Gyermekkori agytumorok epidemiológiájának, lehetséges prognosztikai faktorainak és hazai kezelésének vizsgálata Doktori értekezés Dr. Hauser Péter Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskolá Iskola Témavezető: Dr. Kopper László, egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr Kajtár Pál PhD. med habil. egyetemi tanár Dr. Kovács Tibor, PhD. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai Dr. Szirmai Imre, egyetemi tanár Dr. Magyarossy Edina, PhD. Dr. Nagy Kálmán, orv tud kandidátusa Budapest 2006.
Tartalomjegyzék A szövegben található rövidítések jegyzéke... 5 Bevezetés... 8 Gyermekkori központi idegrendszeri primer daganatok... 8 Előfordulás... 8 Medulloblastoma... 8 a. Kialakulása... 8 b. A medulloblastoma ismert prognosztikai faktorai... 10 c. A hősokkfehérjék lehetséges szerepe a medulloblastoma prognózisában... 12 Hősokkfehérjék mint molekuláris chaperonok... 12 Hősokkfehérjék és az apoptózis... 13 Anti-apoptotikus fehérjék prognosztikai szerepe felnőttkori tumorokban.. 17 d. Medulloblastoma/PNET kezelése... 18 A gyermekkori nem központi idegrendszeri daganatok központi idegrendszeri metasztázisképződésének előfordulása... 18 Célkitűzések... 19 Betegek és módszerek... 21 1. A gyermekkori primer agytumorok gyakoriságának vizsgálata... 21 2. Az anti-apoptoticus hősokkfehérjék vizsgálata medulloblastomában... 22 Betegek... 22 Friss fagyasztott minták... 22 Paraffinba ágyazott szövetminták... 23 Western blot... 23 Immunohisztokémiai vizsgálat... 24 A minták értékelése... 24 Statisztikai vizsgálat... 26 3. A Magyar Agytumor Protokoll kiértékelése... 26 A betegcsoport jellemzői... 26 A daganatok szövettana... 26 A kezelés menete... 27 a. Idegsebészeti beavatkozás... 27 b. Preirradiációs kemoterápiás kezelés... 27 2
c. Sugárkezelés... 27 d. Posztiradiációs kemoterápiás kezelés... 28 e. A kezelésre adott válasz mérése... 28 Túlélés kiértékelése... 28 a. Össztúlélés és statisztikai vizsgálatok... 28 b. A betegek túlélésének értékelése klinikai faktorok szerint... 29 Életminőség értékelése... 29 4. A központi idegrendszeri daganatos érintettséggel járó gyermekkori nemközponti idegrendszeri daganatok incidenciája és klinikuma... 29 Eredmények... 31 1. A gyermekkori központi idegrendszeri rosszindulatú daganatok incidenciája és relatív előfordulási aránya... 31 2. Az apoptózist gátló hősokkfehérjék expressziójának aránya medulloblastomában... 31 Szövettani vizsgálat... 31 Western blot... 32 A tumorszövet minták HSP 27, 70 és 90 festődése... 32 A klinikai faktorok és a HSP expresszió összefüggésének elemzése... 33 Az apoptózist gátló hősokkfehérjék expressziója a szövettani diagnózis függvényében... 34 Az apoptózist gátló hősokkfehérjék expressziójának prognosztikai elemzése.. 34 3. A Magyar Agytumor Protokollal elért terápiás eredmények... 34 A kezelés jellemzői... 34 A betegek túlélése... 35 a. A kezelés végén észlelt állapotuk szerint... 35 b. A rezekció mértéke szerinti kiértékelés... 35 c. Életkor szerinti kiértékelés... 36 d. A primer áttétek jelenléte szerint... 36 d. Rizikócsoportok szerinti kiértékelés... 37 4. A gyermekkori nem központi idegrendszeri daganatok központi idegrendszeri metasztázisképződésének előfordulása és klinikuma... 37 Megbeszélés... 40 3
1. A gyermekkori primer agytumorok incidenciájának vizsgálata... 40 2. Az apoptózis gátló hősokkfehérjék vizsgálata medulloblastomában... 42 3 A Magyar Agytumor Protokollal elért eredmények... 44 Javaslatok a medulloblastomás betegek jövőbeli kezelésének módosítására... 45 4. A gyermekkori nem központi idegrendszeri daganatok központi idegrendszeri metasztázisképződésének előfordulása és klinikuma... 47 Következtetések... 49 Összefoglalás... 51 Summary... 52 Irodalomjegyzék... 53 Táblázatok... 67 Ábrák... 77 Saját közlemények jegyzéke... 92 Az értekezés témájához közvetlenül kapcsolódó közlemények... 92 Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó közlemények... 101 Köszönetnyilvánítás... 111 4
A szövegben található rövidítések jegyzéke 17-AAG=17- allylamino-17-demethoxygeldanamycin ABC= ATP-binding cassette AJCC=American Joint Committee on Cancer Akt=protein kinase B APAF-1=apoptosis protease-activating factor 1 APC= adenomatosus polyposis coli Ara-C=citozin arabinozid Ask1=apoptosis signal regulating kinase-1 AT/RT=atípusos teratoid/rhabdoid tumor bcl-2=b-cell lymphoma 2 fehérje bcl-xl= BCL2-like 1 fehérje bfgf= beta fibroblast growth factor Bid= BH3 interacting domain c-flip= cellular FLICE inhibitory protein ciap=c-inhibitor of apoptosis protein CR=komplett remisszió CT=computer tomograph CTC=common toxicity criteria DAB=diaminobenzidin datp= deoxy-adenosintriphosphat Daxx= Fas-binding protein DIABLO= direct inhibitor of apoptosis protein-binding protein with low pi DISC= death-inducing signaling complex DR=death receptor ErbB2= erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 ETT=Egészségügyi Tudományos Tanács FADD= Fas-associated death domain FasL= Fas ligand Gli= glioblastoma amplified gene GSK3-ß= glycogen synthetase kinase 3-ß 5
Gy=Gray H 2 O 2 =hidrogén peroxid HRP= horseradish peroxidase HSP=heat shock protein (hősokkfehérje) HSF=heat shock factor IAP=inhibitor of apoptosis protein ICCC= International Classification of Childhood Cancer IGF-I=inzulin-like growth factor-i IgG=immunglobulin G JNK= C-jun kinase KIR=központi idegrendszer LEF/TCF= lymphoid enhancer factor / T-cell factor MAPK= mitogen-activated protein kinase MAPKAP= mitogen-activated protein kinase-activated protein MR=mágnes rezonancia vizsgálat MTX=methotrexate MV=megavolt NF-kB= nuklearis faktor kappab OITI=Országos Idegsebészeti Tudományos Intézet OS=overall survival (teljes túlélés) PACAP= pituitary adenylate cyclase activating polypeptide PBS=phosphate-buffered saline PD=progessive disease (progresszív betegség) PFS=progession free survival (progresszió mentes túlélés) PNET=primitív neuroectodermalis tumor PR=parciális remisszió Ptc1= patched1 gén PTCH= patched (Drosophila) homolog RIP=receptor interacting protein Ros= reactive oxygene species SD=stable disease (változatlan állapot) SDS= Sodium dodecyl sulphate 6
Shh=sonic hedgehog SJCRH=St Jude Children s Research Hospital Smac =second mitochondrial activator caspase StrepABC=streptavidin-biotin complex TNF=tumor necrosis factor TNFR-1=tumor necrosis factor receptor-1 TRIS= 4.6 tris(hydroxymethyl)aminomethane TrkC = tirozin kináz C TUKEB= Tudományos Kutatási Etikai Bizottság TXCC=Texas Childrens Cancer Center VCR=vincristine WHO=World Health Organization Wnt=wingless type XIAP= X-linked inhibitor of apoptosis 7
Bevezetés Gyermekkori központi idegrendszeri primer daganatok Előfordulás A gyermekkori malignus betegségek jelentős részét (25-30%) a központi idegrendszeri daganatok képzik. Gyermekkorban a központi idegrendszeri daganatok a leukémiák utáni leggyakoribb malignus betegségcsoportot jelentik 1-3. Számos országban észlelték a gyermekkori központi idegrendszeri daganatok gyakoriságának növekedését az elmúlt évtizedben 2,4,5. Gyermekkorban e daganatok különös jelentőségét egyrészt gyakori előfordulásuk, másrészt lokalizációjukból és terápia iránti rezisztenciájukból fakadó rossz prognózisuk adja. Korábban Magyarországon számukat csak becsülni lehetett regisztrációs nehézségek miatt. 1971-ben alapította meg Schuler Dezső a Magyar Gyermektumor Regisztert. Ez a nyilvántartó rendszer a magyar gyermekonkológiai centrumokban (Budapest, Pécs, Miskolc, Debrecen, Szombathely, Szeged) kezelt gyermekkori tumorok epidemiológiai, morbiditási és mortalitási adatairól naprakész nyilvántartást vezetett. A központi idegrendszeri daganatok bejelentési aránya kezdetben azonban rendkívül alacsony volt. Ennek egyik oka, hogy a primer idegsebészeti ellátó helyekről a betegek jelentős része nem jutott el a Gyermekonkológiai Hálózat 10 központjának valamelyikébe. Másrészről a valós magyarországi esetszámot a szomszédos országokban lakó (elsősorban Románia), de hazánkban kezelt gyermekek bejelentése torzította. Medulloblastoma a. Kialakulása A medulloblastoma, mely elsősorban a cerebellumból indul ki, a leggyakoribb gyermekkori központi idegrendszeri malignus daganat. Számos genetikai faktor 8
kapcsolatba hozható medulloblastomával, így a 17-es kromoszóma részleges elvesztése, vagy mutációja (de ez nem függ össze az ugyanitt található p53 mutációval) 6,7. Számos egyéb gén fokozott expressziója figyelhető még meg: c-myc, pax5, zic, melyek transzkripciós faktorok kódolásában vesznek részt 6,8,9. Pontos szerepük a medulloblastoma kialakulásában még nem tisztázott. Jelen ismereteink szerint a medulloblastoma olyan transzformálódott granuláris prekurzor sejtekből származik, melyek normális differenciációja nem megy végbe 10. Feltételezzük, hogy kialakulását részben migrációs zavar, részben egyes szignáltranszdukciós utak hibái okozzák. Az utóbbi évtizedben két intracellularis jelátviteli út hibáját is felfedezték, melyek gyakran fordulnak elő medulloblastomában, genetikai eredetű betegséghez társult formában is. Az egyik az Shh jelátviteli út hibája, melynek hátterében a Ptc1 gén hibás működése áll. A Shh szekretált fehérje kiemelkedő szerepet játszik a központi idegrendszer, a végtagok, a bőr és egyéb szövetek mintázatának kialakulásában. A Ptc1 transzmembrán fehérje receptorként képes az Shh megkötésére. Amennyiben nincs jelen Shh, a Ptc aktívan gátolja a célgének expresszióját. Jelenlétében a Ptc közvetítette gátlás megszűnik és megindul a célgének átírása. A jelátvivő rendszer tagja még a smoothened (smo) transzmembrán fehérje, a zinc finger transzkripciós faktorok családja, a Gli1, Gli2 és Gli3 fehérjék, melyek képesek aktiválni vagy gátolni a transzkripciót. Összességében, a Shh a Gli fehérjék indukálta célgének transzkripcióját serkenti. 1996-ban fedezte fel Hahn illetve Johnson és munkacsoportja, hogy a Ptc1 gén érintett lehet a medulloblastomákban 11,12. Gorlin 1987-ben írta le a később róla elnevezett szindrómát, melyben kiterjedt bőrtumorok, craniofacialis és csontfejlődési rendellenességek és a medulloblastoma gyakoribb előfordulása észlelhető 13. A sporadikus medulloblastomák 10-20%-ában mutatható ki a Ptc1 lókusz mutációja, ami alapján már feltételezhető volt, de csak később a Ptc1 knock out egereken vált bizonyítottá, hogy a Shh/Ptc jelátviteli rendszer érintett a kisagyi tumorok etiológiájában. 14-17. A medulloblastoma kialakulását a Ptc1 gént inaktiváló vagy a Smo gént aktiváló mutáció idézheti elő. A medulloblastoma kialakulásához már a ptc1 gén heterozigóta hiánya is elegendő 18,19 Ma már azt is tudjuk, hogy a Shh fehérjét a kisagyi Purkinje sejtek termelik 20,21. A Shh jelátvivő 9
rendszer összes tagja kimutatható mind a külső germinális rétegben, mind a granuláris prekurzor sejtekben 10,22. A medulloblastomában észlelt másik hibás jelátviteli rendszer a Wnt rendszer, melynek felismeréséhez a Turcot-szindróma (colorectalis carcinoma és medulloblastoma gyakori kialakulása ugyanabban a betegben) vezetett 23, melyben az APC gén érintett 24. Az elmúlt évtizedben fedezték fel, hogy az APC fontos eleme a wnt jelátvivő rendszernek 25,26. A wnt rendszer szerepet játszik a központi idegrendszer, a végtagok és egyéb szövetek sejtjeinek fejlődésében és szabályozásában. Elengedhetetlen a középagy/előagy isthmusának kialakulásához, melyből a kisagy is kifejlődik 27,28. A jelátvitel során először a wnt kötődik a frizzled receptorhoz, aminek révén befolyásolni képes a sejt β-katenin szintjét. Amennyiben a wnt nincs jelen, akkor a β-katenin foszforilálódik, majd a GSK3-β, axin és a tumorszuppresszor APC-t tartalmazó fehérje komplex révén a proteoszóma rendszerben lebomlik. A wnt kapcsolódása a frizzled receptorhoz inaktiválja a GSK3- β-t, aminek hatására a β-katenin nem foszforilálódik, így nem bomlik le. Amennyiben a β-katenin akkumulálódik a sejtben, akkor bemegy a sejtmagba, és a LEF/TCF család transzkripciós faktoraihoz kapcsolódva transzkripciós aktivátorokká alakítja őket, melyek a sejtciklust serkentő c-myc, cyclin D és más gének transzkripcióját indítják be. A wnt reakcióútjának mutációit számos daganat kialakulásában rizikótényezőnek gondolják. A sporadikus medulloblastomában az APC mutációját 4%-ban, a β-katenin mutációját 8-15%-ban mutatták ki 29. A legújabb kutatások szerint a ß-kateninek fokozott intranukleáris akkumulációja kedvező prognosztikai marker medulloblastomában 30. b. A medulloblastoma ismert prognosztikai faktorai Hasonlóan más gyermek- és felnőttkori daganatokhoz a medulloblastomás betegek túlélési valószínűsége számos faktor alapján megjósolható. Korábban ebben csak a klinikai faktorok játszottak szerepet (betegség kiterjedése, a beteg életkora). Chang 1969-ben kidolgozta a hátsó scalai medulloblastomák preoperatív staging rendszerét, mely a mai napig használatban van 31. A besorolás a primer tumor méretén, kiterjedésén, lokalizációján illetve a liquorszóródás vagy képalkotókkal detektálható metasztázisok jelenlétén alapul. A Chang féle rendszer egyes elemei 10
mára vesztettek jelentőségükből. A hatékony kemoterápiás protokollok eredményeként ma már az egyik legfontosabb tényező a sebészi eltávolítást követő reziduális tumor mérete. A gyermekek életkora terápiás szempontból fontos, mivel 3 év alatt sugárkezelés nem alkalmazható. Az úgynevezett age-adopted irradiáció, melynek lényege, hogy csökkentett dózist alkalmaznak 3 éves kor alatt, nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket 32,33. Mindezek alapján ma világszerte a következő klinikai faktorokat veszik figyelembe a betegség rizikócsoport szerinti besorolásánál: életkor, képalkotókkal kimutatható áttétek esetleges jelenléte és a posztoperatív reziduális betegség kiterjedése 34. Magas rizikójú betegségről beszélünk akkor, ha a beteg életkora kevesebb mint 3 év, vagy képalkotókkal kimutatható metasztázis észlelhető, illetve, ha a képalkotókkal észlelt reziduális tumor mérete valamely síkban nagyobb mint 1,5 cm 2. Azonban, számos esetben a klinikailag kedvező prognózisú betegség szokatlanul agresszív lefolyást mutatott, illetve rossz prognózisú beteget sikerült véglegesen meggyógyítani. A sejt- és molekuláris biológia fejlődésével egyre újabb tényezők váltak ismertté, melyek fontos szerepet játszanak a medulloblastoma rizikócsoportok szerinti besorolásában. A klinikai tényezőktől független prognosztikai faktorok közül elsőként Segal mutatta ki Northern blottal a neurotrophin receptor TrkC-ről 1994-ben, hogy fokozott expressziója a klinkai faktoroktól függetlenül kedvezően befolyásolta a túlélést 35. A TrkC, parakrin és autokrin aktivációja révén, apoptózist indukál a medulloblastoma sejtekben. Ez a jelenség magyarázhatja a fokozott expressziójával összefüggő kedvezőbb prognózist 36. A későbbiekben kimutatták, hogy a c-myc amplifikációja, mely a medulloblastomák kevesebb, mint 20%-ában van jelen, kedvezőtlen prognózissal jár együtt 37. Hasonlóképpen ismert, hogy a 17-es kromoszóma rövid karjának elsősorban anaplasticus medulloblastomákban előforduló deléciója kedvezőtlen prognózissal jár együtt. A proliferációs faktorok közül az ErbB2-receptor (HER2/neu) fokozott expressziójának kedvezőtlen prognosztikai hatása a legismertebb 38,39. A medulloblastoma kialakulásában szerepet játszó intracellularis szignáltranszdukciós utak hibás működésének (wnt, Shh) prognosztikai jelentősége még csak részben ismert 30. 11
Medulloblastomában az apoptózis prognosztikai szerepéről csak néhány közlemény számol be, melyek meglehetősen ellentmondásosak az apoptózis és a kedvező prognózis összefüggését illetően 40 41,42. A kutatásban az utóbbi években terjedt el a microarray technika 43, mely nagymértékben gyorsíthatja, esetenként felülírhatja, illetve idővel kiválthatja a klasszikus patológiai vizsgálatokat. Jelentős költség, infrastrukturális és szakszemélyzeti szükségletei miatt azonban még jelentős ideig nem fogja átvenni a jelenlegi patológiai diagnosztika helyét. Ezért szükség lesz a továbbiakban is a hagyományos egyszerűbb vizsgálatokra, melyek prognosztikai igényeket is kielégíthetnek. Ez vezetett arra, hogy olyan cellularis faktorokat keressek, mely segítségünkre lehet a prognózis mind pontosabb megítélésében. c. A hősokkfehérjék lehetséges szerepe a medulloblastoma prognózisában Hősokkfehérjék mint molekuláris chaperonok A hősokkfehérjéket 1962 fedezték fel. Drosophilia melanogaster nyálmirigy szövetében, előzetesen alkalmazott szubletális hősokk kezelést követően, nagyszámú, addig nem azonosított, stresszválaszként termelődött rokonfehérjét sikerült kimutatni 44. Prokariótáktól a legmagasabb szinten szerveződött emberi szervezetig, evolúciósan erősen konzerváltan valamennyi élő sejt rendelkezik egy ősi védekező mechanizmussal, amely egy fehérje szupercsalád jelenlétéhez kötött. A szupercsalád tagjait stressz- vagy elsőként felfedezett indukáló ágensük alapján - hősokkfehérjéknek (HSP) nevezték el. Nyugalmi állapotban a sejtszintű homeosztázisban, károsító behatások során a sejtek túlélésében alapvető szerepet töltenek be 45. Eukarióta sejtek valamennyi kompartmentjében és organellumában fellelhetők, részvételük a sejtfunkciókban rendkívül szerteágazó és teljes részletességgel nem ismert. Nyugvó sejtekben molekuláris chaperonként (kísérőként) viselkedve a transzláció során elősegítik a polipeptid láncok megfelelő felcsavarodását, ezáltal a fehérjék natív szerkezetének kialakítását, hibás felcsavarodás esetén annak kijavítását. Számos fehérje konformációjának változtatásán keresztül szabályozzák enzimek aktivitását, támogatják különböző 12
multiprotein komplexek összeillesztését és szétválását, irányítják az elöregedett, agregálódott, vagy irreverzibilisen sérült fehérjék proteoszómális lebontását, ezzel is hozzájárulva a vitális sejtfolyamatok épségéhez, valamint elősegítik az intracellularis membránokon keresztül a fehérjék transzportját, biztosítva a kész fehérjék célorganellumokba történő eljutását 45,46. Ilyen kiterjedt feladatkör révén a HSP-k valóban a sejtek egyik fő szabályozó fehérjéi, amelyek nélkülözhetetlenek az egyes sejtfolyamatok zavartalan fenntartásában, és alapvető fontosságúak olyan sejtprogramok hibátlan megvalósulásában, mint a sejtciklus, a proliferáció, vagy a differenciáció 47,48. Hasonlóképpen kulcsszerepet töltenek be a sejtek károsító behatásokra adott válaszában. Gyulladás, hypoxia, nehézfémek, endotoxinok, reaktív oxigén szabadgyökök, kemoterápia és egyéb citotoxikus stimulusok a sejtekben fokozott HSP termelést váltanak ki, melyek termelődésük mértékének arányában segíthetik a sejtek túlélését 49. A HSP-k sejtbeli jelenlétük alapján két fő csoportra oszthatók: konstitutívan jelenlévők és indukálhatók. Azaz, egyesek normális körülmények között is folyamatosan expresszálódnak és adott koncentrációban állandóan jelen vannak a sejtekben, ezek a konstitucionális HSP-k. Az indukálható HSP-k csak sejtkárosító hatások következtében kezdenek el termelődni. A két csoport között azonban nem húzható éles határ, mivel az indukálhatók egyes sejtekben stresszmentes állapotban alacsony koncentrációban kimutathatók, illetve a konstitucionálisak HSP szintézise fokozódhat károsító hatás esetén. A HSP-k ma elfogadott besorolása molekulasúlyuk alapján történik 50. Megkülönböztetünk úgynevezett kis molekulasúlyú HSP-ket (HSP 27) illetve a nagyobb molekulasúlyúakat (HSP 60, HSP 70, HSP 90 és HSP 104), melyek számos altípusa létezik. A HSP-k szintézisének szabályozása a HSF-k révén, transzkripciós szinten megy végbe 51. Egyes típusai a HSP-k gyors indukcióját segítik elő (HSF-1), mások a lassabb indukciót szabályozzák trimerizációjuk révén 52. Hősokkfehérjék és az apoptózis 13
Az apoptózis a sejtrendszerek működését szabályozó egyik legfontosabb mechanizmus, melynek során a feleslegessé vált vagy károsodott sejtek elpusztulnak. Ennek pontos mechanizmusa a tankönyvekből és tudományos publikációkból ma már jól ismert 53-56. Az apoptózis szabályozása molekulárisan több szinten bekövetkezhet. A hősokkfehérjék sejtműködésben játszott komplex funkciójuk részeként több ponton is befolyásolni képesek az apoptózis folyamatát. Citoprotektív fehérjékként, a HSP-k komplex módon vesznek részt az apoptózis szabályozásában. Közreműködnek a jelátviteli utak folyamataiban, valamint molekuláris chaperonokként számos kulcsmolekulát befolyásolnak. A hősokkfehérjék az apoptózisban mind gátlóként, mind serkentőként résztvesznek. HSP 27 A HSP 27 több szinten képes gátolni az apoptózist. Szerepet játszik mind a sejtfelszíni receptorról induló apoptózis kaszkád, mind a mitokondriális út szabályozásában. A HSP 27-et a MAPKAP kináz-2 foszforilálja, melynek eredményeként képessé válik a dimerizációra. A HSP 27 csak dimer formában képes a Daxx fehérjéhez kapcsolódni. Ha nincs jelen a dimerizált HSP 27, a Daxx fehérje halál doménjével a FasL-ot kötő Fas receptorhoz kötődik. Ekkor aktiválódik az Ask1 szerin-threonin kináz, mely aktiválja a a JNK reakcióútat, mely végső soron apoptózishoz vezet 57. A HSP 27 elősegíti a cytochrom c és a Smac/DIABLO mitokondriális retencióját, így akadályozza a depolarizált mitokondriumból való kiáramlásukat 58,59. Ugyanakkor, a dimer HSP 27 a mitokondriumból kiáramló cytochrom c-hez kapcsolódik a citoplazmában, így gátolja meg a kaszpáz 9 aktiválódásához szükséges prokaszpáz-9, cytochrom c és Apaf-1 alkotta apoptoszóma komplex létrejöttét, és a következményes apoptózist 60,61. A HSP 27 kötődik a prokaszpáz 3-hoz is, gátolva annak aktiválódását 62. A HSP 27 mindemellett citoprotektiv hatást fejt ki az intracellularis anti-oxidáns glutathion koncentráció növelésével, és - chaperon funkciójaként - az oxidált fehérjék semlegesítésével 63,64. A HSP 27 fokozott expressziója gátolja a TNFα okozta cytotoxicitást és az inflammatorikus cytokinek 14
reaktív-oxigéngyök termelését 65. A HSP 27, kapcsolódva a proliferációt serkentő Akt-hoz megvédi annak kináz aktivitását a hőstressztől. Neutrofilekben az Akt aktiválódásához szükséges a HSP 27 kapcsolódása 66,67. Az apoptózis kései, végrehajtó fázisában, a sejtmembrán jellegzetes morfológiai változása a membrán kitüremkedések (blebbing) képződése. A hólyagképződést valószínűleg az actomyosin kontraktilis apparátusa irányítja. A HSP-k többsége vagy közvetlenül, vagy actinkötő fehérjén keresztül kapcsolódik az actomyosin komplexhez. A HSP27-ről bizonyított, hogy jelen van a kitüremkedéseket határoló F-actin gyűrűben és elősegíti annak szerkezeti visszarendeződését 65. Összességében a HSP 27-t apoptózist gátló fehérjének tartjuk. HSP 70 A HSP 70 az apoptózisban játszott többfajta szerepét összegezve apoptózist gátló fehérjének tekinthető. A HSP 70 család legismertebb tagjai: a stressz indukálta HSP 70, a mitokondriális HSP 75 és az endoplazmatikus retikulumban elhelyezkedő grp 78. Élettani körülmények között a HSP 70 fehérjék ATP függő chaperon funkciói a következők: újonnan szintetizált fehérjék csomagolása, multiprotein komplexek összeállítása, fehérjék transzportja a sejtmembránon keresztül. Fokozott expressziója megvédi a sejteket a stressz indukálta apoptózistól. Képes a sejteket megóvni az energiacsökkenéstől és az ATP-csökkenés okozta sejthaláltól 68. Gátolja a Fasindukálta apoptózist, bár Jurkat sejtekben ennek ellenkezőjét is észlelték 69,70. A HSP 70 általános gátló szerepet fejt ki a stressz-kináz útvonalakon a JNK gátlása révén 71. A HSP 70 Akt-hoz kötődve stabilizálja azt. Az Apaf-1-hez közvetlenül kötődve, gátolja az apoptoszóma képződését. A gátlás feltehetően az Apaf-1, kaszpáz kapcsoló doménjén megy végbe 72. Az Apaf-1-től független apoptózist is akadályozza. Az apoptózis során, normálisan a mitokondrium membránközti terében elhelyezkedő AIF transzlokálódik a citoplazmába és a nucleusba, ahol részt vesz a kaszpázoktól független apoptotikus folyamatokban 73. A HSP 70 közvetlenül az AIF-hez kapcsolódva gátolja az AIF-függő apoptotikus folyamatokat 72,73. Gátolja a kaszpáz-3 fokozott expresszióját és a kaszpáz-3 és -9 aktivitását 74. Az apoptózis kései 15
kaszkádfüggő eseményei közül gátolja a citoplazma foszfolipáz A2 aktiválódását és a sejtmag morfológiai változásait 74. HSP 90 A HSP 90 klinikai jelentősége gátlószerei miatt jelenleg a legnagyobb. Mindemellett, az eddig említett HSP csoportokhoz képest a legkevésbé egyértelmű az apoptózisra kifejtett összhatása. Szerepet játszik a TNF receptor jelátvivő rendszerének befolyásolásában. A TNFR-1 - ligand interakció során a RIP a receptorhoz kapcsolódva aktiválja az NFκB-t és a JNK-t. Amennyiben HSP 90 jelen van, RIP-hez kötődve stabilizálja azt. Ha ez az interakció nem jön létre, a RIP gyorsan destabilizálódik és lebomlik. Ez a TNF indukálta NF-κB aktivitás csökkenéséhez és a sejt fokozott sebezhetőségéhez vezet, ami pro-apoptoticus hatást jelent 75. Ugyanakkor, a HSP 70-hez hasonlóan, közvetlenül az Apaf-1-hez kötődve, meggátolja annak oligomerizációját és kötődését a prokaszpáz-9-hez, azaz az apoptoszóma képződését 76. Közvetlenül az Akt-hoz kötődve megvédi azt a defoszforilizációtól és a következményes lebomlástól, csökkentve az apoptózis valószínűségét. 77. HSP 60 és HSP 10 A HSP 10-et és a HSP 60-at jelen tanulmányunkban nem vizsgáltuk, mivel az apoptózisban betöltött szerepük még nem tisztázódott egyértelműen. Mindkettőt a mitokondrialis HSP-k csoportjába sorolják, noha az újabb kutatások kimutatták, hogy a HSP 60 30%-a a citoplazmában található 78. A HSP 60 és co-chaperonja a HSP 10 pro-apoptotikus szerepét mutatja a pro-kaszpáz-3 aktivációjának serkentése HeLa és Jurkat sejtekben 79. Ezzel szemben, cardialis sejtekben a citoplazmatikus HSP 60 komplexet képez Bax-szal és Bak-kal, csökkentve a pro-apoptotikus Bax mennyiségét. A HSP 60 és a HSP 10 emelkedett szintje gátolják a cytochrom c kibocsátást a mitokondriumból, növelik az anti-apoptotikus Bcl-xl, Bcl-2 szintjét és csökkentik a proapoptotikus Bax szintjét, tehát ebből a szempontból apoptózist gátló hatásúak 78. 16
Anti-apoptotikus fehérjék prognosztikai szerepe felnőttkori tumorokban Egyes vélemények szerint a kemo- és radioterápia okozta daganatsejt pusztulásban az apoptózis is szerepet játszik 80. Egyes hősokkfehérjék sokirányú komplex funkciójuk mellett, amint láthattuk az eddigiekben, apoptózis-gátló hatást is kifejtenek (HSP 27, 70, 90). Ezeket a hősokkfehérjéket jelen dolgozatomban közös névvel apoptózis gátló hősokkfehérjéknek fogom nevezni. Ezen HSP-k intracellularis szintje és a daganatos betegségek túlélése közötti összefüggés lehetősége felmerül. Anti-apoptotikus HSP-k prognosztikai szerepéről rosszindulatú daganatos betegségekben viszonylag kevés publikáció született. Az eddig megjelent közlemények azonban ellentmondásos képet mutatnak. Húgyhólyagcarcinoma esetében nem lehetett kimutatni prognosztikai összefüggést a túlélés és a daganatsejtek HSP 27, a HSP 70 és a HSP 90 expressziója között 81. Ugyanitt a HSP 60 citoplazmatikus jelenléte, vagy prostata és emlőcarcinomában a HSP 27 expressziója független prognosztikai faktornak bizonyult 81-83. A szájüregi laphámcarcinomában HSP 27, nyelőcső laphámcarcinomában a HSP 70, endometrialis carcinomában a HSP 27 és a HSP 90, pancreas adenocarcinomában, melanoma malignumban a HSP 70 fokozott expressziója kedvező prognózissal járt együtt 84-88. Néhány közlemény az anti-apoptotikus HSP-k fokozott expressziója és a rövidebb túlélés közötti szignifikáns összefüggésről számol be egyes tumoroknál: ovarium carcinomában a HSP 27, endometrialis carcinomában a HSP 70, prosztata carcinomában a HSP 27 és emlőcarcinomában a HSP 70 fokozott expressziója esetén 82,85,89. Gyermekkori központi idegrendszeri malignus daganatok esetében egyes HSPk expressziójának és a betegség prognózisának esetleges összefüggését korábban még nem vizsgálták. 17
d. Medulloblastoma/PNET kezelése A gyermekkori agydaganatok kezelése az elmúlt évtizedekben jelentős változáson ment át. Újabb idegsebészeti módszerek, komplex kemoterápiás kezelés és az irradiációs technikák fejlődése javították az agytumoros betegek túlélését és csökkentették a késői mellékhatások kialakulásának valószínűségét. Mindezen fejlődés ellenére, az eddig alkalmazott különböző kezelési protokollok egyike sem mutatott kiemelkedően jó túlélést 90-94. Az agytumorok közül a medulloblastoma és a PNET kezelése a legbíztatóbb, tekintettel kifejezett kemoszenzitivitásukra 95-98. Hazánkban a medulloblastoma és PNET kezelésében korábban egy nagyon hatékony, saját fejlesztésű kezelési sémát alkalmaztunk, melyet egyik bázisszere, a dibromodulcitol gyártásának leállása miatt kellett abbahagyni 99. Schuler Dezső 1998- ban egy újabb protokollt dolgozott ki (Magyar Agytumor Protokoll), melyet 2004-ben értékeltünk ki. A gyermekkori nem központi idegrendszeri daganatok központi idegrendszeri metasztázisképződésének előfordulása A nem központi idegrendszeri malignus gyermekkori daganatok esetében közvetlen invázióval vagy hematogén úton, ritkán központi idegrendszeri daganatos érintettség alakulhat ki. Jelen dolgozatomban a két jelenséget közös névvel központi idegrendszeri metasztázisnak fogom nevezni. Ezek gyakoriságáról, kezeléséről és kimeneteléről nagyon kevés felmérés található a nemzetközi és hazai irodalomban. 18
Célkitűzések Munkám során az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. A gyermekkori tumorok incidenciájáról a Magyarországon már évtizedek óta működő Gyermek Tumor Regiszter révén pontos adatokkal rendelkezünk. Kivételt jelentettek azok az agytumoros betegek, akik nem minden esetben kerültek az onkológus látóterébe, sok esetben csupán idegsebészeti ellátásban részesültek. Célom volt: a. a központi idegrendszeri daganatok magyarországi gyakoriságának pontos meghatározása, b. a gyermekkori agytumorok relatív frekvenciájának meghatározása az új WHO 2000 besorolás alapján, c. a magyarországi adatok összehasonlítása a külföldi adatokkal. 2. Jelenlegi ismereteink alapján a hősokkfehérjék közül háromnál (HSP 27, 70 és 90) figyelhető meg apoptózis gátló hatást, e hősokk-fehérjék számos egyéb funkciója mellett. A három HSP apoptózis gátló hatását axiómaként, kiindulási pontként, illetve kiválasztási szempontként fogadtam el további, alapvetően klinikailag orientált vizsgálatunkhoz. Tanulmányoztam a. A három anti-apoptotikus hősokkfehérjék (HSP 27, 70, 90) expressziós mintáját és előfordulási gyakoriságát medulloblastomában, b. a HSP 27, 70 és 90 expressziójának viszonyát a klinikai faktorokhoz (életkor, áttét képződés, szövettani diagnózis, tumor eltávolíthatósága), c. egyes anti-apoptotikus hősokkfehérjék (HSP 27, 70, 90) prognosztikai szerepét expressziójuk függvényében. 3. Kiértékeltem az 1998-ban bevezetett Magyar Agytumor Protokoll a. mellékhatásait és tolerabilitását, b. terápiás eredményeit, c. javaslatot tettem a Magyar Agytumor Protokoll módosításaira. 19
4. A gyermekkori nem központi idegrendszeri daganatok központi idegrendszeri metasztázisának kialakulása mind Magyarországon, mind külföldön kevés figyelmet kap, pedig jelentkezése nagymértékben meghatározza a betegség prognózisát. Vizsgáltam, hogy a. melyik daganattípusnál, milyen arányban jelentkezik központi idegrendszeri metasztázis, b. mutat-e valamilyen törvényszerűséget a primer tumor, illetve a központi idegrendszeri áttét lokalizációja, c. melyik alkalmazott kezelés bizonyult hatékonynak, d. milyen hosszú túlélés várható a metasztázis jelentkezése esetén, e. összehasonlítottam a hazai és külföldi epidemiológiai és túlélési adatokat. 20
Betegek és módszerek 1. A gyermekkori primer agytumorok gyakoriságának vizsgálata A vizsgálat során a 15 évnél fiatalabb, agytumoros gyermekek adatait elemeztük. A betegeket az ICCC alapján soroltuk be 100. Szövettanilag, a WHO 2000-es ajánlását figyelembe véve, négy csoportba soroltuk a betegeket: medulloblastoma/pnet, astrocytoma, ependymoma és egyéb tumorok (craniopharyngeoma, plexus choroideus carcinoma, atypusos teratoid/rhabdoid tumor, differenciálatlan gliomák) 101,102. A betegek adatai főként az Országos Gyermek Tumor Regiszter nyilvántartásából származnak (473 beteg), melyek a Magyar Gyermekonkológiai Hálózat 10 központjában kezelt gyermekek adatain alapulnak. Ezeket az adatokat a magyarországi idegsebészeti központok adataival egészítettük ki, mivel számos beteg az idegsebészeti ellátást követően nem került át további gondozás céljából valamely gyermekonkológiai központba (354 beteg), így adataik az Országos Gyermek Tumor Regiszterben sem szerepeltek. Továbbá a megyei gyermekfőorvosok bevonásával összegyűjtöttük az egyedül a körzeti gyermekorvosok nyilvántartásaiban szereplő betegeket (17 beteg). Az egyéb gyermekkori malignus betegek adatai esetében az Országos Gyermek Tumor Regiszter adatait használtuk fel. Az átlagos éves incidencia számításához szükséges magyar gyermekpopuláció nagyságának meghatározásánál a Központi Statisztikai Hivatal adatait vettük figyelembe, melyek minden év kezdetén meghatározásra kerülnek 103. A standardizációt 4 korcsoport figyelembevételével (0 éves, 1-4 évesek, 5-9 évesek, 10-14 évesek) direkt módszerrel a világ standard gyermekpopulációjának figyelembevételével végeztük. Három korcsoportban számoltunk kor-specifikus incidenciát: 0-4 éves, 5-9 éves, 10-14 éves. Az incidencia változásának tendenciáját lineáris regressziós vizsgálattal elemeztük, és t-próbával ellenőriztük. A magyarországi részletes adatokat a német regiszter (German Childhood Cancer Registry) adataival hasonlítottuk össze 104. A magyarországi gyermek agytumor 21
incidencia összehasonlítására skandináv, francia és észak-amerikai adatokat is felhasználtunk 1,2,104-107. 2. Az anti-apoptoticus hősokkfehérjék vizsgálata medulloblastomában Betegek 1988 és 2004 között, az OITI-ben operált, előzetesen daganatellenes kezelésben nem részesült medulloblastomás betegek daganatos szövetmintáit vizsgáltuk. A betegek medián életkora 6,96 év volt (szélső értékek: 0,02-31,23 év). A tumor 43 esetben került teljes eltávolításra, parciális eltávolítás 19 esetben történt és 3 esetről nincsenek adatok. Képalkotókkal nem volt kimutatható metasztázisa (M0-1) 50 betegnek, primeren többgócú tumora (M2-3) 12 betegnek volt és 3 esetről nincs adatunk. 45 betegnél alkalmaztak műtét utáni kemoterápiát és sugárkezelést. 16 beteg, akik 3 évnél fiatalabbak voltak, csak kemoterápiás kezelésben részesültek és 4 beteg csak sugárkezelést kapott. Friss fagyasztott minták 2002-ben hoztuk létre a Semmelweis Egyetem II.sz. Gyermekklinikáján a Gyermek Tumor Bankot. A minták ETT és TUKEB engedélyt követően az OITI-ben végzett tumoreltávolító műtétek során kerültek tárolásra a Gyermek Tumor Bankban a diagnosztika és prognosztika javítását célzó tudományos vizsgálatok végzéséhez. Jelen vizsgálat 3 mintája is innen származik. A Daoy medulloblastoma sejtvonal a TXCCC ajándéka volt. 22
Paraffinba ágyazott szövetminták Az OITI-ben kuratív céllal eltávolított medulloblastomából a mintákat formalinban fixálták és paraffinba ágyazták. A 65 felhasznált minta előzetesen sugárvagy kemoterápiás kezelésben nem részesült betegekből származik. A szövettani diagnózist minden esetben neuropatológus (Dr. Hanzély Zoltán) állította fel. A medulloblastomával könnyen összetéveszthető AT/RT-s mintákat a rhabdoid sejtek jelenléte alapján kizártuk. A betegek nem személyes, betegségükkel kapcsolatos adatait a Magyar Gyermek Tumor Regisztertől kaptuk meg. Western blot A friss, fagyasztott, agytumoros mintákat (10-50 mg-os súlyú) folyékony nitrogénben fizikailag homogenizáltuk, majd mintánként 100-500 μl proteáz inhibitor keveréket tartalmazó Laemmli pufferban (Sigma, St. Louis, USA) lizáltuk. A teljes lizátumot 90 ºC-on 2 percig forraltuk, majd 3 óráig inkubáltuk jégen. A sejttörmelék eltávolítása céljából a lizátumot 16000 g-n 30 percig centrifugáltuk. A sejtlizátumok fehérjekoncentrációját microbca fehérjemérő készlettel (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) határoztuk meg. A fehérjék futtatását (HSP 70: 10 μg, HSP 27 és HSP 90: 20 μg) 10%-os SDS polyacrylamid gélen végeztük 30 percig, 10 ma/cm áramerősséggel. Ezt követően elektroblottinggal nitrocellulose membránra vándoroltattuk a fehérjéket (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). A membránokat TBS (20 mm TRIS, 150mM NaCl, ph: 7,4) 5 %-os nonfat dry milk és 0,1 %-os Tween 20 oldatában 12 órán át inkubáltuk +4 ºC-on. A membránokat a primer antitestekkel 0,1%-os Tween 20 és 0,1 %-os BSA-t (Sigma, St. Louis, USA) tartalmazó TBS oldatban inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd kimostuk 0,1%-os Tween 20 tartalmú TBS-ben. Ezt követően a megfelelő biotinilált másodlagos antitesttel inkubáltuk további 1 óráig szobahőmérsékleten. A specifikus antigén-atitest reakciót StreptABC Complex/HRP konjugátum 1:5000-es hígitású 23
oldatával erősítettük fel (DakoCytomation, Denmark), majd DAB-bal vizualizáltuk (Sigma, St. Louis, USA). A vizsgálat során az antihuman HSP 27 antitestet (F-4) (egér, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1:500-as hígitásban, az antihuman HSP 90α/β antitestet (F-8) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1:1000 hígításban és az antihuman HSP 70 antitestet (nyúl, Dako Corporation, USA) 1:1000 hígitásban, a szekunder antitestként használt biotinilált egérellenes IgG-t és nyúlellenes IgG-t (kecske) (DakoCytomation, Denmark); 1:1000 hígitásban alkalmaztuk. Immunohisztokémiai vizsgálat Az immunhisztokémiai vizsgálathoz paraffinba ágyazott minták metszeteit használtuk fel. Mintánként 3 metszetet készítettünk egy hematoxylin-eosinnal festett metszeten kívül. A metszeteket először xylolban deparaffináltuk, majd alkohollal rehidráltuk. 10 perces H 2 O 2 kezeléssel az endogén peroxidázokat gátoltuk. A HSP 27 vizsgálatára készített metszeteket mikrohullámú feltáró készülékkel is kezeltük háromszor 10 percig. Ezt követően a mintákat szobahőmérsékleten 1 órán át a különböző ellenanyagokkal inkubáltuk: monoklonális egér HSP 27 ellenanyag (sc- 13132 Santa Cruz Biotechnology, Inc) 1:100 hígításban, poliklonális nyúl HSP 70 ellenanyag (A0500 Dako Corporation, USA) 1:250-es hígitásban és monoklonális egér HSP 90 antitest (sc-13119, Santa Cruz Biotechnology, Inc) 1:200-as hígitásban. Ezt követően a metszeteket kétszer 10 percig PBS pufferral öblögettük, majd biotinilált másodlagos antitesttel szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. Végül streptavidin-biotin-peroxidase komplexszel inkubáltunk 15 percig szobahőmérsékleten. Újabb 2x10 perces PBS pufferes öblögetés után 20 percig DABdal (Sigma, St. Louis, USA) vizualizáltuk az ellenanyagokat. A desztillált vizes öblögetést és 30 másodperces Mayer-féle hematoxylines magfestést követően a metszeteket dehidráltuk alkohollal, xylollal kezeltük és végül Kanada-balszammal fedtük. A minták értékelése 24
A szövettani mintákat fénymikroszkóppal értékeltük. A típusos tumoros területeket a hematoxylin-eosinnal festett metszetek értékelése alapján választottuk ki. Pozitív belső kontrollként az egyes ép kisagyi struktúrák (Purkinje sejtek, reaktív astrocyták) és a vaszkuláris struktúrák minden esetben észlelhető hősokkfehérje (HSP27, HSP70 és HSP90) festődését használtuk fel. A vizsgálat során a perinecroticus és perivascularis területek feltételezett stressz-reaktív pozitivitását figyelmen kívül hagytuk. A kiértékelés során csak a daganatsejtek citoplazmáját vettük figyelembe. A mintákat kétféleképpen értékeltük. Az egyik szempont szerint az adott mintára típusos látótérben látható pozitív tumorsejtek becsült százalékos arányát vettük figyelembe. Amennyiben egy metszeten belül, élesen elkülönülő, eltérő HSP festődést mutató szövettani struktúrák jelenlétét észleltük (egyes, kifejezett nodularitást mutató desmoplasticus minták), akkor az értékelésnél az eltérő struktúrákat az egész metszetre jellemző arányuknak megfelelően vettük figyelmbe. A mintákat, a hősokkfehérjék átlagos expressziója illetve az expreszió százalékos értékeinek megoszlása alapján, a különböző HSP-k esetében eltérő értékhatárok szerint csoportosítottuk. HSP 27 és HSP 90-nél: <10% és >=10%; HSP 70 esetében <70% és >=70% értéktartományú csoportokat hoztunk létre. A másik értékelési módnál a HSP pozitív sejtek citplazmatikus festődésének intenzitását értékeltük. A daganatsejtek citoplazmájának HSP pozitivitását az erek HSP pozitivitásához hasonlítottuk. Ennek megfelelően a vizsgált mintákat negatívnak értékeltük, ha nem mutattak egyáltalán pozitivitást; gyengén pozitívnak, ha a daganatsejtek festődése gyengébb volt az erek festődésénél; közepesen pozitívan amennyiben a daganatsejtek citoplazmatikus festődése azonos volt az erek festődésével és erősen pozitívnak, ha erősebb volt annál. Gyengén pozitív és negatív festődés számos esetben nem volt egyértelműen elkülöníthető, ezért a két csoportot a kiértékelésnél egy csoportba vontuk össze. Hasonlóan a közepesen, illetve erősen pozitív csoportot is egy csoportnak vettük, mely egyértelműen elkülönült a gyengén pozitív, illetve negatív mintáktól. Tekintettel arra, hogy a HSP 70-t vizsgálva az egyes mintákban nem észleltünk jól elkülöníthető különbséget a festődés intenzitásában a kontrollként használt erek és a vizsgált tumorsejtek között, ezért HSP 70 esetében ezt a vizsgálatot érdemben nem tudtuk kiértékelni. 25
Statisztikai vizsgálat A kétféle módszerrel végzett HSP expressziós vizsgálat eredményét χ 2 teszttel hasonlítottuk össze. A HSP expresszió százalékos aránya alapján képzett csoportokban a várható túlélést Kaplan-Meier becslési módszerrel számoltuk ki. E csoportok túlélését Cox s F teszttel hasonlítottuk össze. A különböző hősokkfehérjék százalékos expresszióját χ 2 teszttel hasonlítottuk össze a metasztázis jelenlétével, a szövettani alcsoporttal illetve a rezekció mértével. Az HSP expresszió és az életkor összehasonlításához univariancia analízist használtunk. A statisztikai vizsgálatok során a p<0,05 értéket tekintettük a szignifikancia határának. 3. A Magyar Agytumor Protokoll kiértékelése A betegcsoport jellemzői 1998 és 2004 között 41 medulloblastomás és PNET-es beteget kezeltünk a Semmelweis Egyetemen (1. táblázat). A betegek átlagéletkora 8,6 év volt (medián: 7,8 év; szélső értékek: 2 hónap - 20,75 év) a diagnózis időpontjában. 7 beteg volt 3 évnél fiatalabb (17%). A fiú:lány arány 1:1,05. A daganat az esetek 83%-ában infratentorialis és 17%-ában supratentorialis elhelyezkedésű volt. MR-rel kimutatott primer metasztázis 4 esetben volt észlelhető (9,8%). A szövettani diagnózis 34 esetben medulloblastoma és 7 esetben PNET volt. A PNET minden esetben supratentorialis lokalizációjú volt. A daganatok szövettana A szövettani diagnózisokat neuropatológus igazolta (Dr. Hanzély Zoltán). A betegek közül a medulloblastomával könnyen összetéveszthető, nagyon rossz prognózisú, elsősorban 2 éves kor alatt jelentkező atípusos teratoid/rhabdoid tumoros eseteket a rhabdoid sejtek jelenléte alapján zártuk ki. 26
A kezelés menete Mindegyik beteget a Magyar Agytumor Protokoll szerint kezeltük, mely a tumor sebészi eltávolításából, sugárkezelésből és kemoterápiából áll (1.ábra). a. Idegsebészeti beavatkozás Az idegsebészeti beavatkozást az Országos Idegsebészeti Tudományos Intézetben végezték (Dr. Bognár László). Posterior fossa tumorok esetében a műtét hason fekvő helyzetben, suboccipitalis craniotomiából, egy kis méretű vermis bemetszésből történt, a lehetőség szerinti teljes tumor eltávolítás érdekében. Egyes betegeknél shunt beültetés volt szükséges a további kezelés folyamán. A betegség kiterjedésének felmérése posztoperatív koponya és gerinc MR vizsgálattal történt. b. Preirradiációs kemoterápiás kezelés A betegek egységes kemoterápiás kezelésben részesültek. A szövettani diagnózist követően nagy dózisú intravénás MTX kezelést kezdtünk hidrálással, Ca-leucovorin rescueval és kiegészítő intrathecalis triplettel (prednisolon, Ara-C, MTX). c. Sugárkezelés A sugárkezelést az Országos Onkológiai Intézetben végezték (Dr. Kocsis Béla). A craniospinalis besugárzás dózisa teljes tumoreltávolítás és lokalizált betegség esetén 30Gy, metasztázisok jelenléte vagy részleges rezekció esetén 36Gy volt. A craniospinalis irradiációt 20Gy tumorágy-besugárzás követte. A besugárzást linearis akcelerátor 6 vagy 9 MV-os RTG sugárzással végezték napi 1,8-2,0 Gy frakcióban, hetente ötször, hason fekvő helyzetben a fej fixálásával. A háti területre adott sugárkezelés két oldalsó mezőből történt. Az arccsontok védelmére egyedi maszkok készültek vagy multileaf kollimatort alkalmaztak 108. A hátsó scalai tumormező 27
besugárzásához 3D-s konformális besugárzást terveztek CT alapján 109. A 3 évnél fiatalabb betegek nem kaptak besugárzást. d. Posztiradiációs kemoterápiás kezelés A sugárkezelés utáni terápia különböző kemoterápiás blokkok ismételt adásából állt (1.ábra). A kezelés teljes tartama 62 hét volt. Az egyes blokkok adására megfelelő csontvelő- (granulocytaszám>1,0g/l, thrombocytaszám>100g/l, hemoglobin>100g/l), máj- és veseműködés esetén került sor. A blokkok 2-6 hetenként követték egymást. A kezelések során az M (methotrexat + intrathecalis triplet), A (vincristin + cyclophosphamid) és C blokkokkal (vincristin + carmustin) párhuzamosan 3000ml/m2/nap hidrálást alkalmaztunk. Thrombocyta koncentrátumot 20G/l alatt, vörösvértest koncentrátumot 80g/l alatt adtunk. Granulocyta stimuláló faktort (G-CSF) lázas neutropenia esetén alkalmaztunk, amíg a granulocytaszám el nem érte a 2,0G/l szintet. A tumorstátusz felmérését preoperatíven, műtét után, a kezelés során 3 havonta és a kezelés befejezése után félévente, illetve recidíva klinikai gyanúja esetén végeztük. e. A kezelésre adott válasz mérése A kezelésre adott válasz alapján 4 csoportot definiáltunk: teljes remisszió (CR): a daganat nem volt kimutatható képalkotó eljárásokkal; részleges válasz (PR): a tumor valamely átmérője több, mint 25%-kal csökkent, de nem tűnt el teljesen; változatlan állapot (SD): a tumorméret egyik átmérője sem változott több, mint 25%- kal; progresszív betegség (PD): valamely tumorátmérő több, mint 25%-kal növekedett vagy új metasztázisok jelentek meg. Túlélés kiértékelése a. Össztúlélés és statisztikai vizsgálatok 28
A becsült teljes (OS) és progressziómentes (PFS) túlélést Kaplan-Meier módszerrel számoltuk ki 110. Statisztikai összehasonlítást log-rank teszttel végeztünk és p<0,05 értéket tekintettük a szignifikancia határának. b. A betegek túlélésének értékelése klinikai faktorok szerint Az adatokat a klinikai prognosztikai faktorok jelenlétének függvényében (életkor, tumoreltávolítás mértéke, metasztázis jelenléte) is értékeltük. A kiértékeléshez két csoportba osztottuk a betegeket: ún. alacsony rizikó csoport, amelyben az összes vizsgált klinikai faktor kedvező volt (teljes tumoreltávolítás, MRrel nincs kimutatható áttét, a beteg életkora > 3 év) és magas rizikó csoport, ahol valamely (egy vagy több) klinikai faktor kedvezőtlen volt. Életminőség értékelése A betegek életminőségét Lansky/Karnofsky score rendszerrel (maximális érték: 100%) értékeltük a kezelés befejezésekor 111. A kezelés okozta toxicitást a CTC v2.0 rendszerben értékeltük 112. 4. A központi idegrendszeri daganatos érintettséggel járó gyermekkori nemközponti idegrendszeri daganatok incidenciája és klinikuma A vizsgálat során a Semmelweis Egyetem II.sz. Gyermekklinikáján 1989 és 2002 közötti 14 éves időszakban kezelt, nem központi idegrendszeri szolid tumoros gyermekek kórlapjait használtuk fel. A klinikán bármilyen szövettani diagnózisú, 18 év alatti malignus daganatos beteg kezelését végezzük. Jelen vizsgálat során csak azokat a betegeket vettük figyelembe, akiknél primeren nem központi idegrendszeri szolid tumor jelentkezett. Minden olyan szolid tumoros beteget figyelembe vettünk, akinek a tumora direkt terjedéssel vagy hematogén áttétképződéssel a központi idegrendszerben is manifesztálódott, képalkotó vizsgálatokkal (CT vagy MR) igazolható volt és egyidejűleg neurológiai tüneteket is okozott. Direkt ráterjedésnél a 29
dura matert tekintettük a központi idegrendszer határának. Önmagában a neurológiai tünetek (fejfájás, konvulzió, agynyomás fokozódás jelei) jelentkezése még nem volt elegendő a központi idegrendszeri érintettség diagnózisához. A vizsgálat során a betegek életkorát, a primer diagnózis idejét, a központi idegrendszeri érintettség jelentkezéséig eltelt időt, a primer tumor lokalizációját, szövettanát, a központi idegrendszeri érintettség lokalizációját, tüneteit, kezelését és a betegség kimenetelét dolgoztuk fel. A primer tumor kiterjedtségének meghatározásánál az AJCC Cancer Staging Manual beosztását vettük figyelembe 113. A túlélést Kaplan-Meier módszerrel elemeztük, a statisztikai összehasonlítást student t-teszttel végeztük 110. 30
Eredmények 1. A gyermekkori központi idegrendszeri rosszindulatú daganatok incidenciája és relatív előfordulási aránya Az 1989 és 2001 közötti időszakból 844 primeren központi idegrendszeri tumoros beteg adatát gyűjtöttük össze. A vizsgált időszak összesen 3188 malignus betegségben szenvedő gyermeke között, a leukémia (28,4%) és a primeren központi idegrendszeri daganatok (26,5%) előfordulási aránya hasonló volt. E két leggyakoribb malignus betegséget követték a lymphomák (12,3%), a perifériás idegrendszer daganatai (9,4%), lágyrész tumorok (6,3%), vesetumorok (5,0%), csonttumorok (4.8%), csírasejt eredetű tumorok (2,0%), retinoblastoma (2,0%), carcinomák (1,4%), májtumorok (1,3%) és egyéb ritka daganatok (0,6%) (2. ábra). A központi idegrendszeri daganatok leggyakoribb WHO szerinti szövettani alcsoportjai az astrocytoma (35,4%) a medulloblastoma/pnet (23,2%) és az ependymoma (10%) voltak (3. ábra). A fiú:lány arány 1,00:1,22 volt. A 4. ábrán a központi idegrendszeri daganatok korra standardizált incidenciája látható 1989 és 2001 között. Míg 1989-ben ez az incidencia 3,28 beteg/100.000 gyerek volt, addig 2001-re elérte a 3,96 beteg/100.000 gyermek értéket. Az átlagos évi valós növekedés 1,3% volt. A gyermekek korcsoportok szerinti korspecifikus incidenciája a 0-5 év között volt a legmagasabb: 3,93 beteg /100.000 gyermek. Ezt követte az 5-9 éves kor közötti korosztály: 3,63 beteg/100.000 gyermek és végül a 10-14 éves kor közötti korosztály korspecifikus incidenciája: 2,8 beteg/ 100.000 gyermek (5. ábra). 2. Az apoptózist gátló hősokkfehérjék expressziójának aránya medulloblastomában Szövettani vizsgálat 65 medulloblastomás beteget vizsgáltunk (2. táblázat). Ezek közül 32-nek klasszikus, 31-nek desmoplasticus és 2-nek óriássejtes tumora volt. 31
Western blot A Western blot vizsgálattal az ellenanyagok specificitását vizsgáltuk meg. Mindhárom ellenanyag molekulasúlyának megfelelően jelölte a fehérjéket a 3 vizsgált mintában (6. ábra). A felvitt minták közül kettő (1-2.) frissen operált medulloblastomás betegből származott, míg a harmadikat a Daoy stabil medulloblastoma sejtvonalból nyertük. Az észlelt sávok intenzitása öszefüggést mutatott mind a daganatsejtek festődésének intenzitásával, mind az egyes minták pozitív sejtjeinek százalékos arányával. A tumorszövet minták HSP 27, 70 és 90 festődése A minták normál cerebellumból származó részei gyenge háttér festődést, míg a reaktív astrocyták és a Purkinje sejtek intenzív citoplazmatikus festődést mutattak mindhárom vizsgált hősokkfehérje ellenanyaggal. Az erek és az endotél sejtek is intenzív citoplazmatikus festődést mutattak jelezve mindhárom vizsgált HSP jelenlétét (7. ábra). Szövettanilag a klasszikus medulloblastoma képét mutató mintákban nem találtunk semmiféle olyan festődési struktúrát, mely a tumor jellegzetes szerkezeti sajátságaihoz köthető lett volna (8. ábra). Ezzel szemben egyes desmoplasticus minták jellegzetes strukturális festődése volt megfigyelhető. A szövettani vizsgálat esetenként kifejezetten nodularis szerkezetű képet mutatott, melyben a perinodularis területek kifejezett HSP 70 és 90 citoplazmatikus pozitivitását figyelhettük meg, szemben a nodulusokra emlékeztető területek festődési hiányával (9. ábra). Fénymikroszkóppal a HSP 70 és HSP 90 negatív nodularis területeken az apoptotikus testek fokozott jelenlétét figyelhettük meg a perinodularis területeken észleltekhez képest (a megfigyelést nem kvantifikáltuk). A HSP 27 és HSP 90 esetében eltérést észleltünk az egyes minták között a HSP expresszió erősségében is. Ezzel szemben a HSP 70 esetében a pozitív sejtek expressziójának erőssége minden esetben megegyezett az erekével. 32