NOVA Lite TM HEp-2 708100 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás NOVA Lite TM HEp-2 egy indirekt immunfluorescens assay az anti-nuclearis antitestek (ANA) szűrésére és szemikvantitatív meghatározására humán szérumban. Az anti-nucleáris antitestek kimutatása más szerológiai vizsgálatok eredményével és a klinikai adatokkal együtt segíti a szisztémás lupus erythematosus (SLE) és más kötőszöveti vagy rheumatikus betegségek diagnózisának felállítását. A teszt összegzése és magyarázata Az antinucleáris antitestek fogalmommal különböző autoantitesteket jelölnek, amelyek a sejtmag alkotórészeivel reagálnak, ezen belül a nukleinsavakkal (DNA, RNA) valamint számos fehérjével és ribonukleoproteinnel. 1 Ezek az autoantitestek nagy gyakorisággal megtalálhatók a kötőszöveti vagy rheumatikus betegségben, különösképpen a szisztémás lupus erythematosusban szenvedő betegekben. Tapasztalat szerint valamennyi SLE beteg ANA pozitív. Ez a nagy diagnosztikai érzékenység vezetett az ANA teszt beépítéséhez a szisztémás lupus erythematosusnak az American College of Rheumatology egyik albizottsága által 1982-ben átdolgozott klasszifikációs kritériumai közé (Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus). 2 Az ANA vizsgálat az SLE kítűnő szűrő módszere (egy negatív teszt eredmény gyakorlatilag kizárja az aktív SLE diagnózisát 3 ) specifikusnak azonban semmilyen értelemben nem nevezhető. Más kötőszöveti betegségben - mint amilyen a rheumatoid arthritis, scleroderma és a dermatomyositis - szenvedő páciensek gyakran ANA pozitívak, és alacsony ANA titer észlelhető más kóros állapotokban és a normál populációban is. Pozitív ANA eredményt láthatunk súlyos égés után, vírusfertőzések kapcsán, és beszámoltak pozitív eredményekről egészségesekben is, különösen idősebb korban. A specificitás hiánya miatt javasolják minden egyes ANA pozitív minta végpontig történő titrálását, és további vizsgálatát specifikusabb tesztekkel duplaszálú DNS (dsdna) és extrahálható nucleáris antigének (ENA) ellenes autoantitestek kimutatására. Az indirekt immunfluorescencia az ANA vizsgálat referencia módszere. Általánosan használt szubsztrátjai rágcsálókból származó szövetek vékony metszetei, vagy különböző folyamatos sejtvonalak. A szakemberek véleménye megegyezik abban, hogy a sejtvonalak alkalmasabbak, mint a rágcsáló szövetek, mivel ezek a gyorsan osztódó sejtek bizonyos klinikailag lényeges antigéneket nagyobb mennyiségben tartalmaznak, többek között a centromer, SS-A(Ro), Scl-70 és PCNA/Cyclin antigéneket. A szubsztrát típusa mellett három másik faktor lehet kritikus az ANA teszt kivitelezése szempontjából. 1) a lemez előkészítésekor használt fixáló, 2) a fluorescein mennyisége a fehérjéhez képest (F/P ráció) és 3) a konjugátum immunglobulin alosztály specificitása. Egyes fixálók, vagy a velük kialakult kombináció bizonyos sejtmag antigéneket tönkretesznek, és emiatt használatuk kerülendő. Egy konjugátum szenzitivitása és a nem-specifikus háttérfestődés mértéke függ az F/P aránytól, míg a konjugátum betegség-specificitását annak immunglobulin alosztály reaktivitása határozza meg. Szinte valamennyi klinikailag jelentős autoantitest rendelkezik IgG alosztály specifitással, még akkor is, ha IgA és IgM specifikus ANA is jelen van. 4 Ezzel szemben az egészséges véradókban talált ANA általában kizárólag IgM és IgA alosztályba tartozik. 5 Emiatt az IgG specifikus konjugátumok inkább betegség-specifikusak. A NOVA Lite TM ANA teszt készítéséhez kiválasztott szubsztrát optimálisan fixált humán epithelialis sejtvonal (HEp-2) a konjugátum pedig affinitás módszerrel tisztított anti-humán IgG gondosan megválasztott F/P aránnyal. 1
Ezek a reagens paraméterek teszik lehetővé olyan, klinikailag lényeges autoantitestek (köztük az SS-A és Scl-70 ellenes antitestek) detektálását NOVA Lite TM ANA teszttel, amelyek néhány másik forgalomban lévő ANA teszt használata esetén felderítetlenül maradnak. Ezen felül, az IgG konjugátum specificitása kiküszöböli a fiziológiás téves pozitív eredményeket, amelyek a normálisan előforduló, alacsony titerű IgM autoantitesteknek tulajdoníthatóak, és gyakran megtalálhatók egyébként egészséges idősebb egyénekben. A módszer elve Az indirekt immunfluorescens eljárásban a mintákat az antigén szubsztráttal inkubáljuk, majd a feleslegben maradt antitestet mosással eltávolítjuk. Ezután a szubsztrátot specifikus, fluoresceinnel jelölt konjugátummal inkubáljuk, és azután a reagens felesleget ismét lemossuk. Fluorescens mikroszkóppal megtekintve az autoantitest pozitív minták almazöld fluorescenciát mutatnak a sejt vagy a magvak azon területeinek megfelelően, ahol az autoantitest megkötődött. Reagensek 1. HEp-2 (humán epitheliális sejt) lemezek, 12 mérőhely/lemez, szárító betéttel 2. Anti-Humán IgG Konjugátum (kecske), fluoresceinnel jelölve, pufferben, Evans Blue festéket és 0.09% nátrium azidot tartalmaz, 15mL 3. ANA Titratable Endpoint Pattern Control (ANA titrálható végpont mintázatú kontroll), 1 üveg puffer, benne 0.09% nátrium azid és humán szérum antitestek HEp-2 antigének ellen, előhígítva, 0.5mL 4. IFA System Negative Control (IFA Negatív Kontroll), 1 üveg puffer, 0.09% nátrium azidot tartalmaz és nincsenek benne humán szérum antitestek HEp-2 antigének ellen, előhígítva, 0.5mL 5. PBS koncentrátum, 40x-es töménységű, 2000 ml oldat készítésére elegendő. 6. Mounting Medium (rögzítő médium) 0.09% nátrium aziddal, 7 ml 7. Coverslips (fedőlemezek) Veszélyforrások 1. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az ANA titrálható végpont mintázatú kontroll és az IFA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 6 2. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 3. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 4. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Az IFA lemezek nem tökéletes vagy hatástalan mosása magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék- 2
kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a használatban lévő mikroszkóp lámpájának fényereje, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás alapossága és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Idővel az Anti-Humán IgG Konjugátum színe megváltozhat a fény hatására, aminek használat közben ki van téve. Ez a színváltozás azonban az assay működését hátrányosan nem befolyásolja. 7. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A hígított PBS puffer 2-8 C között tartva 4 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 20 12 mérőhelyes HEp-2 szubsztrát lemez 1 15mL FITC Anti-Humán IgG Konjugátum 1 0.5mL ANA Titratable Endpoint Pattern Control (ANA titrálható végpont mintázatú kontroll) 1 0.5mL IFA Negatív Kontroll 2 25mL PBS Koncentrátum (40x es koncentráció) 1 7mL Mounting Medium (rögzítő médium) 1 20 fedőlemez További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 15-1000µL beméréséhez Desztillált vagy ionmentesített víz Összenyomható műanyag flakonok vagy Pasteur pipetták Nedveskamra 1L-es edény (a PBS hígításához) Coplin jar (jól zárható speciális tartály, festéshez) Fluorescens mikroszkóp 495nm-es gerjesztési és 515nm-es emissziós szűrővel 3
Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) 2. A PBS koncentrátum hígítása: FONTOS:Hígítsa a PBS koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a PBS koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja, és alaposan összekeveri. A PBS puffert használja a minták hígítására, és mosópufferként. A hígított puffer 4 hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. A betegek mintáinak hígítása: a. Előszűrés: Hígítsa a betegek mintáit 1:40 arányban a hígított PBS pufferrel (azaz, adjon 50μL szérumot 1.95 ml PBS pufferhez). b. Titrálás: Készítsen tovafutó 2-szeres (vagyis felező) sorozathígítást minden egyes pozitív minta eredeti, szűrés céljára készített hígításából (azaz 1:80, 1:160...1:2560 arányban). A módszer kivitelezése 1. A szubsztrát lemezek előkészítése: Hagyja a lemezeket szobahőmérsékletűre melegedni, mielőtt a tasakból kiveszi. Jelölje meg ceruzával, és helyezze egy alkalmas nedveskamrába. Cseppentsen egy-egy csepp (20-25μL) hígítatlan pozitív és negatív kontrollt az 1-es illetve a 2-es mérőhelyre. A maradék helyekre tegyen egy-egy csepp (20-25μL) hígított beteg-mintát. 2. A lemezek inkubálása: Inkubálja a lemezeket 30 percig nedveskamrában (egy megnedvesített papírtörlő egy zárt műanyag vagy üveg tartály aljára simítva képes fenntartani a megfelelő páratartalmat). Ne engedje a szubsztrátot kiszáradni a teszt kivitelezése közben. 3. A lemezek mosása: Az inkubáció után óvatosan mossa le a szérumot a lemezről hígított PBS pufferrel, összenyomható műanyag flakon, vagy Pasteur pipetta segítségével. Úgy irányítsa a lemezt és a PBS puffer folyadéksugarat, hogy minimális legyen a minták mosással okozott átszennyeződése az egyes mérőhelyek között. Ne irányítsa a folyadéksugarat közvetlenül a szubsztrátra, mert az könnyen megsérülhet. Helyezze a lemezeket további 5 percre hígított PBS pufferbe egy Coplin edényben. 4. A fluorescens konjugátum felvitele: Rázza le a fölösleges PBS puffert a lemezről. Tegye vissza a lemezt a nedveskamrába, és azonnal fedje minden egyes mérőhely tartalmát egyegy csepp fluorescens konjugátummal. Inkubálja a lemezeket újabb 30 percig. 5. A lemezek mosása: Ismételje a 3-ik lépést. 6. Fedés fedőlemezzel: A fedőlemezek elhelyezésének technikája laboratóriumonként változó; de javasoljuk az alábbi eljárást: a. Helyezzen egy fedőlemezt egy papírtörlőre. c. Vigyen fel rögzítő médiumot folyamatos vonalban a fedőlemez alsó szélére. d. Rázza le a PBS felesleget, és érintse a tárgylemez alsó szélét a fedőlemez széléhez. Óvatosan süllyessze a tárgylemezt a fedőlemezre úgy, hogy a rögzítő médium a lemez felső éle felé tudjon folyni, levegőbuborékok képződése vagy csapdába kerülése nélkül. Minőség-ellenőrzés Az ANA titrálható végpont mintázatú kontrollt és az IFA negatív kontrollt fel kell tenni minden egyes lemezre, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -70 C-on történő tárolásával. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az 4
eljárást meg kell ismételni. 1. A hígítatlan ANA titrálható végpont mintázatú kontroll 3+ kell legyen. 2. Az IFA negatív kontrollnak negatív eredményt kell adnia. Az eredmények értékelése Negatív reakció. A mintát akkor tekinthetjük negatívnak, ha a specifikus festődés megegyezik az IFA negatív kontroll festődésével, vagy annál gyengébb. A minták változó mértékű háttérfestődést mutathatnak, ez heterophil antitestek, vagy egyes cytoplasma alkotórészek, például kontraktilis fehérjék ellen irányuló, alacsony koncentrációjú autoantitestek jelenlétének tulajdonítható. Pozitív reakció. A mintát akkor tekinthetjük pozitívnak, ha specifikus festődés figyelhető meg, és ez nagyobb, mint a negatív kontrollban. Határozza meg a fluorescencia mértékét vagy intenzitását a következő kritériumok alapján: 4+ Ragyogó almazöld fluorescencia 3+ Fényes almazöld fluorescencia 2+ Világosan megkülönböztethető pozitív fluorescencia 1+ A leggyengébb specifikus fluorescencia, ami még lehetővé teszi a specifikus nuclearis és/vagy cytoplasma festődés egyértelmű megkülönböztetését a háttérfluorescenciától. A mintázat interpretálása. A sejtmag és a cytoplasma festődésének változatos mintázatai mutatkozhatnak a mintában jelen lévő autoantitestek típusától és relatív mennyiségétől függően. A festődési mintázatok alábbi típusait figyelhetjük meg: Homogén: A mag tömör festődése a nucleolusok látható fedésével, vagy anélkül. Jelen lévő nuclearis antigének: dsdna, ssdna, hisztonok Kapcsolódó betegség: Nagy titer SLE gyanúját kelti; alacsonyabb titerek SLE-re vagy más kötőszöveti betegségekre utalnak. Perifériás: Tömör festődés elsősorban a mag külső régiói körül, a mag közepe felé gyengülő intenzitással. Jelen lévő nuclearis antigének: dsdna, ssdna, DNP, hiszton Kapcsolódó betegség: Nagy titer SLE gyanúját kelti; alacsonyabb titerek SLE-re vagy más kötőszöveti betegségekre utalnak. Pettyezett/foltos: A mag finom vagy szemcsés megjelenésű festődése, általában a nucleolusok fluorescens festődése nélkül. Jelen lévő nuclearis antigének: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B, és más, még nem karakterizált antigén/ antitest rendszerek. Kapcsolódó betegség: Nagy titerek SLE-re (Sm antitest), kevert kötőszöveti betegségre (RNP antitest), sclerodermára (Scl-70 antitest), vagy Sjögren szindróma-sicca komplexre (SS-B antitest) utalnak; alcsony titerek más kötőszöveti betegség gyanúját keltik. Nucleolaris: Nagy, durva foltos festődés a nucleuson belül, szám szerint általában kevesebb, mint 6 sejtenként, esetlegesen előforduló finom pettyezettséggel, vagy anélkül. Jelen lévő nuclearis antigének: 4-6S RNA és más ismeretlen mag-antigének. Kapcsolódó betegség: Nagy titer scleroderma és Sjögren szindróma esetén fordul elő. Centromer: Diszkrét foltos festődési minta. A magban lévő pettyek nagyon jól elkülönülnek, és számuk rendszerint a 46-nak valamilyen többszöröse. Jelen lévő nuclearis antigének: Kromoszóma centromer (kinetochore). Kapcsolódó betegség: Erősen utal CREST szindrómára, a progresszív szisztémás sclerosis (PSS) egyik változatára. CREST a PSS olyan formája, amelyre kifejezett calcinosis és Raynaud jelenség, esophagealis dysmotilitás, és a bőr korlátozott részvétele (gyakran csak az ujjak és az arc), valamint teleangiectasia jellemző. Mitochondrialis: A cytoplasma diszkréten pettyezett, a mag területének relatív megkímélésével. 5
Jelen lévő antigének: Különböző típusú mitochondrialis antigének. Kapcsolódó betegség: Nagy titer primer biliaris cirrhosisra utal. Fontos figyelmeztetni a felhasználót, aki elsősorban a mintázatra támaszkodik, hogy a nucleolaris vagy centromer mintázatok kivételével, amelyek esetében valamennyi antigén jól definiált és a mintázatuk jellegzetes, az antitest specifitásának meghatározása is szükséges. Mivel sok autoantitest és azok kombinációi indukálhatnak homogén vagy pettyezett mintázatot, javasoljuk specifikus autoantitest (mint például dsdna és ENA) utánvizsgálat végzését minden pettyezett vagy homogén mintázatot adó szérumból. A módszer korlátai 1. Nagy titerű ANA kötőszöveti betegségre utal, de nem szabad diagnosztikai értékűnek tekinteni. Az ANA eredményt más szerológiai vizsgálatok eredményével, és a beteg általános klinikai kórtörténetével együtt kell értékelni. 2. Az ANA mintázatok gyakran változnak a minta végpontig történő titrálása közben. Ez a jelenség azzal magyarázható, hogy az alacsonyabb titerű antitestek koncentrációja a teszt érzékenységi küszöbe alá csökken, miközben egyre hígabb mintával dolgozunk. 3. Változatos külső tényezők befolyásolják a teszt érzékenységét, többek között az értékeléshez használt fluorescens mikroszkóp típusa, az izzó ereje és életkora, az alkalmazott nagyítás, a szűrők rendszere és a vizsgálatot végző személy. 4. Ha az 515 nm-re korlátozott szűrő helyett egy szélesebb hullámhossz-sávot átengedő szűrőt használ, a festődésben nagyobb arányban találkozhat műtermékkel 5. A lemezek jelölésére kizárólag ceruzát használjon. Bármilyen más íróeszköz festődési hibát, műterméket okozhat. 6. A lemezek mosására használt coplin tartályoknak bármilyen kis festékmaradványtól mentesnek kell lenniük. A festékmaradványt tartalmazó coplin jar használata festődési műterméket okozhat. 7. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 8. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Várható értékek A NOVA Lite TM HEp-2 teszt használatával, különböző kötőszöveti betegségekben szenvedő páciensek és 200 random véradó mintáit vizsgálták. Az eredmények az alábbiakban láthatók: Páciens csoport Minták száma NOVA Lite TM HEp-2 Pozitívak száma SLE 105 101 Gyógyszer-indukált Lupus 24 24 Rheumatoid Arthritis 40 28 Scleroderma 24 18 Dermatomyositis 14 10 Sjögren Szindróma 14 12 Egészségesek 200 5 6
Hivatkozások 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167-239, 1982. 2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. 3. Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964. 4. Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: 1333-1338, 1966. 5. Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: 215-220, 1976. 6. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, Fourth Edition, 1999 (HHS Pub. #(CDC) 93-8395). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628100HUN May 2007 Revision HUN0 7