vizsgálata. 7. 2018. 03. 30. Munkaszüneti nap 8. 2018. 04. 06. Sejtanalitikai módszerek; FACS, FM, CLSM. Membránfehérjék kölcsönhatásainak vizsgálata. 9. 2018. 04. 13. Sterilitás, in vitro sejttenyésztés. Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata I. Monociták, makrofágok, dendritikus sejtek 10. 2018. 04. 20. Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata II. B limfociták. 11. 2018. 04. 27. Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata III. T limfociták. 12. 2018. 05. 04. Beszámoló ZH 13. 2018. 05. 11. Pázmány nap 14. 2018. 05. 18. Javító ZH
Bev. 1. ábra Immunhomeosztázis
3.25. ábra Elsődleges és másodlagos nyirokszervek
3.3. ábra Hemopoézis
Bev. 2. ábra Az immunválasz kialakulása
10.1. Az immunglobulin-szupercsalád
2.1. ábra Az antigének felépítése 2.2. ábra Az ellenanyag által felismert struktúrák
Kísérleti állatok tartása, kezelése, immunizálása. Az immunizálás menete. Adjuvánsok alkalmazása. Állatmodellek. Sejtvonalak alkalmazása.
Kísérleti állatok tartása és kezelése - Az állatkísérletek indoklása Állatvédelmi törvény XXVIII. tv (1998) / munkavédelmi előírások / etikai szempontok -Emberi-, állati sejtek használata kutatási pályázathoz: Egészségügyi Tudományos Tanács, Tudományos és Tudományos Kutatásetikai Bizottság engedélyével
Kísérleti állatok tartása alom táplálék / ivóvíz állatorvosi kontrol eredet / karantén a tartás körülményei / az állatház besorolása (konvencionális, spf, steril (mikroizolátor) a tenyésztés feltételei (egér- és patkánytörzsek / speciális genetikai háttér állatszám / ketrec állatfaj helyigény hőmérséklet / o C páratartalom / % alapterület / cm 2 magasság / cm egér 50 70 12 18-26 40-70 patkány 150 300 18 18-26 40-70 hörcsög 80 100 15 18-26 40-70 nyúl 0,3 0,4 (m 2 ) 35 16-21 40-60
2.3. ábra Az antigén (hordozó és haptén komplexe) többféle specificitású ellenanyag képződését indukálja Kísérletes körülmények hordozó pl. albumin, haptén pl. FITC számos B-sejt klón aktiválódik, eltérő specificitású ellenanyagok keletkeznek poliklonális immunválasz
Oltóanyagok, vakcinák az antigén mellett adjuvánst tartalmaznak Adjuvánsok (adjuvare:segíteni) Az immunogenitást fokozzák depo képzés, gyulladás keltés, PRR aktiváció (veleszületett immunitás jelentősége) Az antigén beadásának módja és helye befolyásolja az immunizálás hatékonyságát: - táplálékkal, szájon át (per os p.o.) - intravénásan (i.v.) - bőrbe (intradermális i.d.) - bőr alá (szubkutan s.c.) - izomba (intramuszkuláris - i.m.) - peritoneumba (intraperitoneális i.p.)
1.3. táblázat Laboratóriumi kisállatok immunizálási módjai egér patkány hörcsög tengerimalac nyúl a beadás módja i.m. helye hátsó-comb v. hátizom hátsó-comb v. hátizom hátsó-comb v. hátizom hátsó-comb v. hátizom hátsó-comb v. hátizom mennyisége 0,05 0,3 0,1 0,3 0,5-1,0 /ml i.v. helye farokvéna farokvéna nyakivéna nyakivéna fülvéna mennyisége 0,1-0,2 0,5 0,3 0,5 1,0-5,0 /ml i.p. helye hasüreg hasüreg hasüreg hasüreg hasüreg mennyisége 0,5-2,5 5,0-10,0 2,0-4,0 5,0-10,0 5,0-20,0 /ml f.p. helye hátsótalppárnák hátsótalppárnák hátsótalppárnák hátsótalppárnák hátsótalppárnák mennyisége 0,05 0,05 0,05 0,05 0,1 /ml i.d. helye háton háton háton háton háton mennyisége 0,05 0,05 0,05 0,05 0,1 /ml s.c. helye háton háton háton háton háton mennyisége /ml 0,5-2,5 5,0-10,0 3,0-4,0 5,0-10,0 5,0-10,0 p.o. helye szájba - - - - mennyisége /ml 0,05-0,2 - - - - i.n. helye orrüreg - - - - mennyisége 0,05 - - - - /ml c.s. helye talp, fűl, - - - - has bőre mennyisége 0,05-0,2 - - - -
1.1. ábra Az egér nyirokszervei
Immunkompetens sejtek izolálása Primer sejtek - csontvelő, tímusz - lép, nyirokcsomó, hasüreg - vér Vér - vérplazma - alakos elemek - eritrociták, trombociták - leukociták - granulociták - neutrofil, bazofil, eozinofil - limfociták (T, B) - monociták
limfocita monocita granulocita Sejtek izolálása egérből - Szervek dezintegrálása - Elkülönítés pl. sűrűség-grádiens centrifugálással - vvs mentesítés: hemolízissel (ACK oldat :NH 4 CL, KHCO 3 ) - a sejtek festése, számolása: tripán kék életképesség Elpusztult sejt élő sejtek kristályibolya - magfestés
Sejt koncentráció beállítás A BÜRKER kamra 0.1 mm Sejtek száma 25 db négyzetben * hígítás * 10 4 = sejt/ml
1.4. táblázat Szérumminták vétele kisállatokból a vérminta vételének helye a vérminta mennyisége (ml) egér szemzug vénás plexus, farokvéna vagy szívpunkció 0,3 patkány szemzug vénás plexus, farokvéna vagy szívpunkció 2,5 hörcsög szemzug vénás plexus vagy szívpunkció 0,5 tengerimalac szívpunkció 2,0 nyúl fülvéna vagy szívpunkció 50
Állatmodellek - Immunhiányos egerek név genetikai háttér defektus beige C57BL/6 NK-sejt hiány Motheaten C57BL/6J B2-sejt hiány Nude outbred tímusz hiány scid CB.17 T-és B-sejt hiány xid CBA/N a humorális immunválasz zavara - KO (knock out ) / génkiütött állat - Tg / transzgenikus állat
Autoimmun törzsek és modellek név NOD (Non-obese diabetic) betegség modell IDDM (insulin dependent diabetes mellitus) lpr (lymphoproliferative) - Fas gld (generalized lymphadenopathy) - FasL NZB (New Zeland Black) SLE (systemic lupus erythematosus) SLE (systemic lupus erythematosus) BXSB (C57BL/10, satin beige) EAE (experimental autoimmun encephalitis) CIA (collagen induced arthritis) SLE (systemic lupus erythematosus) indukált indukált
Mennyi sejt várható egy egérből? CBA, BALB/C T B DBA/2 T B B6, B10 T B Frissen szeparált sejtek Lép 50-100 x 10 6 1-5 x 10 6 2-3 napig in vitro aktivált/antigén specifikus (poliklonális x5-10) Lép B 20-50 x 10 6 1 x 10 6 Lép T 10-20 x 10 6 1 x 10 6 Nyirokcsomó 20-50 x 10 6 0,5 2 x 10 6 Nyirokcsomó B 1-5 x 10 6 0,3 0,5 x 10 6 Nyirokcsomó T 2-5 x 10 6 0,1-1 x 10 6 Peritóneum 1-2 x 10 6 Timusz 20-50 x 10 6 Csontvelő 5-20 x 10 6
Néhány egértörzs genetikai jellemzői egértörzs szőrszín H-2 haplotípus Igh-C haplotípus CD90 / Thy-1 CD5 / Ly-1 CD8 / Ly-2 CD45 / Ly-5 CD44 / Ly-24 alaptörzsek AKR/J albino k d 1 2 1 2 2 lo BALB/c albino d a 2 2 2 2 1 hi CBA/J agouti k j 2 1 2 2 1 hi C57BL/10 fekete b b 2 2 2 2 2 lo C3H/HeJ agouti k j 2 1 1 2 2 lo DBA/2 világos barna d c 2 1 1 2 1 hi SJL albino s b 2 2 2 1 2 lo kongenikus törzsek BALB.B albino b a 2 2 2 BALB.K albino k a 2 2 2 B10.BR fekete k b 2 2 2 B10.D2 fekete d b 2 2 2 C3H.SW agouti b j 2 1 1 B10.A fekete a b rekombináns törzsek B10.A (1R) fekete h1 b B10.A (2R) fekete h2 b
Sejtfunkciók vizsgálata sejtek B-limfocita T-limfocita Monocita, makrofág Neutrofil granulocita Dendritikus sejt funkciók proliferáció ellenanyag termelés citokin termelés proliferáció citokin termelés citotoxicitás fagocitózis citokin termelés kemotaxis Antigénbemutatás citokin termelés fagocitózis
Ember és állat sejt modell rendszerek 1. Primer sejttenyészet közvetlenül élőlényből származó korlátozott ideig használható 2. Sejtvonal tumoros transzformáció eredménye (in vitro v. in vivo) Korlátlan ideig fenntartható 3. Klón egyetlen sejt eredetű, azonos geno- és fenotípus in vitro létrehozható, aktivációt (pl. növekedési faktor) igényel a fenntartása 4. Hibridóma immortalizált sejtvonallal történő in vitro hibridizáció eredménye, gén bevitel