TPHA

Átírás

1 TPHA TREPONEMA PALLIDUM ELLENI ANTITESTEK HUMÁN SZÉRUMBAN VAGY PLAZMÁBAN TÖRTÉNŐ KVALITATÍV VAGY SZEMIKVANTITATÍV, PASSZÍV HEMAGGLUTINÁCIÓT ALKALMAZÓ MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ KÉSZLETEK /12

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. FELHASZNÁLÁS A TESZT ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS MAGYARÁZATA AZ ELJÁRÁS MŰKÖDÉSI ELVE REAGENSEK FIGYELMEZTETÉS ÉS ELŐÍRÁSOK MINTÁK ELJÁRÁS A VIZSGÁLAT KORLÁTAI TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK SZAKIRODALMI HIVATKOZÁSOK [HU]

3 1. FELHASZNÁLÁS A TPHA készletek a Treponema pallidum elleni antitestek humán szérumban és plazmában történő kvalitatív és szemikvantitatív meghatározására szolgálnak. A termék véradók szűréséhez, valamint szifiliszgyanús betegek biztosabb diagnosztizálásához használható. 2. A TESZT ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS MAGYARÁZATA A szifilisz krónikus fertőzés, amely elsődleges, másodlagos, harmadlagos és negyedleges stádiumon áthaladva progrediál. Ezek a stádiumok változatos klinikai tüneteket mutatnak: jellemzően először fekély (úgynevezett sanker) jelenik meg, majd kiemelkedő szifiliszes elváltozások alakulnak ki, amit hosszú lappangás követ. A nem kezelt fertőzés kardiovaszkuláris panaszokat és neuroszifiliszt eredményezhet. A fertőzést a Treponema pallidum nevű spirochaeta okozza, rendszerint szexuális érintkezés útján, noha a betegség a fertőzött vér átömlesztése útján is terjedhet. Intrauterin (méhen belüli) fertőzés is előfordulhat. A kórokozót gyakorlatilag nem lehet mesterséges táptalajon tenyészteni, így a fertőzés diagnosztizálása rendszerint a vérben található antitestek kimutatásán alapul; az antitestek a fertőzés után nem sokkal megjelennek és évekig fennmaradhatnak. A szifilisz vizsgálatai négy csoportba sorolhatók: közvetlen mikroszkópos vizsgálat, treponémális antitestek vizsgálata, non-treponémális antitestek és közvetlen antigénvizsgálatok. A hosszú ideig tartó lappangás, valamint a non-treponémális antitesteket meghatározó tesztek specifikusságának hiánya miatt egyre népszerűbbé váltak a specifikusan a Treponema elleni antitesteket vérmintában felismerő szűrési módszerek. A TPHA is ilyen vizsgálat. 3. AZ ELJÁRÁS MŰKÖDÉSI ELVE A TPHA készletek T. pallidum (Nichols törzs) antigénekkel bevont, madár eredetű, tartósított vörösvértesteket alkalmaznak. Ezek az antigének megkötik a beteg szérumában vagy plazmájában jelen levő specifikus antitesteket. A sejtek szuszpendálva vannak egy olyan [HU] 5

4 közegben, amely a nem specifikus reakciókat kiküszöbölő összetevőket tartalmaz. Pozitív reakció esetén kicsapódnak a sejtek, míg negatív reakció esetén leülepedve korong vagy kis gyűrű alakot formálnak. Ezek a készletek elsősorban kvalitatív vizsgálatok végzésére készültek, mindazonáltal az antitestek szintje kétszeres hígítással meghatározható. A kicsapódási mintázat szemrevételezéssel vagy erre alkalmas leolvasóval határozható meg. Adaptálás és különleges eljárások tekintetében kérjük, vegye fel a kapcsolatot az érdekelt gyártóval. 6 [HU]

5 4. REAGENSEK 4.1. Leírás R1 R2 R4 R5 Azonosító a címkén Vizsgálati sejtek Kontrollsejtek Hígítófolyadék Pozitív kontroll Negatív kontroll Leírás Vizsgálati sejtek T. pallidum antigénekkel bevont madárvörösvértestek szarvasmarha eredetű szérumalbumint (BSA) tartalmazó szuszpenziója Kontrollsejtek Madárvörösvértestek BSA-tartalmú szuszpenziója Hígítófolyadék Nyúl szérumot tartalmazó sóoldat Pozitív kontroll T. pallidum elleni antitesteket tartalmazó, foszfátpufferrel hígított humán szérum, amely negatív HBsantigénre, HIV1/2 elleni antitestekre és HCV elleni antitestekre Negatív kontroll Nyúl szérum foszfátpufferben Kiszerelés teszt 500 teszt 2 fiola 7,8 ml 2 fiola 7,8 ml 2 fiola 20 ml 1 fiola 1 ml 1 fiola 1 ml 2 fiola 20 ml 1 fiola 20 ml 1 fiola 125 ml 1 fiola 1 ml 1 fiola 1 ml [HU] 7

6 4.2. Tárolási és kezelési utasítások A készletet +2 8 C közötti hőmérsékleten kell tárolni. A palackokat állítva tárolja. Nem fagyasztható. A készlet +2 8 C-on tárolt alkotórészeit a csomagoláson feltüntetett időpontig lehet felhasználni. Felbontás után a +2 8 C-on tárolt R1, R2,, R4 és R5 reagensek a címkén feltüntetett időpontig használhatók fel, amennyiben nem tartalmaznak szennyezést. 5. FIGYELMEZTETÉS ÉS ELŐÍRÁSOK In vitro diagnosztikai célra használható. Egészségügyi szakember általi felhasználásra Egészségvédelmi és biztonsági előírások: A vizsgálókészletet kizárólag a laboratóriumi eljárásokban képzett és az azokkal összefüggő kockázatokkal tisztában levő személyzet használhatja. Viseljen megfelelő védőruházatot, védőkesztyűt és szem-/arcvédő felszerelést, és az eljárások során tartsa be a helyes laboratóriumi gyakorlat előírásait. A készletben lévő kontrollanyagok emberi szérumból származnak. Ezeket donorszinten vizsgálták, és negatívnak bizonyultak HBs-antigénre, anti-hiv1/2-re és anti-hcv antitestekre. Egyetlen ismert vizsgálati módszer sem zárhatja ki teljes biztonsággal a fertőző ágensek jelenlétét. Ezért az összes emberi vérszármazékot, reagenst és emberi mintát fertőző betegségek átvitelére képes anyagként kell kezelni. Be kell tartani a vérrel terjedő kórokozókra vonatkozó általános óvintézkedéseket a helyi, területi és országos előírásoknak megfelelően. Kiömlő biológiai anyagok: A kiömlő emberi eredetű anyagokat potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A savat nem tartalmazó kiömlött anyagokat azonnal fertőtleníteni kell, beleértve a kiömléssel érintett területet, anyagokat és a szennyezett felületeket vagy eszközöket. Ehhez alkalmas kémiai fertőtlenítőszert kell használni, amellyel hatásosan küszöbölhető ki az érintett minta által hordozott potenciális biológiai kockázat (rendszerint háztartási hipó 1:10 arányú oldata, 70 80%-os etanol- vagy izopropil-alkohol-oldat, valamilyen jodofór (például 0,5%-os Wescodyne Plus) vagy hasonló), majd szárazra kell törölni az érintett területet.

7 A kiömlött savas anyagokat azonnal meg kell kötni (fel kell törölni) vagy semlegesíteni kell, az érintett területet le kell öblíteni vízzel és szárazra kell törölni; a kiömlött anyag abszorbeálására használt anyagokat pedig biológiai kockázatot jelentő hulladékként kell kezelni. Ezt követően a területet az említett kémiai fertőtlenítőszerek valamelyikével kell kezelni. Megjegyzés: Ne tegyen hipótartalmú oldatot az autoklávba! Úgy dobja ki a vizsgálathoz használt összes mintát és anyagot, mintha azok fertőző ágenst tartalmaznának. A laboratóriumi, kémiai vagy biológiailag veszélyes hulladékanyagokat valamennyi helyi, területi és országos irányelv figyelembe vételével kell kezelni és hulladékba helyezni. A biztonsági adatlap elérhető a honlapon Az eljárással kapcsolatos előírások Előkészületek Az eredmények megbízhatósága a helyes laboratóriumi gyakorlat következő eljárásainak helyes alkalmazásától függ: Egy adott vizsgálaton belül ne keverjen vagy társítson egymással különböző lotokból származó reagenseket. Ne használjon lejárt reagenseket. Használat előtt várjon 30 percig, hogy a reagensek szobahőmérsékletre (18 30 C) melegedjenek Feldolgozás Ne változtassa meg a meghatározási eljárást. Minden egyes mintához használjon új adagolóhegyet. 6. MINTÁK A szérum- vagy plazmaminták (EDTA, nátrium-citrát, heparin és ACD) nem tartalmazhatnak vérsejteket vagy nyilvánvaló mikrobiális szennyeződést. Felhasználás előtt +2 8 C-on legfeljebb 7 napig tárolhatók. A hosszabb tárolást igénylő minták -20 C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten fagyaszthatók. Vizsgálat előtt a lefagyasztott mintákat ki kell olvasztani és alaposan össze kell keverni. Ne tegye ki a mintákat 5-nél több fagyasztási-kiolvasztási ciklusnak. A minták 3 óráig tartó, [HU] 9

8 56 C-ra történő melegítése nem befolyásolja az eredményeket. Nem befolyásolja az eredményeket, ha a minta legfeljebb 100 mg/l bilirubint, legfeljebb 36 g/l trigliceridet és legfeljebb 10 g/l hemoglobint tartalmaz. Mindazonáltal nem javasolt erősen lipémiás vagy hemolizált szérum vagy plazma alkalmazása. Ha a mintákat szállítani kell, azokat az etiológiai ágensek szállítására vonatkozó érvényes szabályok szerint kell elcsomagolni és lehetőleg fagyasztva szállítani. 7. ELJÁRÁS MEGJEGYZÉS: A készlet pozitív és negatív kontrolljait (R4 és R5) minden vizsgálattal le kell futtatni A készlet részét nem képező, de szükséges anyagok Desztillált víz Nátrium-hipoklorit (háztartási hipó) és nátriumhidrogénkarbonát. Itatóspapír Egyszer használatos kesztyű Védőszemüveg Egyszer használatos csövek Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták vagy multipipetták 10 μl,, 75 μl és 190 μl térfogat kiméréséhez és adagolásához. Microplate-rázó U-aljú microplate (96 csöves) Kódszám: (5 lemez) Tartály biológiailag veszélyes hulladék számára 7.2. Meghatározási eljárás (manuális technika) Kvalitatív vizsgálat Az U-microplate három csövére van szükség mindegyik mintához. A TPHA 500 készletet (termékazonosító: 72504) nagyszámú minta szűrésére tervezték, és csak kis mennyiségű kontrollsejtet tartalmaz. A készlet tartalma arra elegendő, hogy a mintákat először csak vizsgálati sejtek használatával szűrjék, a kontrollsejteket pedig csak akkor használják fel, ha az első vizsgálat alkalmával pozitív eredményt adó mintáknál meg kell ismételni a vizsgálatot.

9 a. Minták és kontrollok hígítása (1:20) Öntsön 190 μl hígítófolyadékot () egy csőbe. Adjon hozzá 10 μl mintát vagy pozitív (R4), illetve negatív (R5) kontrollt. Keverje össze alaposan az oldatot. b. Vizsgálat Adagoljon hígított kontrollt vagy hígított mintát a hígítóedényből a vizsgálati csőbe. A fiola felrázásával szuszpendálja újra a vizsgálati sejteket (R1) és a kontrollsejteket (R2). Győződjön meg arról, hogy egyenletes a szuszpenzió. Adagoljon 75 μl vizsgálati sejtet (R1) a vizsgálati csőbe és 75 μl kontrollsejtet (R2) a kontrollcsőbe. A végső minta hígítási aránya 1:80. Keverje össze alaposan a csöveket. Végezzen inkubálást szobahőmérsékleten (15 30 C-on), rázkódásmentes felületen legalább 45 percig. Olvassa le az ülepedés mintázatát. Háborítatlanul az agglutinációs mintázatok legalább három óráig stabilak Szemikvantitatív vizsgálat Mindegyik mintához az U-microplate 9 csövére van szükség: egy cső a minta vagy a kontroll hígításához, 8 cső pedig a titráláshoz kell. Megjegyzés: A készlet pozitív és negatív kontrolljait (R4 és R5) mindegyik vizsgálattal le kell futtatni az alább megadott eljárás szerint. a. Minták és kontrollok hígítása (1:20) Öntsön 190 μl hígítófolyadékot () egy csőbe. Adjon hozzá 10 μl mintát vagy negatív (R5), illetve pozitív (R4) kontrollt. Keverje össze alaposan az oldatot. [HU] 11

10 b. Titrálás Hagyja üresen az első csövet, és adjon hígítófolyadékot () a további 7 cső mindegyikébe μl () + 10 μl Minta vagy (R4) vagy (R5) Minta- vagy kontrolloldatok 8 cső a titráláshoz Adagoljon hígított kontrollt vagy mintát az 1. csőbe és a 2. csőbe, majd keverje össze a csövek tartalmát. Ezután végezzen sorozathígítást a csövek során végighaladva, és az utolsó csőből megmaradó felesleges -t öntse ki a hulladékba.

11 μl 25 µl () + hígított 10 μl kontroll Minta vagy (R4) vagy (R5) A felesleges kiöntése Mintavagy kontrolloldatok 8 cső a titráláshoz c. Vizsgálat Óvatosan keverje össze a vizsgálati sejteket (R1) az alapos újraszuszpendálás érdekében. Adagoljon 75 μl vizsgálati sejtet (R1) mindegyik csőbe. A sejtek hozzáadása után a végső mintahígítási tartomány 1:80 1:10240 közötti. Keverje össze alaposan az oldatot μl () + 10 μl minta vagy (R4) vagy (R5) hígított kontroll + 75 μl R1 oldat + 75 μl R1 oldat + 75 μl R1 oldat + 75 μl R1 oldat + 75 μl R1 oldat + 75 μl R1 oldat + 75 μl R1 oldat + 75 μl R1 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 Mintavagy kontrolloldatok 8 cső a titráláshoz Végezzen inkubálást szobahőmérsékleten (15 30 C-on), rázkódásmentes felületen legalább 45 percig. Olvassa le az ülepedés mintázatát. Háborítatlanul az agglutinációs mintázatok legalább három óráig stabilak. A minta titere az agglutinációt mutató legmagasabb hígítási arány reciproka. [HU] 13

12 7.3. Minőség-ellenőrzés A készletben található kontrolloknak helyes eredményt, azaz a negatív kontrollnak (R5) negatív, a pozitív kontrollnak (R4) pedig pozitív eredményt kell adnia. A pozitív kontroll (R4) titrálásakor a végső aránynak 1:640 1:5120 közöttinek kell lennie Az eredmények értelmezése és a vizsgálat validálási feltételei Pozitív Bizonytalan Negatív Pozitív: Erős Vizsgálati sejtek A sejtmintázat teljesen befedi a cső alját. Kontrollsejtek Negatív korong Gyengén pozitív Bizonytalan A sejtmintázat hozzávetőlegesen a cső Negatív korong aljának 1/3-át fedi be. A sejtek olyan mintázatba rendeződnek, amelynek a közepe egyértelműen Negatív korong nyitott. Negatív A sejtek kompakt korongba tömörülnek, amelynek rendszerint apró, áttetsző közepe van. Negatív korong Nem specifikus reakció Pozitív reakció. Pozitív reakció Azok a minták, amelyeknél a vizsgálati sejteket tartalmazó csőben nincs reakció, T. pallidum-ra negatívnak tekintendők. A bizonytalannál kisebb mértékű reaktivitás negatívnak tekintendő. A bizonytalan vagy pozitív eredményt adó mintákat pozitívnak kell tekinteni és a vizsgálati eljárást a fentiek szerint duplázva meg kell ismételni, az egyik sejtcsoporthoz a kontrollsejteket (R2), a másikhoz a

13 vizsgálati sejteket (R1) hozzáadva. Ha a vizsgálati sejteket (R1) tartalmazó csövek legalább egyikének eredménye bizonytalan vagy pozitív, a mintát pozitívnak kell tekinteni T. pallidum-ra. Nem specifikus reakció esetében amennyiben az agglutináció nagyobb a vizsgálati sejteknél (R1), mint a kontrollsejteknél (R2), a mintát pozitívnak kell tekinteni, és a fentiek szerint meg kell ismételni a meghatározást. Ha egy minta agglutinációja a kontrollsejtek esetében (R2) nagyobb, illetve ha egyenlő, a mintát a következő eljárás szerint kell abszorbeálni Nem specifikus reakciók abszorbeálása (Ezt az eljárást akkor kell alkalmazni, ha a teszt- és a kontrollsejteknél egyaránt jelentkezik agglutináció.) 1. Adjon 10 μl mintát 190 μl reszuszpendált kontrollsejthez, keverje össze alaposan, és 30 percig szobahőmérsékleten inkubálja. 2. A sejtek ülepítéséhez végezzen centrifugálást legalább 1500 g-vel 3 percig. 3. A 2. lépésben előállított felülúszó -ét adja hozzá 2 csőhöz. 4. Óvatosan keverje össze a teszt- és a kontrollsejteket az alapos újraszuszpendálás érdekében. Öntsön 75 μl tesztsejtet az 1. csőbe. Öntsön 75 μl kontrollsejtet a 2. csőbe. 5. A csövek tartalmát keverje össze alaposan és inkubálja szobahőmérsékleten legalább 45 percig. 6. A fentiek szerint olvassa le és értelmezze az ülepedési mintákat. 8. A VIZSGÁLAT KORLÁTAI Nem létezik egy olyan vizsgálat vagy meghatározó referenciastandard sem, amely a betegség valamennyi stádiuma esetében alkalmazható lenne. Ennélfogva a szifilisz diagnosztikája elsősorban szerológiai tesztelésen alapul, amelyhez non-treponémális és treponémális módszerek eredményeit egyaránt felhasználják. Egyetlen diagnosztikai vizsgálat sem nyújt teljes bizonyosságot arra vonatkozóan, hogy egy minta nem tartalmaz T. pallidum elleni antitesteket kis mennyiségben, például ha a vizsgálatra a fertőzés [HU] 15

14 nagyon korai stádiumában került sor. Ezért a negatív eredmény sosem zárja ki a szifiliszfertőzésnek való expozíció lehetőségét. Treponema fertőzés után jellemzően az összes Treponema elleni vizsgálat eredménye reaktív marad, ezért ezek nem alkalmazhatók a kezelésre adott válasz értékelésére. Mivel a reaktivitás rendszerint a beteg élete végéig fennmarad, a Treponema elleni vizsgálatok nem alkalmasak a relapszus vagy az ismételt fertőződés meghatározására olyan betegnél, akinél reaktív eredmény alakult ki. Ebben az esetben egyéb próbák alkalmazása javasolt: Szifilisz összes antitest, szifilisz IgM EIA és RPR. 9. TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK 9.1 Precizitásvizsgálat A precizitás vizsgálatát 3 minta (1 negatív, 1 alacsony pozitív és 1 pozitív) 10 replikátumának azonos futtatáson belüli vizsgálatával (ismételhetőség), valamint 2 replikátumának 5 nap alatti, 2 különböző lotot használó, 2 kezelő általi értékelésével (köztes precizitás) végezték. Ismételhetőség: A 3 minta azonos eredményeket adott 10 alkalommal történő ismétlés esetén. Köztes/lotok közötti precizitás: A 3 minta azonos eredményeket adott eltérő körülmények közötti (40 alkalommal történő) vizsgálat esetén. 9.2 Klinikai teljesítmény A TPHA-meghatározás teljesítményét véletlenszerűen kiválasztott véradóktól, kórházban kezelt betegektől, szifiliszes betegektől származó és a T. pallidum fertőzéssel össze nem függő jelzőanyagokra pozitív minták vizsgálatával határozták meg. A vizsgálatokat 2 véradóállomáson és a Bio-Rad vizsgálóhelyén végezték el Specificitás Összesen 5032 véradó prospekíven, 2 különböző helyszínen gyűjtött mintáit tanulmányozták. A minta minden esetben vagy szérum (3626), vagy EDTA K2 (539) vagy lítium-heparinos plazma (867) volt, amelyet kevesebb, mint 7 nappal a mintavétel után teszteltek és a laboratóriumban használt szűrési eljárással hasonlítottak össze.

15 1. táblázat: Véradói populáció Helyszín Szám Reaktív minták kiindulási száma (IR) Ismételt reaktív minták (RR) Specificitás (%) 95% Megbízhat ósági tartomány 1. helyszín ,72% (2512/2519) 99,43% 99,89% 2. helyszín 2513* ,72% (2505/2512) 99,43% 99,89% Összesen (8 pozitív, 30 bizonytalan) 14 (3 pozitív, 11 bizonytalan) 99,72% (5017/5031) 99,53% 99,85% *: egy (valós pozitív) mintát nem vettek figyelembe a számítás során. A vérbank-populáció teljes specificitása 99,72% (5017/5031), 95%-os megbízhatósági tartomány [99,53% 99,85%] mellett. A 14 hamis pozitív minta közül ismétléskor 11 bizonyult bizonytalannak. Egy retrospektív vizsgálatot is végeztek 201 olyan fagyaszott mintán, amelyek egy nemibeteg-gondozó intézet betegeitől vagy beszállítóktól származtak, és amelyeket szifiliszre negatívnak találtak. E minták specificitását 99,5%-nak (200/201) találták 95%-os megbízhatósági tartomány [97,3% 100,0%] mellett Szenzitivitás A szenzitivitási vizsgálatot 435 retrospektív, fagyasztott szérummintán végezték el, amelyek nemibeteg-gondozó intézet laboratóriumából vagy beszállítóktól származó fagyasztott minták voltak. Ezeket a mintákat pozitívként határozták meg a származási helyüktől függően immunvizsgálatok, FTA-vizsgálatok, RPR-/VDRLmeghatározás vagy TPHA-meghatározások során. Először az összes mintát CE-jelöléssel ellátott TPHAmeghatározással, majd a Bio-Rad TPHA 500 eljárással vizsgálták (72504). [HU] 17

16 E populációban a szenzitivitást 100%-nak (435/435) találták 95%-os megbízhatósági tartomány [99,2% 100,0%] mellett. 9.3 Analitikai szenzitivitás Az analitikai szenzitivitást a WHO NIBSC 05/132 jelű nemzetközi szifilisszabványával összehasonlítva vizsgálták. A szemikvantitatív protokoll alkalmazásakor a szenzitivitás 0,05 NE/ml-nek adódott. 9.4 Analitikai specificitás/keresztreaktivitás-vizsgálat A TPHA-eljárással 210 potenciálisan interferáló mintát teszteltek, amelyek között fertőző betegség kiváltására alkalmas kórokozót (citomegalovírus, Epstein Barr-vírus, VZV, rubeolavírus, hepatitisz C-vírus, hepatitisz B-vírus, HIV 1/2, Toxoplasma gondii, Dengue-láz, malária, leptospirózis) tartalmazó minták, terhes és többször szült nőktől származó minták és immunrendszeri rendellenességekkel (autoantitestek (SLE), rheumatoid faktorok) érintett betegektől származó minták voltak. Négy (4) valódi pozitív mintát nem vettek figyelembe a számítások során. Egy mintát ismételten pozitívnak találtak TPHA-vizsgálattal. Az ebben a célpopulációban tapasztalt 99,5%-os specificitás (205/206) hasonló volt a klinikai minták specificitásához. 9.5 Kioltási effektus A lehetséges kioltási effektus létezését 3 magas titerű ( 1:20480) minta különféle hígítási arányú oldatainak vizsgálatával tanulmányozták. A nem hígított és a hígított minták eredményeinek ekvivalenciája a kioltási effektus hiányára utal.

17

18

19 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette Franciaország Tel.: +33 (0) Fax: +33 (0) / [HU] 21