Ph.D. értekezés tézisei A Chlamydia pneumoniae okozta légúti infekció, az allergia és néhány genetikai tényezo szerepe a gyermekkori asthma bronchiale patomechanizmusában Dr Nagy Adrienne Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu 19. sz. program Programvezeto: Dr Falus András Témavezeto: Dr Szalai Csaba Budapest, 2003.
1. BEVEZETÉS Az allergia és az asthma bronchiale prevalenciájának nagyfokú növekedése ma már hazai népegészségügyi, sot világméretu probléma. A szakambulanciák nagy betegforgalma sokszor az egy-egy betegre jutó idot csökkenti, így bizonyos differenciáldiagnosztikai lépések elmaradnak. Ilyen elkülönítendo, az asthmára hasonlító kórképek közé tartozik, a tünetszegénysége miatt sokszor nem, vagy félre diagnosztizált Chlamydia pneumoniae fertozés (CPI) is. A CPI az esetek egy részében bronchiális hyperreaktivitással jár, ebben hasonlít az asthmára. Kezelésük azonban eltéro. Klinikai munkám során feltunoen sok Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) okozta bronchialis hyperreaktivitással találkoztam az asthma bronchiale gyanúval beutalt gyermekek között. A betegek egy része célzott antibiotikus terápiára meggyógyult, másoknál életük elso CPI-ja indította el az asthmájukat. A megfelelo antibiotikus terápia klinikailag és szerológiailag is meggyógyította a fertozést, de a gyermek attól kezdve asthmás lett. A légúti kórokozók asthma exacerbációját kiváltó hatása közismert, azonban az asthma inicializálásában betöltött szerepükrol keveset tudunk. Az asthma bronchiale multifaktoriális kórkép, amelyben genetikai és környezeti tényezok és azok kölcsönhatásai játszanak szerepet. 2. CÉLKITUZÉSEK Kutatásom célja az volt, hogy választ találjak az alábbi kérdésekre: 1. Az immunrendszer egyes tagjainak (kemokin rendszer, komplement rendszer) genetikai polimorfizmusa, mutációja milyen szerepet játszik az asthma bronchiale kialakulásában? 2. Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza az asthma kialakulásának esélyét? 3. Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza a CPI kialakulásának esélyét? 4. Gyakoribb-e a CPI az asthmás gyermekek között, mint azoknál, akik nem asthmások? 5. Fogékonyabbak-e az asthmás gyermekek a CPI-ra, mint egészséges társaik? 6. A CPI szerepelhet-e trigger faktorként az asthma bronchiale kialakulásában, az arra genetikailag hajlamos gyermekeknél? 7. Van-e kapcsolat az allergia és a CPI között? 2
8. Több rizikótényezo (allergia, genetikai eltérések, CPI) együttes hatása fokozza -e az asthma kialakulásának esélyét? 9. Milyen patogenetikai kapcsolat van a CPI és az asthma bronchiale között? 3. VIZSGÁLATOK Öt keresztmetszeti vizsgálatot végeztünk. Ezek típusai: infektológiai, allergológiai, genetikai és kombinált vizsgálatok voltak. 3.1 Elso vizsgálat CCR5?32 MUTÁCIÓ VIZSGÁLAT 3.1.1 Bevezetés, célkituzés Az allergiás gyulladásban a CC-kemokinek fontos szerepet töltenek be az immunrendszer effektor sejtjeinek toborzásában és aktiválásában. A regulated on activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) nevu CC- kemokin egyik receptora a CCR5 kemokin receptor. Ennek a receptornak a génjében eloforduló 32 bázispár deléciójával járó CCR5?32 mutáció elégtelen mennyiségu és minoségu CCR5 expressziót von maga után. Ennek következtében a rosszul muködo receptor ligandjai sem tudják hatásukat kifejteni. A nemzetközi szakirodalom ennek a mutációnak asthma bronchiale-ra való védo hatásáról eltéro eredményekkel számol be. Vizsgálatunk célja az volt, hogy nagy beteganyagon vizsgáljuk ennek a mutációnak asthma bronchiale kialakulására való esetleges védo hatását. 3.1.2 Betegek, módszerek 3.1.2.1 Betegek Száztizennyolc asthmás (3-18 é, á:10,1é, SD:3,5), 145 allergiás (nem asthmás) 1-18 é, á:5,4 é, SD:3,8) és 303 illesztett kontroll vett részt a vizsgálatban. Helyi etikai bizottságok jóváhagyták a vizsgálatokat, amelyek a betegek és szüleik felvilágosítása, önkéntes beleegyezése és aláírása után történtek. 3.1.2.2 In vivo tesztek Az asthma és allergia klinikai diagnózisát az anamnézis és tünetek mellett Prick borpróba, allergén-specifikus IgE meghatározás valamint alap és bronchodilatatio-s légzésfunkciós vizsgálatok segítségével állítottuk fel. A Prick borpróbát adekvát negatív és pozitív kontrollok esetén 3mm-nél nagyobb reakció esetén tartottuk pozitívnak. 3
A kislégúti obstrukciót a FEV1 (forced expiratory volume in one second = eroltetett kilégzési térfogat a kilégzés elso másodpercében) és a PEF (peak exspiratory flow = csúcsáramlás) kívánt paramétere inek 80% alatti értékei esetén igazoltuk. A kislégúti obstrukció reverzibilitását bronchodilatatio hatására a FEV1 >15 %, és a PEF >15% -os javulásával mértük. A z asthma 4 lépcsos stádiumbeosztásánál a Global Initiative for Asthma (GINA) eloírásait tartottuk be (1. Intermittáló, 2. Enyhe perzisztáló, 3. Mérsékelt perzisztáló, 4. Súlyos perzisztáló). Gondozottjaink között azonban nagy számban voltak szezonális asthma bronchiale-ben szenvedok, emiatt az elso és második lépcso közé egy másfeledik lépcsot is iktattunk, hiszen ezek a betegek az év egyik felében az elso, másik felében a második lépcsobe tartoztak (1,5. Szezonális enyhe perzisztáló). 3.1.2.3 Genotipizálás A genotipizálás polimeráz láncreakcióval (PCR) történt. A használt primer pár: F: 5 CTT CAT TAC ACC TGC AGC TCT CA -3 ; R: 5 -CAC AGC CCT GTG CCT CTT CTT CTC-3, amelyek a deléció két oldalán helyezkedtek el. 3.1.2.4 Statisztikai módszerek A statisztikai elemzéshez allélfrekvencia számolási képletet és Chi-négyzet próbát használtunk. Ebben és minden további vizsgálatnál 95% -os confidencia intervallumal számoltunk és a p értéket 0,05 alatt tartottuk szignifikánsnak. 3.1.3 Eredmények Az asthmások, az allergiások és a kontrollok allélfrekvenciái (11,4%, 11,0%, 11,2%) nem mutattak szignifikáns eltérést. Az allergiás és nemallergiás alcsoportok (10,3%, 14,5%) allélfrekvenciáiban sem találtunk szignifikáns eltérést. Az asthma bronchiale stádiumainak összevetése sem mutatta, hogy a CCR5?32 mutációnak hatása lenne az asthma bronchiale súlyosságára. 3.1.4 Megbeszélés Nagy beteganyagon megállapítottuk, hogy? a CCR5?32 mutáció nem hajlamosít asthmára. Nincs összefüggésben az asthma bronchiale allergiás típusával és súlyosságával sem. A RANTES és receptorának jelentosége az asthma patomechanizmusában valószínuleg csak adjuváns jellegu. 4
3.2 Második vizsgálat MCP-1-2518A/G POLIMORFIZMUS ÉS AZ ASTHMA BRONCHIALE ÖSSZEFÜGGÉSE 3.2.1 Bevezetés, célkituzés A monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), egy olyan CC-kemokin, amelyet olyan sejtek szekretálnak, és olyan sejtek kötnek meg (CCR2+), amelyek fontos szerepet töltenek be az asthma patogenezisében. Az MCP-1 a CCR2-t expresszáló sejtekre kemotaktikus és aktiváló hatású. Az asthma és az MCP-1 összefüggését több irodalmi adat is alátámasztja. Az MCP-1 gén disztális regulációs régiójában a -2518 pozícióban normál esetben adenin (A) található. Az adenin (A) bázisnak guaninra (G) való cseréje esetén több MCP-1 szintetizálódik, G/ G homozigóta forma esetén még több. Az MCP-1 allergiás gyulladásban játszott szerepe és az MCP-1-2518A/G polimorfizmus MCP-1 expressziójára gyakorolt hatása alapján vizsgálni kívántuk asthmás és allergiás betegek genotípusát erre az egy nukleotidot érinto polimorfizmusra (single nucleotid polimorphism (SNP)). Két kérdésre kerestünk válasz: 1. Összefügg-e ez a polimorfizmus az asthmával vagy az allergiával? 2. Van-e befolyása ennek az allélnak az asthma súlyosságára? 3.2.1 Betegek és módszerek 3.2.1.1 Beteganyag A vizsgálatban 511 gyermek vett részt; 3-18 éves korú 160 asthmás átlagéletkora 10,1 év (SD: 3,5), 151 allergiás, de nem asthmás 1-18 évesek, átlag 5,6 év (SD: 3,8), és 303 illesztett korú kontroll. A betegek kiválasztási elvei és a diagnózisuk felá llításához használt módszerek megegyeznek a CCR5 fejezetben leírtakkal. 3.2.1.2 Módszerek 3.2.1.2 1 Genotipizálás PCR-restrikciós fragmenthossz polimorfizmus (PCR-RFLP ) módszerrel genotipizáltunk. Az amplifikáláshoz használt primerek: MCP417S: 5 -TCT CTC ACG CCA GC ACT GAC C-3 és MCP650AS: 5 -GAG TGT TCA CAT AGC CTT CTG-3. A polimorfizmus kimutatásához PvuII restrikciós enzimet használtunk. 3.2.1.2.2 Laboratóriumi vizsgálatok A fehérvérsejszám és eosinophil sejszám meghatározás Coulter MAXM Analizátorral történt. Az IgE vizsgálatok a Heim Pál kórházban Pharmacia 5
CAP System-mel és a Budai Gyermekkórházban EIA Total IgE BIOCHEM IMMUNOSYSTEMS kittel történtek. 3.2.1.2.3 Statisztikai módszerek Az allélfrekvenciát allélszámolás képletével számoltuk ki. Az adatokat a MedCalc és az Arlequin programmal elemeztük. Az allél eloszlást Hardy- Weinberg equilibrium teszttel vizsgáltuk. ANOVA tesztet használtunk a polimorfizmusnak a különbözo mennyiségi paraméterekre gyakorolt hatásának elemzésére. 3.2.2 Eredmények 1. Szignifikánsan több G allél fordult elo az asthmásokban, mint az allergiás, de nem asthmás csoportban: p < 0,001; OR:2,0 (1,4-2,9). Ugyanígy szignifikánsan több G allél fordult elo az asthmásokban a kontrollokhoz képest is : p < 0,001; OR: OR: 2,0 (1,4-2,6). 2. Annak kiderítésésre, hogy a G allél hetero-vagy homozigóta jelenléte szemponjából van-e különbség az asthmára való hajlamban, eloször a heterozigóta asthmásokat (46,3%) hasonlítottuk a heterozigóta kontrollokhoz (29,7%), itt szignifikánsan több G allél volt az asthmásokban: p: <0,001, OR: 2,4 (1,6-3,6). Majd a homozigóta asthmásokat (11,2%) hasonlítottuk a homozigóta kontrollokhoz (6,3%). Itt is szignifikánsan több volt a G/G genotípus az asthmásokban, mint a kontrollokban: p < 0,001, OR: 2,7 (1,4-5,5). A két összehasonlítás hasonló OR értéke azt mutatja, hogy nincs lényeges különbség az asthmára való relatív hajlamban a heteroés homozigóták között. Vagyis az MCP-1-2518 G polimorfizmus domináns jellegu hatással bír az asthma kialakulására. 3. Az adott polimorfizmus asthmában játszott szerepének tisztázására bizonyos klinikai és laboratóriumi jellemzoket vetettünk össze genotípusok szerint. A G allél szignifikánsan magasabb frekvenciáját tapasztaltuk az allergiás asthmások között összevetve a csak allergiás, de nem asthmás betegek G allélfrekvenciáival: p < 0,001; OR:2,1 (1,4-3,0). 4. Annak megítélésére, hogy miképpen hat az MCP-1-2518 G az asthmára, az egyik legfontosabb effektor sejtnek, az eosinophil sejteknek a vérben mérheto abszolút és relatív mennyiségét vizsgáltuk. A legmagasabb sejtszámot a G/G homozigóta mutánsokban mértük, a legalacsonyabbat a normál A/A típusban. Az A/G heterozigótákban a két érték közötti mértéket találtunk, amely a G allélnak nem a korábban leírt domináns, hanem csak additív hatását jelzi az eosinophil sejtek vérben való megjelenésére. 6
5. Arra a kérdésre, hogy az MCP-1-2518 G genotípus befolyásolja-e az asthma súlyosságát, a CCR5 fejezetben leírt módon és indoklással az asthmásokat 5 csoportra osztottuk és súlyossági fokok szerint vizsgáltuk a fenti genotípus elofordulását hetero-és homozigóta formákban. A G allél elofordulása a súlyosság mértékével párhuzamosan növekedett. A különbségek az 1-es és 2-es (p < 0,05); az 1-es és 3-as (p < 0,0001); 1,5-ös és 3-as (p: 0,01); és a 2-es és 3-as (p: 0,002) súlyossági csoportok között voltak szignifikánsak. Az MCP-1-2518 G polimorfizmus asthma súlyosságára vonatkozó hatásának becslésére összevetettük az 1-es és 3-as fokozatú asthmásokat, azok genotípusai szerint. A G/G homozigóták (10/18) 55,6%-ban voltak mérsékelt perzisztáló (3-as) asthmások, de csak (1/18) 5,6%-uknak volt enyhe intermittáló (1-es) asthmája. A különbség szignifikáns; p: 0,003. A normál A/A homozigóták között jóval több (21/68) 30,9% volt az enyhe intermittáló (1-es), mint a súlyosabb, 3-as, mérsékelt perzisztáló fokozat (6/68) 8,8%. A különbség szignifikáns; p: 0,002. Az A/G heterozigóták esetében nem volt szignifikáns különbség az 1-es (10/74; 13,5%) és a 3-as (16/74; 21,6%) súlyossági fokok között. 6. Végül az eosinophil sejtszámokat hasonlítottuk össze az asthma súlyossága szerint. Az eosinophil sejtszám az asthma súlyosságával párhuzamosan emelkedik. Szignifikáns különbséget mértünk az 1-es intermittáló és a 3-as mérsékelt perzisztáló asthmás csoport között (p: 0,003). Annak eldöntésésre, hogy az eosinophil sejtszám az asthma súlyosságával függ-e össze vagy az asthmások genotípusával, az eosinophil sejtszámokat és genotípusokat is összehasonlítottuk a súlyossági lépcsokön belül. Minden súlyossági csoportban az átlagos eosinophil sejtszám alacsonyabb volt A/A, mint G/G genotípus esetén. Az átlagos eosinophil sejtszám a súlyossággal is emelkedett a genotípus csoportokon belül. 3.2.3 Megbeszélés Eredményeink szerint az MCP-1-2518 G allél mind a vér eosinophil szintjére, mind az asthma súlyosságára hatással van. Összefoglalva,? az MCP-1-2518 G hajlamosít asthmára. A G/G homozigóta mutáns forma esetén magasabb a vérben az eosinophil sejtszám és súlyosabb az asthma. A G allél hiánya jótékony hatású az asthma tüneteire.? Az MCP-1-2518A/G polimorfizmus jó prediktora lehet az asthmának. Az MCP-1-CCR2 tengely jó terápiás célpont lehet az asthma terápiájában. 7
3.3 Harmadik vizsgálat SZÉRUM MCP-1 VIZSGÁLAT 3.3.1 Bevezetés, célkituzés Irodalmi adatok alapján az MCP-1 expressziót az elozo vizsgálatban leírt MCP-1-2518A/G SNP, az asthma bronchiale és a Chlamydia pneumoniae fertozés (CPI) képes növelni. Ennek a 3 tényezonek a szérum MCP-1 szintre gyakorolt hatását vizsgáltam. 3.3.2 Betegek és módszerek 3.3.2.1 Betegek A vizsgálatban 64 asthma bronchialés (3,35-19,52 éves, átl: 11,19 év SD: 3,74), 19 vegyes allergiás, de nem asthmás (5,3-17,78 éves, átl.: 12,49 év SD: 4,04), 25 kontroll (4,13-22,54 éves, átl.: 11,22 év, SD: 5,56) gyermek, fiatal vett részt. A 64 asthmás gyermekbol 52-nek volt allergiás asthmája és 12-nek nemallergiás asthmája. A betegek gondozási helyei és diagnózisuk módszerei megegyeznek az elozo fejezetekben leírtakkal. 3.3.2.2 Módszerek 3.3.2.2.1 Genotipizálás Az MCP-1-2518A/G genotipizálás leírása az elozo fejezetben található. 3.3.2.2.2 Laboratóriumi módszerek 3.3.2.2.2.1 Chlamydia pneumoniae fertozés kimutatása Chlamydia pneumoniae-species specifikus IgA, G, M antitest meghatározást ELISA (Savyon Diagnostic Ltd) módszerrel végeztük. A pozitivitást a cut-off index > 1,1 alapján számítottuk. Az értékelés a specifikus antitestek pozitivitásának kombinációja alapján történt. IgM, IgG és IgA negatívak: nem utal fertozésre. IgM pozitív, IgG negatív és IgA negatív vagy pozitív: zajló, friss, primer fertozésre utal. IgM negatív, IgG pozitív és IgA negatív: régi, lezajlott fertozésre utal. IgM negatív, IgG erosen pozitív és IgA negatív: zajló reinfekció jele. IgM negatív, IgG negatív vagy pozitív és IgA pozitív: zajló perzisztáló, krónikus fertozésre utal. Reinfekció esetén specifikus IgM ritkán mérheto, az IgA és IgG megjelenése gyors, és az IgG igen magas lehet. 8
3.3.2.2.2.2 A szérum MCP-1 szint meghatározás ELISA (Quantakine Human MCP-1 Immunoassay R&D Systems) módszerrel történt. 3.3.2.2.3 Statisztikai módszerek Nem-paraméteres Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis teszteket használtuk. 3.3.3 Eredmények 1. Az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus nem függ össze szignifikánsan a szérum MCP-1 szinttel. 2. A szérum MCP-1 szintek betegségenkénti összehasonlításaiban az asthmásokban szignifikánsan alacsonyabb volt az MCP-1 szint, mint a kontrollokban vagy a vegyes allergiás, de nem asthmásokban (p < 0,001). 3. C. pneumoniae fertozésrol tudjuk, hogy lokálisan fokozott MCP-1 expressziót okoz. Vizsgáltuk, hogy szisztémásan is emelkedik-e az MCP-1 szint. Megállapíthatjuk, hogy az akut vagy krónikus CPI nem befolyásolja a szérum MCP-1 szintet. 3.3.4 Megbeszélés Három olyan tényezot vizsgáltunk, amelyek az irodalmi adatok szerint növelik az MCP-1 expressziót. Ezek 1. MCP-1-2518 A/G polimorfizmus 2. Az asthma bronchiale 3. C. pneumoniae. 1. Az MCP-1-2518 A/G polimorfizmus típusok nem függenek össze szignifikánsan a szérum MCP-1 szinttel. 2. A z MCP-1-2518 G allél, amelyet az elozo fejezetben szignifikánsan gyakrabban találtunk az asthmások között és összefüggött az asthma súlyosságával is, az irodalmi adatok szerint fokozott MCP-1 expresszióval jár. Ennek alapján is az asthmások között (foleg a G allélt hordozók között) magasabb szérum MCP-1 szintre számítottunk. A kapott eredmény a várttal ellentétes, az asthmások között szignifikánsan alacsonyabbak a szérum MCP-1 szintek. Az asthmások szérumában mért alacsonyabb MCP-1 szint nem zárja ki, hogy lokálisan, a tüdoben több MCP-1 van jelen, mint nem asthmásoknál A másik ok, amely magyarázhatja az alacsony MCP-1 szintet a vérben, talán az is lehet, hogy az asthmások nagy része inhalatív corticosteroid kezelésben részesül. Bár ezek a korszeru készítmények nem, vagy csak kismértékben jutnak be a szisztémás keringésbe, hatásuk elegendo lehet az MCP-1 expresszió gátlására. 3. C. pneumoniae fertozésrol is ismert, hogy lokálisan fokozott MCP-1 expressziót okoz. Eredményeink szerint, szisztémásan nem emelkedik az 9
MCP-1 szint akut vagy krónikus CPI hatására. Ez itt is részben lokális hatással magyarázható. Másrészt az MCP-1 expresszió a gyulladás kialakulásának elso fázisában jelenik meg (15. napon mért csúcs) és betegeink vérvétele nem ilyen szempont szerint történt. Összefoglalva:? az MCP-1 szint nem volt összefüggésben az MCP-1-2518 A/G polimorfizmussal, sem az akut vagy krónikus CPI-val,? de szignifikánsan alacsonyabb volt az asthma bronchiale-s betegekben. 3.4 Negyedik vizsgálat CHLAMYDIA PNEUM ONIAE FERTOZÉS (CPI) ÉS AZ ALLERGIA KAPCSOLATA 3.4.1 Bevezetés, célkituzés A C. pneumoniae különleges életciklusú obligát intracelluláris pathogen. Az elmúlt években tanulmányok százai jelentek meg e kórokozó és különbözo szervek, szervrendszerek krónikus betegségei közötti kapcsolatokról. Klinikailag a legtöbb légúti CPI enyhe, akár tünetmentes lefolyású, éppen ezért diagnózis a nehézkes, sokszor el is marad, máskor az asthmára hasonlít. Éppen ezért az asthma differenciál diagnosztikájához hozzátartozik a CPI kizárása is. Vizsgálatom kiinduló pontja az a megfigyelés volt, hogy az asthma ambulancián számos változó lefolyású CPI-s beteg is megfordult. A korábban nem asthmás betegeknek sokszor csak bronchialis hyperreaktivitás volt a tünetük. Egy részük az igazolt CPI makrolid antibiotikus terápiájára meggyógyult, fél éves követés után sem mutatott bronchialis hyperreaktivitást. Más részük asthmássá vált a klinikailag és szerológiailag is gyógyultnak minosített CPI után. Ha egy korábban asthmás beteg kapott CPI-t, az vagy asthmás rohamokat provokált nála, vagy hosszabb idore súlyosabb stádiumú asthma besorolást és terápiát igényelt. Tekintve, hogy az asthma gyerekkorban foleg allergiás eredetu, az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. Van-e különbség a CPI prevalenciájában asthmás és nem asthmás gyermekek és fiatal felnottek között? 2. Van-e különbség a CPI prevalenciájában allergiások és nem allergiások között? 3. Van-e jelentosége az allergén típusának ebben a mechanizmusban? 10
3.4.2 Betegek, módszerek 3.4.2.1 Betegek A vizsgálatban 139 asthmás (3-22,5 é, á:11é, SD:4,4), 61 allergiás, nem asthmás(5,1-17,8é, á:11,6 é, SD:3,7) és 123 kontroll (3-22,5, á:11,3é, SD:4,7) vett részt. 3.4.2.2 Módszerek 3.4.2.2.1 Klinikai vizsgálatok Az allergia és asthma kimutatása megegyezik a korábbi vizsgálatoknál leírtakkal. 3.4.2.2.2 Chlamydia pneumoniae fertozés kimutatása Megegyezik a 3. vizsgálatban leírtakkal. 3.4.2.2.3 Statisztikai módszerek SPSS11.0 programmal Chi-négyzet próba, Fisher s exact teszt, logisztikus regresszió alkalmazásával dolgoztunk. 3.4.3 Eredmények 1. Az asthma bronchiale-s betegek 48,1%-ában mutattunk ki akut vagy krónikus (perzis ztáló) CPI-t, míg a kontrollokban 45,1%-ban, (p: 0,71) a nem asthmásokban (kontrollok + allergiások) 48,8% -ban (p:0,91). 2. A betegcsoportok különbözo típusú összehasonlításaiból azokban az esetekben kaptunk szignifikáns eltéréseket, ahol az egyik összehasonlított csoportban az allergiás asthmások is szerepeltek. Szignifikánsan több CPI fordult elo allergiásokban (allergia + allergiás asthma), mint nemallergiásokban (kontroll + nem-allergiás asthma ): p: 0,026 OR (95%CI): 1,70 (1,07-2,70). A csak allergiások, de nem asthmások CPI fertozöttsége nem különbözött szignifikánsan a kontrollokétól (p: 0,128). 3. Szignifikánsan többen fertozodtek meg azon allergiás asthmások, akik inhalatív típusú (indoor és/vagy outdoor) allergénre voltak allergiások, mint az inhalatív allergénre negatív asthmások (p: 0,028, OR (95%CI): 3,13 (1,13-8,67)). 4. A krónikus CPI-re jellemzo Chlamydia pneumoniae-specifikus-iga pozitív esetek is szignifikánsan többször fordultak elo az inhalatív allergénekre allergiás asthmások között, mint azoknál, akik inhalatív allergénre negatív asthmások voltak (p: 0,033 OR (95%CI): 5,48 (1,14-26,21)). 11
3.4.4 Megbeszélés Betegeink igen nagy számban (45,1-48,8% -ban) szenvedtek akut vagy krónikus CPI-ben. Ez az arány hasonló az 1991-ben publikált elso magyarországi adatokhoz. Megállapíthatjuk, hogy a C. pneumoniae nem válogat, hasonló arányban fertozi az asthmásokat és kontrollokat. Azonban? az inhalatív allergiás asthmás és a CPI-ban szenvedok között kimutatott szignifikáns összefüggés a két kórkép ok-okozati kapcsolatát feltételezi. Keresztmetszeti vizsgálatból ennek az összefüggésnek az iránya nem meghatározható. Kiegészíto követéses vizsgálatok, epitóp kutatás és genetikai vizsgálatok szükségesek az összefüggés további feltárása céljából. 3.5 Ötödik vizsgálat A MANNÓZKÖTO LEKTIN MUTÁCIÓ ÉS A CHLAMYDIA PNEUMONIAE FERTOZÉS EGYÜTTES HATÁSA AZ ASTHMA BRONCHIALE KIALAKULÁSÁRA 3.5.1 Bevetetés, célkituzés A kollektinek csoportjába tartozó mannózköto lektin (MBL) egy szolubilis pathogén felismero molekula, egy akut fázis fehérje. Lektin részével a pathogének cukorban gazdag felszínéhez kötodik, azok opsonofagocitózisát segítik elo. Kollagén részével - a C1q-hoz való szerkezeti hasonlósága alapján a C1qR-hez kapcsolódik, aktiválja a klasszikus komplement útba kapcsolódó u.n. lektin úton át a komplement rendszert, amely végül a kórokozó líziséhez vezet. Az MBL elégtelen mennyisége a kórokozók leküzdését nehezíti meg. Az MBL gén 1. exonjában ismert 3 féle mutáció bármelyike csökkent MBL expressziót eredményez. Vizsgálatunk célja az volt, hogy az MBL mutáció elofordulását vizsgáljuk asthma bronchiale-s, kontroll és CPI-s betegekben. 3.5.2 Betegek, módszerek 3.5.2.1 Betegek A vizsgálatban 139 asthma bronchiale -s (3-18é, á:10,5é SD:4,1) és 174 kontroll (3-18é, á:11,5é SD:3,9) gyermek vett részt. 3.5.2.2 Módszerek 3.5.2.2.1 Genotipizálás 12
PCR-RFLP módszerrel mutattuk ki az 1. exon 52, 54, 57-es kodonjában levo mutációkat. Mlu I, Ban I, Mbl II restrikciós enzimeket használtunk. A három mutáció bármelyikének elofordulását a nemzetközi irodalom alapján közösen 0 allélként elemzetük. 3.5.2.2.2 CPI kimutatás Megegyezik a 3. vizsgálatban leírtakkal. 3.5.2.2.3 Klinikai vizsgálat Megegyezik az 1. vizsgálatban leírtakkal. 3.5.2.2.4 Statisztikai vizsgálat Allélfrekvencia számolást, Chi-négyzet próbát, logisztikus regressziót, Hardy-Weinberg equilibrium számolást alkalmaztunk SPSS 11.0 programot használtunk. 3.5.3 Eredmények 1. A CPI prevalencia közel egyforma volt asthmában és kontrollban. (IgA: p: 1,0, IgG: p: 0,60, IgM: p: 0,40, IgA+G: p:0,90). 2. MBL allélfrekvencia hasonló asthma bronchiale-ban (27,7%) és kontrollban (25,2%) p: 0,70. 3. MBL allélfrekvencia hasonló CPI-ben szenvedok és CPI-tól mentes gyermekek esetében is mindhárom Chlamydia pnemoniae specifikus antitest vonatkozásában (IgA pozitív és negatívak 0 allélfrekvenciái között p:0,50, IgG esetében: p: 0,10, IgM esetében: p: 0,60). 4. A krónikus CPI és MBL mutáció együtt szignifikánsan gyakrabban fordult elo asthma bronchiale-ban, mint a kontroll csoportban (IgA: p: 0,005 OR: 3,95 (1,52-8,78), IgG: p: 0,005 OR: 3,55 (1,62-6,93), IgA+G: p: 0,01 OR: 5,38 (1,75-14,36). Akut CPI-re jellemzo IgM pozitivitások vonatkozásában nem volt szignifikáns különbség a mutációt hordozó asthma bronchiale -s és kontroll gyermekek között (p: 0,10). 3.5.4 Megbeszélés Eredményeink különleges kapcsolatot igazoltak a krónikus CPI és az asthma között.? Két rizikótényezo a krónikus CPI és az MBL mutáció- együttes elofordulása szignifikáns hajlamosító tényezo asthma bronchiale kialakulására. A genetikai mutáción alapuló alacsony MBL szint modulálja a CPI lezajlását, szerepe van a fertozés krónikussá válásában és a következményes krónikus betegség, az asthma bronchiale kialakulásában. 13
Vizsgálatunk eredménye jó példája a gén környezet úgynevezett nonlineáris kölcsönhatásának. 4. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA, KONKLÚZIÓ Az asthma bronchiale bonyolult patomechanizmusában néhány új aspektust tártunk fel. Felhívtuk a figyelmet a kemokin rendszer szerepére és jelentos hatására a gyulladás kialakításában. Genetikai vizsgálatokkal támasztottuk alá a kemokin rendszer két tagjának mutáció, vagy polimorfizmus okozta expresszió-változásának hatását az asthma bronchiale fenotípusára. Kimutattuk, hogy már gyermekkorban is gyakori a Chlamydia pneumoniae okozta légúti fertozés, amelynek szerepe lehet az asthma bronchiale kialakulásában. A CPI és az inhalatív allergénekre pozitív asthma bronchiale-ben szenvedok között bizonyított szignifikáns összefüggés, valamint a CPI és MBL mutáció közös hatásának igazolása az asthma bronchiale kialakítására további új kutatási irányt jelöl ki az infekciók és allergének, az infekciók, a komplement rendszer és a genetika kölcsönhatásának feltárására. Eredményeinkkel felhívjuk az asthma bronchiale-val foglalkozó szakorvosok figyelmét az infektológiai és genetikai szurovizsgálat jelentoségére és lehetoségére. 14
5. ÖSSZEFOGLALÁS, TÉZISEK Munkánk célja, hogy hozzájáruljunk a gyermekkori asthma bronchiale korszeru diagnosztikájához, differenciáldiagnosztikájához, célzott kezeléséhez és gondozásához. Ezt a Chlamydia pneumoniae fertozés patogenetikai és differenciáldiagnosztikai problémájának bemutatásával, az asthmás betegek genetikai vizsgálatával, klinikai kutatómunka segítségével kívántuk elérni. Az új rizikótényezok feltárásával a prevenciós lehetoségek bovülhetnek, a diagnosztika és terápia pontosabbá válik. Eredményeinket az alábbiakban foglalom össze: 1. Megállapítottuk, hogy a CCR5? 32 mutáció nem véd az asthma bronchiale kialakulása ellen. 2. Az MCP-1-2518A/G polimorfizmus hajlamosít asthma bronchiale kialakulására. 3. Az MCP-1 az asthmás gyulladás kialakításában fontos szerepet tölt be. 4. Eredményeink alátámasztják azt a feltételezést, hogy a gyermekkori asthma bronchiale és a krónikus Chlamydia pneumoniae fertozés között van összefüggés. A) Szignifikáns összefüggést találtunk az inhalatív allergénekre pozitív allergiás asthma bronchiale és a krónikus Chlamydia pneumoniae fertozés között. B) Kimutattuk, hogy az MBL mutáció és a krónikus Chlamydia pneumoniae fertozés együttes elofordulása elosegíti az asthma bronchiale kialakulását. Eredményeinkben tetten érheto a multifaktoriális asthma bronchiale kialakulásában szerepet játszó genetikai és környezetei tényezok kölcsönhatása. A klinikai gyakorlat számára is hasznosítható következtetéseink alapján az asthmás és/vagy allergiás gyermekek genetikai és infektológiai szurovizsgálatától hosszú távon a betegek életminoségének javulását remélhetjük. 15
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönetemet szeretném kifejezni a felsorolt és fel nem sorolt minden munkatársamnak, családomnak, barátaimnak, akik ennek a munkának a megszületését segítették: Dr Falus András Professzor Úrnak, programvezetomnek a kutatási munka támogatásáért, a közleményeim és a disszertáció megírásához nyújtott értékes tanácsaiért, Dr Szalai Csaba témavezetomnek a genotipizálásban, a kutatási munka minden fázisában, a publikációk írásában, és az értekezés összeállításában nyújtott segítségéért, Kis Zoltán Ph.D. hallgató társamnak a statisztikai feldolgozásban nyújtott türelmes segítségéért, Kozma Gergely Ph.D. hallgató társamnak az MCP-1 ELISA vizsgálatoknál és a PCR vizsgálatoknál nyújtott segítségéért, Keszei Márton egyetemi hallgatónak néhány PCR vizsgálatban való részvételéért, Dr Szabó Teréz foorvosnonek, hogy a Heim Pál kórház általa irányított laboratóriumi osztályán a kutatáshoz szükséges berendezések egy részét rendelkezésre bocsátotta, Dr Budai Irénnek a Chlamydia pneumoniae mikrobiológiájának megértésében nyújtott segítségért és az erre vonatkozó publikációban nyújtott hasznos tanácsaiért, Dr Herpay Máriának, Petrovai Fruzsinának és dr Szojka Gizellának a Chlamydia pneumoniae ELISA vizsgálatainak elvégzéséért és az értékelésben nyújtott segítségükért, Dr Kohidai Lászlónak a kemotaxis témakör feldolgozásában nyújtott segítségéért, A Budai Gyermekkórház korábbi és jelenlegi vezetoségének, Péter Ferenc Professzor Úrnak és Blatniczky László Foorvos Úrnak, hogy szakmai amb ícióimat mindig is támogatták és a kutatásokhoz tartozó bizonyos laboratóriumi vizsgálatok lehetoségét biztosították, Dr Újvári Anna által vezetett laboratóriumi, dr Szécsényi-Nagy István által vezetett radiológiai és dr Lellei István által vezetett gégészeti osztályok munkatársainak a számtalan vizsgálat elvégzéséért és értékeléséért, Dr Kalmár Ágnes és dr Madarasi Anna kolleganoimnek az értekezés gondos javításában nyújtott segítségükért, Dr Schuler Ágnesnek a sok szempontú tanácsaiért, 16
Kollegáimnak, akik a mintagyujtésben, és a betegek ellátásában nyújtott helyettesítésben voltak segítségemre, Dombi Mariannak, asszisztensnomnek a fáradhatatlan, kitartó, lelkiismeretes munkájáért, Fonovérünknek Pész Andrásnénak és asszisztenseinknek Holkáné Nemes Katalin, Fábián Magdolna, Skalka Erzsébet, Hatvani Izabella, Briczky Krisztina és a többi munkatársaimnak a vérvételek során és vérminták gyujtésében nyújtott segítségükért, Pálmainé Fábián Klárának az elkallódott leletek felkutatásában nyújtott segítségéért, Kobolákné Zábó Bea asszisztensnek a Prick borpróbák kivitelezéséért, Demeter Judit és Varga Zita könyvtárosoknak az irodalomgyujtésben nyújtott segítségükért, Végül nem utolsó sorban családomnak, barátaimnak. A Ph.D. tandíj fedezésében, bizonyos költséges reagensek vásárlásában és a témámhoz kapcsolódó hazai és külföldi kongresszusi részvételeim költségeinek fedezésében köszönöm a MAKIT és az alábbi cégek támogatását: AstraZeneca, Schering- Plough, Richter, UCB, Frank Diagnosztika, MSD, Biogal-TEVA, AWD, gsk. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK Angol nyelvu közlemények: A Nagy, GT Kozma, Á Bojszkó, D Krikovszky, A Falus, C Szalai. No association between asthma or allergy and the CCR5 delta 32 mutation. Arch Dis Child 2002; 86: 426-427. IF: 2,095 Szalai C, Kozma GT, Nagy A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Falus A. Polimorphism in the gene regulatory region of MCP-1 is associated with asthma susceptibility and severity. J Allergy Clin Immunol 2001; 108: 375-381 IF: 5,506 17
Nagy A, Kozma GT, Keszei M, Treszl A, Falus A, Szalai C. The development of asthma in children infected with Chlamydia pneumoniae is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. J Allergol Clin Immunol 2003; 112: 729-34 IF: 6,282 Nagy A, Kis Z, Budai I, Falus A, Szalai Cs. Associacion of Allergy and Chlamydia pneumoniae Infection in Asthma in Children and Young Adults. Acta Paediatrica (közlés alatt) Budai I, Nagy A, Boriszova D, Rozgonyi F. The prevalence of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae antibodies in Hungarian children with symptoms of atypical pneumonia. The Pediatric Infection Disease Journal (közlés alatt) Kozma GT, Falus A, Bojszkó Á, Krikovszky D, Szabó T, Nagy A, Szalai C. Lack of association between atopic eczema/dermatitis syndrome and polimorphisms in the promoter region of RANTES and regulatory region of MCP-1. Allergy 2002; 57: 160-163 IF: 3,666 Magyar nyelvu közlemények: Szalai Csaba, Kozma Gergely Tibor, Nagy Adrienne, Bojszkó Ágnes, Falus András Az allergiás megbetegedések genomikai megközelítése; lehetoségek és távlatok Orv Hetil 2002; 143 évf. 8. sz.: 381-390 Markusovszky díj 2003. Nagy Adrienne, Budai Irén, Madarasi Anna. Gyermekkori elhúzódó köhögés és az atípusos kórokozók. Praxis 2002. 11 évf. 3. sz. 43-49 Nagy Adrienne, Kozma T Gergely, Keszei Márton, Treszl András, Falus András, Szalai Csaba. A mannózköto lektin polimorfizmus és a Chlamydia pneumoniae fertozés együttes hatása a gyermekkori asthmára. Allergológia és Klinikai Immunológia (közlésre elfogadva) A disszertáció beadásakor az összesített impakt faktor: 17,549 18