A modern endokrin diagnosztika alapjai és perspektívái Kovács L. GáborG Pécsi Tudományegyetem ÁOK Laboratóriumi riumi Medicina Intézete és ETK Diagnosztikai és s Menedzsment Intézete
Az elmúlt 50 év endokrin Nobel díjasai 1958: F Sanger 1966: CB Huggins 1971: EW Sutherland 1977: RS Yalow, RL Guillemin, AV Schally 1984: GJF Köhler 1992: EH Fisher, EG Krebs 1994: AG Gilman, M Rodbell 1998: RF Furchgott 2003: P Agre R MacKinnon Az inzulin szerkezete Prosztata rák hormonkezelése Hormonhatás mechanizmusa RIA, releasing hormonok Monoclonalis antitestek Proteinkinázok G proteinek NO vízcsatornák
Hypothalamus: GHRH, CRH, TRH, GnRH Szomatosztatin ADH Hypophysis: GH Prolactin ACTH, MSH TSH FSH & LH Oxytocin ADH Hormontermelés: klasszikus mirigyek Tobozmirigy: Melatonin Pajzsmirigy: T3, T4 Calcitonin Mellékpajzsmirigy Parathyroid h. Pancreas: Insulin Glucagon Petefészek: Ösztrogének Progeszteron Mellékvesekéreg: Cortisol Aldoszteron Androgének Mellékvese velı: Catecholaminok
Kevésbé hagyományos hormonok Endothelium: Endothelin NO Prosztanoidok,... Immunrendszer: Citokinek Thrombocyta: Növekedési faktorok Placenta: Mindenfajta hormon Adipocyta: Leptin Cardiocyta: ANP Vese: Erythropoietin RAS GIT: Gastrin Cholecystokinin Secretin,... Gonadok: Inhibin Activin
AZ ELİADÁS VÁZLATA 1. HORMON- RECEPTOROK 2. SZABAD HORMON KONCEPCIÓ 3. NEUROPEPTIDEK 4. POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSULÁSOK 5. FOETALIS mrns AZ ANYAI VÉRBEN 6. A VIZSGÁLÓ- ELJÁRÁSOK FEJLİDÉSE
1. Szemléleti áttörés: a hormon-receptorok felfedezése Szerkezet és funkció közötti kölcsönhatás megértése. Receptorokra ható gyógyszerek felfedezése. Emlı cc. stratifikáció Graves betegség diagnosisa Prostata cc. Carcinoid (somatostatin)
GENOMIKUS NEM GENOMIKUS RECEPTOROK
Újfajta hormon-receptorok Diabetes incretin hormonok: a postpradialis insulinszekréció szabályozói glucagon-like peptid (GLP1) glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) GLP1 és DPP-4 receptorok. Kamrai hypertrophia cardiotrophin-1 (CT-1; az IL-6 család tagja) IL-6 receptor (IL-6R) Kisspeptin (metastin, KISS1): melanoma metastasis suppressor gén GPR54 receptor neuroendokrin kontroll, pubertás
2. Szemléleti áttörés: A szabad hormon koncepció Az intracelluláris (hatékony) hormonkoncentráció a szabad szinttel arányos, nem pedig a kötöttel. Az albuminhoz kötött tesztoszteron fél életideje 1 mp, az SHBG-hez kötve 20 mp. A szöveti mikrocirkuláció képes elısegíteni a szabad hormon felszabadulást a kötésbıl ( bioavailable hormone ).
Transzport proteinek Peptid hormonokat szállító fehérjék: CRH-BP, IGFBP-1-6, albumin (calcitonin, PTH, ACTH) Szteroid hormonokat szállító fehérjék: CBG, SHBG, D-vitamin-BG Pajzsmirigy hormonokat szállító fehérjék: TBG, albumin, transthyretin (prealbumin)
Rheuma faktor (Rf) Humán IgG Fc fragmense ellen képzıdnek (IgM) Elıfordulásuk: 1. normál populációban (idısebb kor): 5-10 %, 2. autoimmun betegekben gyakrabban 3. rheumatoid arthritis: elsı év: 40-60 %; késıbb: 80 % Úgy viselkednek, mint a heterophil antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötıdnek.
Állati fehérje ellenes humán antitestek (HAAAs) 1. Izotípus: IgG, IgM, IgA, IgE. 2. Állati fehérjével történı expozíció igazolható, és az állatfaj azonos a tesztben alkalmazott állati immunglobulinnal (antimouse: HAMA, anti-rat: HARA, etc..) 3. Szérumkoncentráció: g/l is lehet! 4. Évekig a keringésben maradnak. 5. Elıfordulásuk: 80 % is lehet.
Szabad hormon koncentráció: teljesen független a kötıfehérjéktıl? A Bias of ft4 (MEIA) 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% -10% 15 20 25 30 35 40 45 50 55-20% Albumin (g/l) C Bias of ft3 (MEIA) 175% 125% 75% 25% -25% 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Albumin (g/l) Toldy, Lıcsei, Szabolcs, Bezzegh, Kovács: Clinica Chimica Acta, 2005
IGF-1 és a kötıfehérjék: BP1-6 BP 1-2 IGF-1 α-subunit α-subunit IGF-1 BP 4-6 IGF-1 + + BP3 IGF-1 BP3 IGF-1 β-subunit β-subunit IGF-1 Az összes keringı IGF-1 1 mennyiségének: nek: < 5% szabad - szövetspecifikus enzimek, - ph viszonyok - farmakonok A szövetenként eltérı lehet a hatásmód és hatáserısség!
Az interakciót okozó antitestek kiszőrése Blokkoló ágens használata borjú v. murin immunglobulin, nem specifikus egér antitest (MAK33): interferencia elimináló fehérjék biotinizált egyszárú antitest használata A minta elıkezelése: PEG, alkohol, ammónium szulfát, protein A kromatográfia, ultrafiltráció, gél diffúziós kromatográfia detergens, hıkezelése, hígítása Visszanyerés mérése Az antitest közvetlen mérése, pl. TgAb
Analitikai probléma ma: a rutinban alkalmazott immunoassay módszerek jelentıs eltérése Roche Elecsys Abbott Imx ABBOTT AxSYM J & J Amerlite Bayer Immuno-1 Wallac DELFIA DPC Immulite Roche Enzymun J & J Vitros ECI Roche Cobas Core Bayer (Chiron Centaur) Beckman Access Fahie-Wilson, 2000. Monomer PRL szint: 270 mu/l + 93 % macroprolactin PRL mu/l 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Saját t tapasztalatunk 214 macroprolactinaemiás eset közül 37 beteg (~17%) fölöslegesen részesült bromocriptin terápiában
A klinikus korlátlan bizalma és a laboratórium hallatlan felelıssége Total β-hcg mérés 58 technikailag hibás fölémérés heterophil antitest jelenléte miatt, amit a referencia laboratórium utólag tisztázott (Cole, 2004): Curettage (85 %) Curettage + MTX kezelés (70 %) Laparoscopia (45 %) Hysterectomia (11 %) Bilateralis salpingo-oophorectomia (6 %)
3. Szemléleti áttörés: A neuropeptidek felfedezése Neurovascularis kapcsolat a hypothalamus és a hypophysis között (Harris, Szentágothai, Halász, Flerkó) Az idegrendszer részt vesz a gonadotropin szekrécióban (Sawyer) Releasing hormok (Guillemin és Schally) Idegrendszerre gyakorolt neuropeptid hatások (De Wied, Lissák, Endrıczi, Telegdy)
Lissák Kálmán Telegdy Gyula Bohus BélaB
AZ ENDOKRIN MUNKACSOPORT NAGY GENERÁCIÓJA
David De Wied
A NEURO-ENDOKRIN-IMMUN Biológiai ritmusok SZABÁLYOZÁS ZAVARAI Alvás és immunrendszer Vasopressin az agyban Gyulladásos mediátorok és a hormonelválasztás T-helper sejtek és a glucocorticoid érzékenység
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK HATÁSAI A MAGASABB IDEGTEVÉKENYSÉGRE 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 6 5 4 3 2 1 0 CONTROL AVP OXT CONTROL AVP OXT Schulz, Kovács és Telegdy, 1974 Kovács, Telegdy és Lissák, 1976 Kovács, Vécsei és Telegdy, 1978 Kovács és Telegdy, 1987
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN A HATÁS AGYI HELYEI INTERAKCIÓI Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979 Kovács és Versteeg, 1993 Kovács és De Wied, 1994
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN A HATÁS AGYI HELYEI INTERAKCIÓI Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979 Kovács és Versteeg, 1993 Kovács és De Wied, 1994
NEUROHYPOPHYSIS HORMONOK: TANULÁS, NORADRENALIN A HATÁS AGYI HELYEI INTERAKCIÓI Kovács, Bohus, Versteeg, De Kloet, De Wied, 1979 Kovács és Versteeg, 1993 Kovács és De Wied, 1994
HUMAN FAMILIALIS DIABETES INSIPIDUS: MUTÁCIÓ A PROHORMON GÉNEN T G MUTÁCIÓ (20. KROMOSZÓMA; 2110. NUKLEOTID; 116. CODON), C G CSERE NP85, AUTOSOMALIS DOMINÁNS ÖRÖKLÉSMENET, ENDOPLASMATIKUS RETICULUM, LASSÚ, KÉSLELTETETT NEURODEGENERÁCIÓ. (Bruins, Kovács et al. 2006)
Az agy-vér gát átjárhatóvá tehetı KLASSZIKUS RECEPTOROK: V1a, (V1b), OXT (Vaccari és mtsai, 1998) [pglu4,cyt6]avp-(4-8) [pglu4,cyt6]avp-(4-9) SAJÁT RECEPTOR KLÓNOZVA (Xiong és mtsai, 1999; Nakayama és mtsai, 2000) Arg-His-Pro-[pGlu4,Cyt6]AVP-(4-9) (Tanabe és mtsai, 1999) abszorpció-mediált endocitosis
A neuropeptidek felfedezésének gyakorlati jelentısége Az endokrin integráció elveinek megismerése. Endokrin betegségek patomechanizmusának megértése (pl. perifériás mirigyek tercier zavarai). Új terápia, pl. LHRH analógok daganatokban. Új funkcionális tesztek. Az idegrendszer mőködésének módosítása.
4. SZEMLÉLETI ÁTTÖRÉS: POSZT- TRANSZLÁCIÓS MODIFIKÁCIÓK FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK HOZZÁADÁSA EGYÉB FEHÉRJÉK HOZZÁADÁSA AMINÓSAVAK KÉMIAI SZERKEZTÉNEK MÓDOSÍTÁSA SZERKEZETI VÁLTOZÁSOK
4. SZEMLÉLETI ÁTTÖRÉS SZIALIZÁCIÓ POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSULÁSOK: A BIOLÓGIAI FÉL-ÉLETIDİ SZABÁLYOZÁSA TERHESSÉG FOKOZOTT SZIALIZÁCIÓ LASSABB TBG CLEARENCE EMELKEDETT TBG
5. Szemléleti áttörés Foetalis mrns, DNS az anyai vérben kivon RNS, DNS Magzati nem meghatározása Calbindin-D9k mrna Növekedési hormon; insulin-szerő növekedési faktor-1 Veleszületett betegségek diagnosztikája
6. A VIZSGÁLÓELJÁRÁSOK FEJLİDÉSE Specifikusabb A cél: klinikai Szenzitívebb Szélesebb méréstartomány Rövid analízis idı Automatizálható Környezetkímélı A cél: analitikai
1890 1940 1960 1980 2000 TITRIMETRIA FOTOMETRIA NEPHELOMETRIA KROMATOGRÁFIA FLUORIMETRIA ATOMABSZORBCIÓ RIA EIA FIA BIOLUMINESCENCIA LIA PCR mmol/l umol/l nmol/l pmol/l fmol/l
A modern immunoassay specificitása Néhány ng/l mennyiségő anyagot felismer olyan környezetben, ahol az anyagkoncentráció 10 11 ng/l. Az arány pontosan olyan, mintha egyetlen embert kellene azonosítani a világ teljes népességében.
Biomarkerek Albumin C8 komplement C1q komplement komplement faktor B H-faktor C4 komplement C9 komplement Cöruloplazmin Prealbumin Lipoprotein Haptoglobin 10% Össz IgA Össz IgM 10% 1% BIOMARKEREK α-1-antitripszin Fibrinogén α-2-makroglobulin Transzferrin C3 komplement Össz IgG Apolipoprotein B α-1 savas Glycoprotein Apolipoprotein A-1
Az analitikai forradalom: tömegspektrometria Kis molekulák jövıbeli vizsgáló módszere. A kereszt-reakciók kiküszöbölve. Gyors, nem igényel minta elıkezelést, nincs reagens költség. A berendezés drága, különleges felkészültséget igényel.
A point-of-care (POCT) és a point-of-surgery (POST) hormonmérés Sürgıs: Terhességi próba LH: ovulatio ellenırzés β-hcg Cortisol Intraoperativ: PTH Cortisol Insulin ACTH Gastrin
Molekuláris endokrin diagnosztika Multiple endokrin neoplasia Congenitalis adrenalis hyperplasia Tg mrna: differenciált sejtes pajzsmirigyrák Kallikrein mrna: számos daganat Oestrogen receptor polimorfizmus ENDOKRIN MICROARRAY (BIOCHIP) Kezdetleges Drága
Személyre szabott és designer hormonkezelés egészséges emberben? Korábban: a hormonkezelés a hormonhiány pótlására szolgált. Személyre szabott (genotípus-specifikus) kezelés: Glucagon-like peptid-1 (II. típusú diabetes) Ghrelin (anorexia) Szövetspecifikus hormonok Kozmetikai endokrinológia. Gének modifikációja? Öregedés: www letöltés 2008: 2.2 millió GH, 1.2 millió DEA az öregedés ellen
A HORMONDIAGNOSZTIKA JÖVİJE Az endokrin kézikönyveket át kell írni: Peptid és szteroid hormonok hatásmechanizmusa közötti különbségek eltőnıben Kötıfehérjék új szerepben Új endokrin szervek, hormonok: Kisspeptin (pubertás), Thyrostimulin (pm. aktivátor) Egy gén több hormon: POMC Új molekuláris módszerek: Szelektív knock-out egyes agyterületek peptid receptoraiban Az adaptáció funkcionális genomikája Transcriptomika Proteomika Metabolomika Glikomika Lipidomika Farmakogenomika Fiziomika
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEMI KONZORCIUM A HUMORÁLIS ADAPTÁCIÓ ZAVARAINAK JELENTİSÉGE KLINIKAI KÓRKÉPEKBEN A reproduktív rendszer szabályozási zavarai. Immuno-neuroendocrin adaptáció vizsgálata kritikus állapotban lévı betegekben. Összefüggés vizsgálata a metabolikus szindróma biokémiai és a viscerális zsírsejtek élettani jellemzıi között. A könny összetételének változása endokrin ophthalmopathiában. PTE ÁOK Anatómiai Intézet PTE ÁOK Gyermekgyógyászati Klinika PTE ÁOK I.sz. Belgyógyászati Klinika PTE ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet PTE ÁOK Szemészeti Klinika PTE ÁOK Szülészeti és Nıgyógyászati Klinika PTE ETK Ápolás és Betegellátás Intézete PTE ETK Diagnosztikai és Menedzsment Intézet