Kappelmayer János Malignus hematológiai megbetegedések molekuláris háttere MOLSZE IX. Nagygyűlése Bük, 2005 szeptember 29-30.
Laboratóriumi vizsgálatok hematológiai malignómákban Általános laboratóriumi vizsgálatok A hematológiai betegség fenotípusának jellemzése: minőségi vérkép (periféria, csontvelő - MGG festés) hematológiai automaták adatai? citokémiai reakciók immunfenotipizálás A hematológiai malignoma genotípusának jellemzése: citogenetika/fish (kromoszóma rendellenességek) Ig/TcR génátrendeződések vizsgálata mol. biol. módszerekkel transzlokációk kimutatása mol. biol. módszerekkel MRD kimutatása ploiditás vizsgálat
A B
Citokémiai reakció molekuláris diagnosztika? MPO PAS
LUC (large unstained cell) analízis FVS: 204 G/L FVS: 1.2 G/L LUC: 56% LUC: 22%
Antigén kimutatás Fluorokróm 494 nm 517 nm anticd61 Ab CD61
PMN érés markerei Monocyta érés markerei
Chronic Lymphocytic Leukemia Leukemic cells: pos for CD5 and CD19 CD19 CD5
AL 4 color analízis EWGCCA AL task force 2x4 felszíni marker 2x4 felszíni+ic marker
Fenotípus PSGL-1 kópiaszám 60000 Receptor kópiaszám 50000 40000 30000 20000 10000 0 PMN MO AML-blast Monoblast
Fenotípus Diploid peak Hyperdiploid peak DNS tartalom
Multi Drug Rezisztencia (MDR) vizsgálata
Genetikai vizsgálatok jelentősége haematológiai malignómákban Klonalitás igazolása (poliklonális és/vagy monoklonális sejtpopulációk jelenlétének igazolása) Diagnózis felállítása - tumor specifikus genetikai eltérések kimutatása (Philadelphia kromoszóma - CGL) Minimális reziduális betegség (MRD) kimutatása, monitorozás (terápiát követően a malignus sejtek reziduális klónjának jelenléte, mely standard patológiai és radiológiai módszerekkel nem mutatható ki) Prognózis becslése (specifikus gén mutáció jelenléte egy adott tumorban rossz vagy jó prognózissal jár együtt) Terápiára való reagálás megítélése (egyes génmutációk jelenléte bizonyos kezelésekkel szembeni rezisztenciára utal)
A leggyakoribb kromoszóma transzlokációk haematológiai megbetegedésekben Transzlokáció B-ALL T-ALL AML gyerek felnőtt gyerek felnőtt gyerek felnőtt t(1;19)(q23;p13) 5-8% 3-4% --- --- --- --- t(4;11)(q21;q23) 3-5% 3-4% --- --- <1% <1% t(9;22)(q34;q11) 3-5% 15-30% <1% <1% <1% <1% t(9;22)(q34;q11) 1-2% 10-15% <1% <1% <1% <1% t(12;21)(p13;q22) 25-30% <2% --- --- --- --- del(1)(p32;p32) --- --- 10-25% 10% --- --- t(8;21)(q22;q22) --- --- --- --- 10-14% 6-8% t(15;17)(q22;q21) --- --- --- --- 8-10% 5-15% inv(16)(p13;q22) --- --- --- --- 5-7% 5-6%
Genetikai elváltozások prognosztikai jelentősége t(1;19) - pre-b-all, rossz prognózis (magas fvs szám és LDH, CNS érintettség) t(4;11) -felnőtt ALL esetében rossz prognózis t(8;22) - AML-M2, jó prognózis, jó válasz citozin arabinozidra t(9;22) -felnőtt ALL esetében rossz prognózis (komplett remisszió aránya alacsonyabb, betegségmentes túlélés ideje csökken) t(12;21) - gyerekkori ALL, jó prognózis (sokkal később jelentkező relapszus) inv(16) - AML-M4(Eo), jó prognózis t(17;19) - prob-all, rossz prognózis (gyakran társul DIC-kel)
A bcr/abl átrendeződés kromoszómális mechanizmusa
A bcr/abl expresszió változása Gleevec terápia során Ratio BCR-ABL/G6PDH % (n = 65) 100 10 1 0.1 0.01 negative p < 0.0001 Complete response n = 14 Partial response n = 18 Minor response n = 10 Nonresponse n = 23 Cytogenetics
Crossing Point (ciklusszám) Minták Standard görbe: G6PDH A kvantitálás elve t (9;22) G6PDH n n n log (kópiaszám) log (F2/F1) log (F2/F1)
Saját standard görbe 2130 fg 213,0 fg 2,13 fg 21,3 fg 213 fg 2130 fg
A bcr/abl expresszió változása Gleevec terápia során
Freuhauf S. et al. J. Leuk Biol. 2003, 73: 600-603 Imatinib restores expression of CD62L in BCR-ABL positives cells
FLT3 ITD/LM a duplikált szekvencia a 14. exont érinti ritkán 14. intront és 15. exont is (korábban 11., 12. exon) is érinti (JM domént és TK1 domént kódoló régió)
FLT3 D835/TKD mutáció leggyakoribbak a pontmutációk a 835 kodonban (834, 836 kodon is érintett lehet) inszerció és deléció is előfordulhat
FLT3 ITD Prognosztikai jelentőség egységes álláspont: FLT3 ITD+ nagyobb a relapszus esélye gyakoribb terápia rezisztencia rövidebb DFS (disease free survival), EFS (event free survival) és OS (overall survival) mutáns/vad típusú allél aránya fontos vad típusú allél elvesztése különösen rossz prognózist jelez
FLT3 mutációk kimutatása hagyományos PCR reakciót használtunk, 11F és 12R primerekkel a vad típusú allél jelenlétére 329 bp nagyságú PCR termék utal nagyobb PCR termék ITD jelenlétére utal a vad típusú allél el is veszhet vad és a mutáns allél/ok intenzitásbeli különbségei is fontosak jobb a csontvelői minta vizsgálata
FLT3 ITD+ esetek MW 50 bp K 1 2 3 4 5 víz ITD 329 bp
Vizsgált betegek Beteg Dg. FLT3% kóros sejtek% ITD D835 1. my+ ALL 51 75 - - 2. AML M4 (MDS) 65 40 - - 3. AML M2 34 35 - - 4. AML M0 15 25 5. AML v. CGL 46 33 + - 6. AML M1 36 95 + + 7. AML M0 61 78 - - 8. AML M4 67 90 + - 9. AML M4 39 20 - + 10. my+ call 46 65 - -
Közreműködők Dr. Antal Szalmás Péter Dr. Hevessy Zsuzsa Dr. Koczok Katalin Kissné Sziráki Valéria Győrffiné Veszprémi Anikó