/11 1. FELHASZNÁLÁS

Átírás

1 Platelia Rubella IgM 1 lemez RUBEOLAVÍRUS ELLENI IgM ANTITESTEK MINŐSÉGI KIMUTATÁSA HUMÁN SZÉRUMBÓL VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM-IMMUNOASSAY TECHNIKÁVAL /11 1. FELHASZNÁLÁS A Platelia Rubella IgM egy immunkötéses elven alapuló immunoassay KIT a rubeolavírus elleni IgM antitestek minőségi kimutatására humán szérumban vagy plazmában. 2. KLINIKAI JELENTŐSÉG A rubeola vagy más néven rózsahimlő egy világszerte igen elterjedt vírusfertőzés. A rubeola jellemzően enyhe lefolyású betegség, amely előfordulhat gyermekeknél és felnőtteknél is. Klinikai tünetei a hőemelkedés, fejfájás, torokfájás és test szerte jelentkező bőrkiütések. A terhesség alatt szerzett rubeola azonban sokkal súlyosabb lefolyású, és dokumentáltan halmozott fejlődési rendellenességet okoz, például süketséget, hályogot, szellemi visszamaradottságot és magzatelhalást. Az iskola előtt álló gyerekek oltása jelentősen lecsökkentette a rubeolajárványok előfordulását, de továbbra is szükség van az immunológiai státusz szűrésére, különösen a fogamzóképes nők körében. A rubeola IgG antitest jelenléte a nők vérében a fogamzást megelőzően biztosítékot jelent arra nézve, hogy a magzat védett a terhesség alatt fellépő esetleges rubeolavírus-fertőzéssel szemben. Az oltás hatékonysága szintén meghatározható a szérumban jelen lévő rubeola IgG antitest kimutatásával az immunizálást követően. A rubeolavírus 1962-es izolációját követően a rubeola elleni specifikus antitestek kerültek az érdeklődés középpontjába, a vírus teratogén hatásai miatt. A múltban több módszert is kifejlesztettek a vírus identifikálására, például a szérumneutralizációs, komplementkötéses és immunfluoreszcens vizsgálatokat. Ezek a tesztek azonban vagy túl bonyolultak ahhoz, hogy a laboratóriumi rutinmunka során elvégezhetőek legyenek, vagy nagyon instabil, illetve megbízhatatlan eredményekkel szolgálnak. A hemagglutinációgátlásos technikák segítségével gyorsan diagnosztizálható mind az akut fertőzéses állapot, mind pedig a beteg immunológiai státusza. Engvall és Perlmann írta le az első enzim-immunoassay eljárásokat 1971-ben. Az eljárás kifejlesztése jelentősen javította a specificitást és az érzékenységet számos antigén és antitest kimutatásánál. Több egymást követő, az IgM jelenlétét igazoló szerológiai vizsgálat, az IgG ismételt megjelenése vagy titerének jelentős megemelkedése (duplázódása) minimum háromhetes időközzel levett két mintában a rubeolavírussal való érintkezést igazolja még abban az esetben is, ha a fertőzés klinikai patognomikus tünetei nem jelentkeznek. 3. ALAPELV A Platelia Rubella IgM egy kvalitatív teszt a humán szérumban vagy plazmában lévő rubeolavírus elleni IgM antitestek kimutatására, az IgM szilárd fázison történő megkötéses enzim-immunossay technika segítségével. A szilárd fázis (a mikrolemez mélyedései) antihumán µ-lánc elleni antitestekkel van bevonva. Konjugátumként a rubeola-antigén és a peroxidázzal jelzett monoklonális anti-rubeola antitest keverékét használjuk. A teszt menete: 1. lépés A betegmintákat, kalibrátor oldatokat és kontrollokat 1:21 arányban kell hígítani, majd bemérni a mikrolemez mélyedéseibe. Az egy órán keresztül tartó, 37 C-os inkubálás alatt a mintában jelen lévő IgM antitestek kötődnek a mikrolemez mélyedéseiben megkötött anti-µ antitestekhez. Inkubálás után az IgG-t és az egyéb szérumfehérjéket mosással kell eltávolítani.

2 2. lépés A konjugátumot (rubeola-antigén és peroxidázzal jelzett monoklonális anti-rubeola antitest keveréke) bemérjük a mikrolemez mélyedéseibe. Az újboli egyórás, 37 C-os inkubálás alatt a konjugátum kötődik a mikrolemezen maradt anti-rubeola IgM antitestekhez. A kötetlenül maradó konjugátumot az inkubálás végén mosással kell eltávolítani. 3. lépés Az immunkomplexek (antihumán µ-lánc / anti-rubeola IgM / rubeola-antigén / peroxidázzal jelzett antirubeola monoklonális antitestek) jelenlétét úgy mutatjuk ki, hogy minden mélyedésbe enzimes előhívó oldatot mérünk. 4. lépés Szobahőmérsékleten ( C) történő inkubálás után az enzimreakciót 1 N kénsavoldat hozzáadásával állítjuk le. A spektrofotométerrel, 450/620 nm hullámhosszon mért optikai denzitás arányos a mintában jelen lévő rubeola elleni IgM antitestek mennyiségével. 4. TERMÉKINFORMÁCIÓK A készletben található reagensek mennyisége 96 teszt elvégzéséhez elegendő. A reagensek kizárólag in vitro diagnosztikai célra használhatóak. Címke A reagens leírása Kiszerelés R1 Mikrolemez Mikrolemez (használatra kész): 12 sor, amelyek 8-8 leválasztható mélyedésből állnak, antihumán µ-lánccal bevonva R2 Koncentrált mosóoldat (20x) Koncentrált mosóoldat (20x): TRIS-NaCl puffer (ph 7,4), 2% Tween 20 Tartósítószer: 0,04% ProClin 300 R3 Negatív kontroll Negatív kontroll: A rubeola elleni IgM antitestekre, valamint HBs antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum Tartósítószer: 0,1% ProClin 300 R4 Kalibrátor Kalibrátor: A rubeola elleni IgM antitestekkel reagáló, de HBs antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum Tartósítószer: 0,1% ProClin 300 R5 Pozitív kontroll Pozitív kontroll: A rubeola elleni IgM antitestekkel reagáló, de HBs antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum Tartósítószer: 0,1% ProClin 300 R6a Antigén Rubeola-antigén: Liofilizált rubeola-antigén R6b Konjugátum (101x) Tartósítószer: 0,36% ProClin 300 Konjugátum (101x): Peroxidázzal jelzett anti-rubeola monoklonális rágcsálóantitest Tartósítószer: 0,16% ProClin 300 R7 Hígítószer Minta- és konjugátumhígító (használatra kész): TRIS-NaCl puffer (ph 7,6), bovinszérum albumin, 0,1% Tween 20 és fenolvörös. Tartósítószer: 0,15% ProClin x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 4 x qs. 8,0 ml 1 x 0,4 ml 1 x 80 ml

3 R9 Kromogén TMB Kromogén (használatra kész): 3,3,5,5 -tetrametil-benzidin (< 0,1%), H 2 O 2 (< 1%) R10 Leállító oldat Leállító oldat (használatra kész): 1N kénsavoldat 1 x 28 ml 1 x 28 ml A tárolási feltételeket és a lejárati időt lásd a dobozon. 5. FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK Az eredmények megbízhatósága az alábbi helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) irányelveinek megfelelő betartásától függ: A lejárt reagensek használata tilos! A különböző tételekből származó reagenseket nem szabad összekeverni, illetve egymással kombinálni. MEGJEGYZÉS: A mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű), a kromogén (R9, megjelölés: TMB, türkiz) és a leállító oldat (R10, megjelölés: 1N, piros színű) esetében lehetséges más készletekben lévő reagensek felhasználása is, feltéve hogy ezek a reagensek szigorúan egyenértékűek, és az adott tesztben használt reagensekkel azonos gyártási tételből származnak. MEGJEGYZÉS: Emellett a mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű) megfelelő feloldás után összekeverhető a különböző Bio-Rad reagenskészletekben található 2 másik mosóoldattal (R2, megjelölés: 10x, kék színű vagy 10x, narancsszínű), feltéve hogy egy adott teszt során csak egyféle keveréket használnak fel. A felhasználás előtt várjon 30 percet, hogy a reagensek szobahőmérsékletre ( C) melegedjenek. Gondosan oldja fel vagy hígítsa a reagenseket, elkerülve a szennyeződést. Ne végezze a tesztet reaktív gőzök (sav-, lúg-, aldehidgőzök) vagy por jelenlétében, mivel ezek módosíthatják a konjugátum enzimaktivitását. Használjon alaposan elmosott és ioncserélt vízzel kiöblített üvegeszközöket. Az egyszerhasználatos eszközök használata ajánlott! A mikrolemez átmosása az eljárás kritikus lépése: végezze el a javasolt számú mosási ciklust, és ügyeljen arra, hogy a mélyedések teljesen fel legyenek töltve, majd teljesen ki legyenek ürítve. A nem megfelelő mosás pontatlan eredményekhez vezethet. Ne hagyja, hogy a mikrolemez kiszáradjon az egyes mosási ciklusok vége és a reagens bemérése között. Soha ne használja ugyanazt az edényt a konjugátum és a fejlesztőoldat beméréséhez. A enzimreakció nagyon érzékeny a fémekre vagy fémionokra. Éppen ezért ne engedje, hogy bármilyen fémes elem érintkezzen a konjugátumot vagy a kromogént tartalmazó különböző oldatokkal. A kromogén oldatnak (R9) színtelennek kell lennie. A kék elszíneződés azt jelzi, hogy a reagens a továbbiakban már nem használható! Minden mintához külön pipettahegyet kell használni. Ellenőrizze a pipetták és egyéb eszközök pontosságát és megfelelő működését! Egészségügyi és biztonsági utasítások A reagensek elkészítéséhez használt humán eredetű anyagokat hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag), hepatitis C vírus elleni (anti-hcv) és HIV elleni antitestekre (anti-hiv1 és anti-hiv2) vizsgálták, és negatívnak találták. Mivel nem létezik olyan módszer, amellyel teljes biztonsággal kizárható a fertőző ágensek jelenléte, a humán eredetű reagenseket és betegmintákat potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. Bármely anyagot, beleértve a mosóoldatot is, amely közvetlen érintkezésbe kerül a mintákkal és a humán eredetű anyagokat tartalmazó reagensekkel, potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. A mintákkal és reagensekkel való munka során viseljen egyszerhasználatos védőkesztyűt. Szájjal pipettázni tilos!

4 Ügyeljen arra, hogy a minták, illetve a mintákat tartalmazó oldatok ne folyjanak ki. A kiömlött anyagokat 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni. Ha sav ömlik ki, akkor azt először nátrium-bikarbonáttal semlegesíteni kell, majd 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni, és a területet száraz papírtörlővel feltörölni. A tisztításhoz használt anyagokat a szennyezett maradékok tárolására szolgáló edénybe kell beledobni. A betegmintákat, emberi eredetű anyagokat tartalmazó reagenseket, valamint a szennyezett anyagokat és termékeket kizárólag fertőtlenítés után lehet hulladékba helyezni: - áztatás 5%-os koncentrációjú nátrium-hipoklorit oldatban 30 percig, - vagy autoklávozás 121 C-on minimum 2 órán át. VIGYÁZAT! Ne tegyen nátrium-hipokloritot tartalmazó oldatokat az autoklávba! Ügyeljen arra, hogy a reagensek még a veszélytelennek tekinthető reagensek se kerüljenek a bőrre vagy nyálkahártyára. A kémiai és biológiai maradványokat a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásainak megfelelően kell kezelni és megsemmisíteni. A készletben lévő valamennyi reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célra használható. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: 6. MINTÁK 1. Javasolt típusok: szérum és plazma (EDTA, heparin vagy citrát). 2. A vérminták kezelése, feldolgozása és tárolása során tartsa be az alábbi ajánlásokat: Mindig a vénaszúrással kapcsolatos rutin óvintézkedések betartásával vegye le a vérmintákat. Szérum esetén centrifugálás előtt hagyja, hogy a minták teljesen megalvadjanak. A csöveket mindig tartsa lezárva. Centrifugálás után öntse le a szérumot vagy plazmát az alvadékról vagy a vörösvérsejtekről egy tárolócsőbe, amelyet azután szorosan lezár. A minták +2-8 C-on tárolhatók, ha a vizsgálat 7 napon belül megtörténik. Amennyiben a vizsgálatot nem végzik el 7 napon belül, vagy a mintákat elszállítják, akkor fagyassza le azokat 20 C-ra vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre. Ne használjon olyan mintákat, amelyeket több mint öt alkalommal felolvasztottak. A lefagyasztott, majd felolvasztott mintákat a vizsgálat előtt alaposan össze kell keverni (Vortex). 3. A 90 g/l albumint vagy 100 mg/l konjugálatlan bilirubint, illetve 36 g/l triolein (triglicerid) ekvivalens lipémiás, vagy max. 10 g/l hemoglobintartalmú hemolizált minták az eredményeket nem befolyásolják. 4. A mintákat nem szabad melegíteni. 7. A VIZSGÁLAT MENETE 7.1 A méréshez szükséges, de a készletben nem szereplő anyagok Vortex keverő. 450 nm-es és 620 nm-es szűrőkkel felszerelt mikrolemez-leolvasó (*). Stabilan 37±1 C-ra beállított mikrolemez-inkubátor (*). Automata, félautomata vagy kézi mikrolemezmosó (*). Steril desztillált vagy ioncserélt víz. Egyszerhasználatos védőkesztyű. Védőszemüveg. Papírtörlő. Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták vagy többcsatornás pipetták a µl, 1 ml, 2 ml és 10 ml kiméréséhez. 25 ml-es, 50 ml-es, 100 ml-es és 1000 ml-es mérőhengerek. Nátrium-hipoklorit (fertőtlenítő) és nátrium-bikarbonát. Biológiai hulladéktároló. Eldobható kémcsövek.

5 (*) A javasolt felszerelésekkel kapcsolatos részletese információkért forduljon technikai osztályunkhoz. 7.2 A reagensek feloldása R1: A csomagolás kinyitása előtt hagyja állni 30 percig szobahőmérsékleten ( C). Vegye ki a tartótálcát, a nem szükséges sorokat rögtön tegye vissza a csomagolásba, és ellenőrizze, hogy benne van-e a nedvességmegkötő anyag. Gondosan zárja vissza a csomagolást, és tegye +2-8 Cos helyre. R2: Az R2 mosóoldatot hígítsa desztillált vízzel 1:20 arányban. Például: 50 ml R2 oldat és 950 ml desztillált víz a használatra kész mosóoldat elkészítéséhez. Manuális mosáshoz készítsen 350 ml hígított mosóoldatot egy 12 sorból álló lemezhez. R3, R4, R5: Hígítsa 1:21 arányban hígítószerrel (R7) (például: 300 µl R µl kalibrátor vagy kontroll). R6a: A rubeola-antigén liofilizált. 3 sor méréséhez oldjon fel egy ampulla liofilizált antigént 8 ml hígítószerben (R7). Alaposan keverje össze. Hígítás után az antigénoldatnak (R6a + R7) tökéletesen tisztának kell lennie. R6 (R6a + R6b) Konjugátum-munkaoldat: Mérjen hozzá 80 µl konjugátumot (R6b) minden egyes ampulla feloldott rubeola-antigénhez (hígított R6a). Alaposan keverje össze. A konjugátummunkaoldatot legalább 1 órával a felhasználás előtt fel kell oldani. 7.3 A felbontott és/vagy feloldott reagensek tárolása és eltarthatósága A készletet +2-8 C-on kell tárolni. Ha a készletet +2-8 C-on tartják felbontás előtt, akkor minden alkotórész a készlet külső címkéjén feltüntetett lejárati ideig használható. R1: Felbontás után a sor max. 8 hétig használható, ha +2-8 C-on tárolják az eredeti, gondosan visszazárt csomagolásban (ellenőrizze a nedvességmegkötő anyag meglétét). R2: Hígítás után a mosóoldat C-on 2 hétig tárolható. Felbontást követően a tömény mosóoldat C-on, a szennyeződés kizárásával tárolt körülmények között, a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg a minőségét. R3, R4, R5, R6b, R7: A reagensek felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzik meg minőségüket. R6 (R6a + R6b): Feloldás után a konjugátum-munkaoldat szobahőmérsékleten ( C) 8 órán át, +2-8 C-on pedig 2 hétig stabil. R9: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzi meg minőségét. R10: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg minőségét. 7.4 Eljárás Szigorúan kövesse a mérési eljárást és a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásait. A felhasználás előtt hagyja, hogy a reagensek szobahőmérsékletre ( C) melegedjenek. A letörhető lyukak használata különleges odafigyelést igényel. Használjon kalibrátor oldatokat minden egyes méréshez és a mérési eredmények validálásához. 1. Gondosan tervezze meg a kalibrátor oldatok, kontrollok és a betegminták elhelyezését és beazonosítását a lemezen. 2. Készítse el a hígított mosóoldatot (R2) (lásd a 7.2. részt). 3. Vegye ki a tartótálcát és a sorokat (R1) a védőcsomagolásbóll (lásd a 7.2. részt). 4. Készítse el a konjugátum-munkaoldatot R6 (R6a + R6b) (lásd a 7.2. részt). 5. Hígítsa 1:21 arányban az R3, R4, és R5 kalibrátor oldatokat és kontrollokat, valamint az S1, S2 stb. betegmintákat a hígítószerrel (R7) a megfelelő azonosítóval ellátott csövekben: 300 µl hígítószer (R7) és 15 µl. Homogenizálja a mintákat Vortex keverővel. 6. Szigorúan betartva az alábbi sorrendet, mérjen be µl-t a kalibrátor oldatokból, kontrollokból és a betegmintákból az egyes mályedésekbe:

6 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával, erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását egy 37 ± 1 C-os, termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át (± 5 perc). 8. Az első inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a mélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 9. Rögtön mérjen bele minden mélyedésbe µl konjugátum-munkaoldatot (R6). Az oldatot használat előtt össze kell rázni. 10. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával, erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását egy 37 ± 1 C-os, termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át (± 5 perc). 11. A második inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a máélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 12. Gyorsan mérjen bele minden mélyedésbe µl kromogén oldatot (R9) fénytől védett körülmények között. Hagyja végbemenni a reakciót sötétben, szobahőmérsékleten ( C) 30 ± 5 percig. Ezen inkubálás alatt ne fedje le a lemezt a tapadófóliával. 13. Mérjen be µl leállító oldatot (R10) minden mélyedésbe, leállítva az enzimreakciót. Ezt ugyanolyan sorrendben és sebességgel végezze, mint az előhívó oldat esetében. 14. Gondosan törölje le a lemez alját. A reakció leállításától számított 30 percen belül egy lemezleolvasó segítségével mérje meg az optikai denzitást 450/620 nm-en. A sorokat leolvasás előtt folyamatosan fénytől védve kell tárolni. 15. Az eredmények továbbítása előtt ellenőrizze a mért értékeket, a lemez kiosztási tervét és a mintákat. 8 AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 8.1 A Cut-Off kiszámítása (CO, határérték) A Cut-Off (CO) a Cut-off kontrollok párhuzamosan mért (R4) optikai denzitásának (OD) átlagértéke: CO = átlagos OD R4 8.2 A arány kiszámítása A eredményt aránnyal fejezzük ki, az alábbi képlet segítségével: Mintaarány = -OD/CO 8.3 Minőségellenőrzés Minden egyes mérésnél, mikrolemezenként, használja az összes kalibrátor oldatot és kontrollt és elemezze a kapott eredményeket. A mérés akkor megfelelő, ha kielégíti az alábbi kritériumokat:

7 Optikai denzitás-értékek: - CO 0,300-0,80 x CO < OD R4 1. párh. < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 2. párh. < 1,20 x CO (A cut-off kontroll [R4] egyes párhuzamosainak OD-értéke és a CO-érték közötti eltérés nem lehet nagyobb 20%-nál.) Optikai denzitás-arányok: - Arány R3 (OD R3 / CO) 0,30 - Arány R5 (OD R5 / CO) 1,50 Amennyiben a mérés nem felel meg a felsorolt minőségellenőrzési feltételeknek, meg kell ismételni. 8.4 Az eredmények értelmezése Mintaarány Eredmény Értelmezés Arány < 0,80 Negatív 0,80 arány < 1,00 Kétes Arány 1,00 Pozitív A a rubeola ellen termelődött IgM antitestek jelenléte tekintetében nem reaktív. A kétes a rubeola ellen termelődött IgM antitestek jelenléte tekintetében. Az eredményt meg kell erősíteni egy, az első vizsgálat után három héttel, új mintával elvégzett másik vizsgálattal. A reaktív a rubeola ellen termelődött IgM antitestek jelenléte tekintetében. 8.5 Hibaelhárítási útmutató Az érvénytelen vagy nem reprodukálható reakciókat gyakran az alábbi tényezők okozzák: A mikrolemez nem megfelelő mosása. A negatív minták szennyeződése magas antitest titerű szérummal vagy plazmával. Az előhívó oldat szennyeződése kémiai oxidálószerekkel (pl. fertőtlenítővel, fémionokkal stb.). A leállító oldat szennyeződése. 9 TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK 9.1 Prevalencia Az anti-rubeola IgM antitestek Platelia Rubella IgM (72851) teszttel mért prevalenciáját 347, terhes nőktől levett mintán határoztuk meg. 2 volt pozitív anti-rubeola IgM antitestre. A Platelia Rubella IgM próbával mért prevalencia 0,6%-os volt (2/347). A Platelia Rubella IgM teljesítményjellemzőit 2 egymástól független vizsgáló helyszínen határoztuk meg, összesen 809, terhes nőtől és véradktól levett alapján. Az egyik vizsgáló helyszínen összehasonlító vizsgálatot végeztünk Platelia Rubella IgM TMB (72922) alkalmazásával. A második vizsgáló helyszínen a Platelia Rubella IgM teljesítményét egy másik, kereskedelmi forgalomban lévő EIA-teszttel összehasonlítva értékeltük. 9.2 Összehasonlító vizsgálat (1. vizsgáló helyszín) A Platelia Rubella IgM teljesítményét 399 mintából álló, az alábbiak szerint csoportosított panel vizsgálatával értékeltük: 172, véradóktól származó szérum 151, terhes nőktől származó szérum 76 szérum kereskedelmi forgalomban lévő anti-rubeola IgM pozitív panelből

8 Platelia Rubella IgM TMB (72922) Platelia Rubella IgM (72851) Negatív Kétes Pozitív Összesen Negatív Kétes Pozitív Összesen Összes egyezés: 396/399 99,25% [IC 95% = 97,82 99,84%] Relatív specificitás: 319/321 99,38%* [IC 95% = 97,77 99,92%] Relatív érzékenység: 77/78 98,72% [IC 95% = 93,06 99,97%]. * A kétes eredményeket pozitívnak tekintettük. [IC 95%] = 95%-os konfidencia-intervallum. Emellett 60 olyan szérumot vizsgáltunk a két készlettel, amelyet hét (két különböző oltóanyaggal történő) oltás utáni kontroll vizsgálaton vettünk le: az anti-rubeola IgM megjelenése mindkét készlet esetében ugyanazt a sémát követte. 9.3 Teljesítményjellemzők (2. vizsgáló helyszín) A Platelia Rubella IgM teljesítményét 350 mintából álló panel vizsgálatával értékeltük, melyből: éves vagy fiatalabb gyermektől származott (27 lány és 20 fiú), 299 felnőttektől származott (298 nő terhes vagy nemrégiben szült és 1 férfi), 1 szérum a francia országos minőségellenőrző vizsgálatból származott. Az eredményeket a referenciaként használt, kereskedelmi forgalomban lévő EIA-teszttel kapott eredményekkel hasonlítottuk össze. Másik EIA-teszt Platelia Rubella IgM (72851) Negatív Kétes Pozitív Összesen Negatív Kétes Pozitív Összesen Relatív specificitás: 344/345 99,71%* [IC 95% = 98,40 99,99%] * A kétes eredményeket pozitívnak tekintettük. [IC 95%] = 95%-os konfidencia-intervallum. Az 5 pozitív szérum közül: a 4 egyező pozitív mintát ugyanattól a személytől vettük le különböző időpontokban, a pozitív ellentmondó szérum esetében egy harmadik, kereskedelmi forgalomban lévő EIA-teszt igazolta a pozitivitást, és az eredmény megegyezett a 4 hónappal az oltás után vett eredményével. 9.4 Keresztreakciók 212 mintából (164 olyan mintából, amely pozitív volt CMV-re, toxoplazmózisra, EBV-re, HSV-re, VZV-re, mumpszra, bárányhimlőre és HIV-re, valamint 48 olyan mintából, amely pozitív volt reumatoid faktorra, autoantitestre és heterofil antitestre, valamint mielomamintából) álló panellel végeztünk vizsgálatot Platelia Rubella IgM-mel (72851) és Platelia Rubella IgM TMB-vel (72922). E minták közül 1 rubeola IgM volt ellentmondóan pozitív, és 6 reumatoid faktort tartalmazó volt pozitív vagy kétséges mindkét módszerrel. E 6 esetében más, kereskedelmi forgalomban lévő EIA-tesztek megerősítették a negatív eredményt.

9 9.5 Pontosság Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség): A mérésen belüli ismételhetőség meghatározásához egy negatív és három pozitív mintát teszteltünk 30 alkalommal egyazon mérésen belül. Minden mintánál meghatároztuk az arányt (-OD/CO). Az egyes mintákhoz tartozó átlagos arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség) Negatív Gyengén pozitív Pozitív Erősen pozitív N = 30 Arány (-OD/CO) Átlag 0,07 1,73 2,51 4,06 SD 0,002 0,03 0,06 0,11 %CV 2,7% 1,8% 2,5% 2,7% Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság): A mérések közötti reprodukálhatóság meghatározásához négy mintát (egy negatív és három pozitív) teszteltünk két-két párhuzamossal, naponta 2-2 mérést elvégezve 20 napon át. Minden mintánál meghatároztuk az arányt (-OD/CO). Az egyes mintákhoz tartozó átlagos arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság) Negatív Gyengén pozitív Pozitív Erősen pozitív N = 80 Arány (-OD/CO) Átlag 0,04 1,19 2,24 3,60 SD 0,005 0,03 0,06 0,10 %CV 12,7% 2,8% 2,6% 2,8% 10 AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A rubeolafertőzés kizárólag a klinikai és a biológiai adatok együttes mérlegelése alapján diagnosztizálható. Egyetlen anti-rubeola IgM antitesttiter-mérés eredménye nem elegendő a nemrégiben kialakult rubeolavírusfertőzés diagnózisának felállításához. A fertőzés korai szakaszában kizárólag az összes, beteggel kapcsolatos információ, így a klinikai és biológiai adatok birtokában diagnosztizálható (az anti-rubeola IgG antitestek mennyiségének jelentős növekedése 2 párhuzamosban vizsgált szérumból, 3 hét után új mintából megismételt vizsgálattal; jelentős mennyiségű anti-rubeola IgM jelenléte; igazoltan alacsony IgG-aviditás). Az anti-rubeola IgM antitestek jelenléte nem elegendő bizonyíték a nemrégiben kialakult fertőzés igazolására, mert az IgM a fertőzés után még több hónapig, sőt akár évekig is jelen lehet a vérben. Az IgM kimutatása után el kell végezni az anti-rubeola IgG mennyiségi meghatározását, valamint az anti-rubeola antitestképződés kontrollvizsgálatát legalább még egyszer, három hét elteltével egy új mintán. Amennyiben a nemrégiben kialakult elsődleges fertőzés során a mintát túl korán vizsgálják, elképzelhető, hogy még nem lesz jelen anti-rubeola IgM antitest. Fertőzés gyanúja esetén három hét elteltével új mintát kell venni, és az IgM-vizsgálatot újra el kell végezni. A reumatoid faktor jelenlétére pozitív minták hamis pozitív eredményt produkálhatnak.

10 11 GYÁRTÓI MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az előállított reagensek minőségügyi rendszerünk előírásainak megfelelően készültek a nyersanyagok bevételezésétől kezdve a végtermék forgalomba kerüléséig. Minden egyes tétel minőségellenőrző vizsgálatokon esett át, és kizárólag a meghatározott jóváhagyási feltételeknek való megfelelés után kerül piacra. Az egyes tételek előállítása és ellenőrzése során készült jegyzőkönyveket a Bio-Rad őrzi. 12 IRODALOM 1. COOPER, L.Z., BUIMOVICI-KLEIN, E : Rubella. In Virology: Edited by Fields, B.N., et al. New York, New York: Raven Press. 2. DORSETT, P.H., MILLER, D.C., GREEN, K., BYRD, F : Structure and function of the Rubella virus proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 150-S FORSGREN, M : Standardization of techniques and reagents for the study of Rubella antibody. Rev. Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 129-S KALKKINEN, N., OKER-BLOM, C., AND PETTERSSON, R.F : Three genes code for Rubella virus structural proteins El. E2a, E2b, and C. J. Gen. Virol, 65: LUCAS, G., et al. April 17-20, : Serological diagnosis of IgG immunoglobulins ant-rubella by immunoenzymatic assay in a commercially available kit. Nice: 4th European Congress of Clinical Microbiology. 308/PP MAURIN, J : Le virus de la rubéole. Bulletin de l Institut Pasteur 1969, 67, Virologie médicale, chap. 34, Flammarion Médecine Sciences. 7. NCCLS Document I/LA6-T Tentative Guideline December 1992 : Evaluation and Performance Criteria for Multiple Component Test and Product intended for the Detection and Quantitation of Rubella IgG Test Products. 8. PETTERSSON, R., et al : Molecular and antigenic characteristics and synthesis of Rubella virus structural proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 140-S WOLINSKY J.S. : Rubella. In Virology, 1990, 2nd Ed Edited by Fields, B.N., and al. New York: Raven Press, Ltd.

11

12 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)