Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 lemez lemez

Átírás

1 Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 lemez lemez SZŰRŐVIZSGÁLATI TESZTKÉSZLET HIV-1 ÉS HIV-2 ELLENANYAGOK KIMUTATÁSÁRA SZÉRUMBÓL VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM-IMMUNASSAY MÓDSZERREL /01 1

2 TARTALOM 1- KLINIKAI JELENTŐSÉG 2- A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ALAPELVE 3- A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ÖSSZETEVŐI 4- TÁROLÁSI KÖRÜLMÉNYEK - SZAVATOSSÁGI IDŐ 5- SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK 6- MINTAVÉTEL ÉS MINTÁK KEZELÉSE 7- KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK 8- A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE 9- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ 10- AJÁNLÁSOK 11- SZÁMÍTÁSOK ÉS AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 12- A MINTA ÉS A KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE 13- TELJESÍTMÉNY 14- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI 15- HIVATKOZÁSOK 2

3 1 - KLINIKAI JELENTŐSÉG A szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS) vírus okozta fertőző betegség, amelyre az immunrendszer erősen lecsökkent működése jellemző. Két különböző típusú, a Lentivírusok csoportjába tartozó vírust izoláltak az AIDS-ben vagy annak előstádiumában szenvedő betegek fehérvérsejt jéből. Az elsőt, amelyet HIV-1-nek neveztek el, először Franciaországban majd az Egyesült Államokban izolálták. A másodikat, HIV-2-nek nevezünk, két Afrikában élő betegből izolálták, és később ez bizonyult egy új, nyugat-afrikai AIDS-góc kórokozójának. A HIV vírus törzseinek genetikai változékonyságáról szerzett ismereteink minden altípus GAG, POL és ENV génjeinek szekvenálásából származnak. A HIV-1 vírusok 2 csoportba sorolhatók: a 9 altípust (A-tól I-ig) tartalmazó M csoportba, és az O csoportba. A HIV-2 vírusok körébe 5 altípus tartozik. A különböző altípusok földrajzi eloszlását ma már jól ismerjük. Egyes HIV-1 variánsok GAG és POL génjeinek homológiája csak 70%-os a főcsoportéval, az ENV gének átfedése pedig mindössze 50% -os. Ezek a különbségek magyarázhatják, hogy a fertőzést egyes betegekben miért nem sikerül diagnosztizálni. A különféle HIV-2 izolátumok a SIV simian vírussal minden fehérjecsoportban közös antigénekkel rendelkeznek (a burokfehérjéknél és a magfehérjéknél az eltérés 30%-os), de a HIV-1 burokfehérjéivel kevesebb, mint 40%-os átfedést mutatnak. A HIV antigének és ellenanyagok megjelennek és kimutathatók a szerokonverzió és a fertőzés különböző stádiumaiban. A Genscreen HIV 1/2 Version 2 teszttel egyszerre mutathatók ki az anti-hiv-1 és anti-hiv-2 ellenanyagok. 2 - A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ALAPELVE A Genscreen HIV-1/2 version 2 a humán szérumban vagy plazmában található, és a HIV-1 és/vagy HIV-2 vírussal kapcsolatos különféle ellenanyagok kimutatására készült kétlépéses szendvicstechnikát alkalmazó enzim-immunassay. A Genscreen HIV-1/2 version 2 tisztított antigénekkel bevont szilárd fázist alkalmaz (az antigének a gp160 és a p25, a HIV-1 rekombináns fehérjéi, és egy, a HIV-2 burokfehérjéjének antigéndeterminánsát utánzó peptid), és egy antigén-peroxidáz konjugátot (a HIV-1 és HIV-2 burkát alkotó glikoproteinek antigéndeterminánsát utánzó peptideket és nukleokapszid rekombináns fehérjét). A vizsgálat a következő reakciólépésekből áll: 1. A vizsgálandó szérummintákat és kontroll szérumokat bepipettázzuk a mikrolemez tesztlyukaiba. Ha van a mintában HIV-1 és/vagy HIV-2 antitest, akkor az hozzákötődik a szilárd fázishoz rögzített antigénekhez. A minta bemérését színváltozás jelzi. A szín bíborból kékre vált (SDP = Sample Deposition Proof). 2. Ezután peroxidázzal jelölt, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigéneket mérünk be. Ezek a betegmintából származó, és a szilárd fázishoz kötött IgG-hez, IgM-hez vagy IgA-hoz kapcsolódnak. 3. A komplexekhez kapcsolt enzim jelenlétét a szabadon maradt konjugát eltávolítása után a szubsztráttal történő inkubálással mutatjuk ki. 4. A reakciót leállítjuk, és az abszorbanciát spektrofotométerrel leolvassuk, 450/ nm hullámhosszon. A mért abszorbancia alapján meghatározhatjuk a HIV-1 és/vagy HIV-2 antitest jelenlétét a mintában. 3

4 3 - A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ÖSSZETEVŐI Minden reagens kizárólag in vitro laboratóriumi célokra használható fel. Címke R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Cut-off control R5 Positive control R6 Sample diluent R7a Conjugate R7b Conjugate diluent R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Reagens Mikrolemez 12 db 8-8 tesztlyukat tartalmazó csík, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigénnel bevonva. Tömény mosóoldat (20X) Tris NaCl puffer ph 7,4 Tartósítószer: 0,04% ProClin 300 Negatív kontroll szérum (humán) HIV-1 és HIV-2 antitestekre, HCV antitestre és HBs Ag-ra negatív humán szérum. Tartósítószer: 0,1% nátrium-azidot tartalmaz Cut-off kontroll szérum (humán) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószer: 0,1% nátrium-azidot tartalmaz Pozitív kontroll szérum (humán) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószer: 0,1% nátrium-azidot tartalmaz Mintahígító Borjú szérum oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal, ProClin 300 és színes indikátorral) Konjugát Liofilizált, peroxidázzal jelölt, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigének. Konjugát hígító Sovány tejből készült oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal és ProClin 300) Peroxidáz szubsztrát puffer 0,015% hidrogén-peroxidot és 4% dimetilszulfoxidot (DMSO) tartalmazó, ph 4,0 nátrium-citrát és nátrium-acetát oldat. Kromogén Tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó oldat. Leállító oldat 1 N kénsav oldat. Csomagolás lemez 70 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 14 ml q.s. ad 12,5 ml 12,5 ml 60 ml 5 ml 28 ml 5 lemez 235 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 2 üveg 2 x 10 ml 2 üveg q.s. ad 2 x 30 ml 2 üveg 2 x 30 ml 2 üveg 2 x 60 ml 2 üveg 2 x 5 ml 3 üveg 3 x 28 ml 4

5 4 - TÁROLÁSI KÖRÜLMÉNYEK SZAVATOSSÁGI IDŐ A kitet +2-8 C között kell tárolni. A Genscreen HIV-1/2 Version 2 tesztkitben található minden, ezen a hőmérsékle ten tárolt reagens felhasználható a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig a felnyitás után is, kivéve a speciális eseteket: R1: A vákuumtasak felnyitásat követően a gondosan lezárt, eredeti tasakokban, +2-8 C hőmérsékleten tárolt csíkok 1 hónapig használhatók fel. R2: A C-on tárolt, felhasználáshoz felhígított mosófolyadék 2 hétig felhasználható. A koncentrált mosófolyadék (R2) C-on tárolható. R7a + R7b: Feloldás után a +2-8 C-on tárolt reagensek 4 hétig felhasználhatók. R8 + R9: Feloldás után a szobahőmérsékleten (18-30 C-on), sötétben tárolt reagens 6 órán át felhasználható. 5 - SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK Desztillált víz. Nátrium-hipoklorit (háztartási hypo) és nátrium-bikarbonát. Automata vagy félautomata, állítható vagy fix pipetták vagy többcsatornás pipetták 25, 75, 80 és 200 µl kiméréséhez és adagolásához. 25, 100 és 1000 ml-es osztott mérőhenger. Tartály szennyes hulladék gyűjtéséhez. Termosztáttal vezérelt 37±1 C-os vízfürdő vagy inkubátor (*). Automata, félautomata vagy kézi mikrolemez mosó rendszer (*). Mikrolemez leolvasó 450 nm-es és nm-es szűrővel (*). (Monokróm eljárásnál forduljon a műszaki osztályunkhoz.) Szűrőpapír. (*) A javasolt készülékek tárgyában forduljon irodánkhoz részletes felvilágosításért. 6 - MINTAVÉTEL ÉS MINTÁK KEZELÉSE A vérmintákat a rutineljárás szerint vegyük. A vizsgálatot EDTA-val, heparinnal, citráttal, vagy ACD-alapú véralvadásgátlóval vett hígítatlan szérummal, vagy plazmával végezzük. A lehető leghamarabb válasszuk el a szérumot vagy a plazmát az alvadéktól vagy a vörösvérsejtektől, hogy megelőzzük a hemolízist. Az előrehaladott hemolízis befolyásolhatja a teszt eredményét. A szemmel látható részecskéket tartalmazó mintákat a vizsgálat előtt centrifugálással kell megtisztítani. A folyadékban szuszpendált fibrin részecskék vagy aggregátumok hamis pozitív eredményhez vezethetnek. Ne melegítsük a mintákat. Ha a szűrővizsgálatot 7 napon belül elvégezzük, akkor a minták +2-8 C között tárolhatók. Ennél hosszabb tároláshoz fagyasszuk le -20 C-on. A plazmát gyorsan kell felolvasztani oly módon, hogy 40 C-os vízfürdőbe kell meríteni néhány percre (hogy a fibrin ne csapódjék ki). Lehetőleg ne olvasszuk fel sokszor a mintákat. A háromnál többször felolvasztott mintákat nem szabad felhasználni a vizsgálathoz. Ha a mintákat szállítani kell, akkor a kórokozók szállítására vonatkozó hatályos jogszabályoknak megfelelően kell becsomagolni. NE DOLGOZZUNK FEL ELSZENNYEZŐDÖTT, HIPERLIPÉMIÁS VAGY ERŐSEN HEMOLIZÁLT SZÉRUMOKAT VAGY PLAZ MÁKAT. MEGJEGYZÉS: A legfeljebb 90 g/l albumint, 200 mg/l bilirubint, 36 mg/l-rel egyenértékű lipidet tartalmazó lipémiás, és legfeljebb 20 mg/l hemoglo bint tartalmazó hemolizált minták nem befolyásolják az eredményt. 5

6 7 - KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK Az eredmények minősége nagyrészt a GLP ajánlások betartásától függ. A teszt neve, valamint egyedi azonosítószáma a minden mikrotiter lemez keretének oldalán fel van tüntetve. Az azonosítószám az egyes tesztcsíkokon is feltüntetésre került. Genscreen HIV-1/2 Version 2: egyedi azonosítószáma = 05 Felhasználás előtt mindig ellenőrizzük az egyedi azonosítószámot. Ha az azonosítószám hiányzik, vagy eltér az alkalmazni kívánt tesztétől, akkor a tesztcsíkot nem szabad felhasználni. Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Ne keverjünk össze egymással egy futtatáson belül több különböző gyártási sorozatba tartozó reagenseket. Megjegyzés: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos gyártási számú terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 20X, zöld színű), peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címke felirata: TMB puffer, kék színű), kromo gén (R9, címke felirata: TMB 11X, bíbor színű) és leállító oldat (R10, címke felirata: 1 N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más Bio-Rad gyártmányú termékhez is használhatók. A mosóoldat (R2, címke felirata: 20X, zöld színű) készítésekor továbbá felhasználhatunk különböző Bio-Rad reagens készletekből származó mosófolyadékokat (R2, címke felirata: 10X, kék színű, vagy 10X, narancs színű), ha azokat megfelelően hígítjuk és egy vizsgálatsorozaton belül azonos keveréket használunk. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. Az előhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) rózsaszínűnek kell lennie. Ha a hígítás utáni percekben elszíneződik az oldat, akkor a reagens nem használható, azt ki kell cserélni. Az előhívó oldat elkészítéséhez tiszta egyszerhaszná latos műanyag edényt, vagy olyan üvegedényt használjunk, amelyet előzőleg 1 N sósavval mostunk át és desztillált vízzel alaposan kiöblítettünk, majd megszárítottunk. Ezt az oldatot fénytől védve kell tárolni. Használatba vétel előtt várjunk 10 percet, hogy a reagensek szobahőmérsékletre melegedjenek. Figyelmesen hígítsuk a reagenseket. Ellenőrizzük a pipetták és egyéb berendezések pontosságát és működését. Ne változtassunk az előírásos műveleteken. Mosás: tartsuk be gondosan az utasításokat, hogy a lehető legjobb eredményt kapjuk. Egészségügyi és biztonsági előírások A pozitív és a cut-off kontrollok hővel inaktiváltak. A negatív kontroll készítéséhez felhasznált humán eredetű anyagot bevizsgálták, és negatívnak találták hepatitis B felületi antigénjére (HBs Ag), hepatitis C elleni antitestekre és a humán immunhiányt okozó vírus elleni antitestekre (anti-hiv-1 és anti-hiv-2). A pozitív kontroll és a cut-off szérum készítéséhez felhasznált humán eredetű anyagot bevizsgálták, és negatívnak találták hepatitis B felületi antigénjére (HBs Ag), és hepatitis C elleni antitestekre. Mivel egyetlen ismert módszer sem garantálja tökéletesen, hogy nincsenek fertőző ágensek a reagensekben, ezért azokat, valamint minden betegmintát fertőző betegség terjesztésére képes anyagnak kell tekinteni, és ennek megfelelően kell kezelni. A mintákkal és a humán eredetű reagensekkel közvetlen érintkezésbe került minden eszközt és készüléket, továbbá a mosófolyadékot szennyeződöttnek kell tekinteni, és ennek megfelelően kezelni. A HIV és a HBV inaktiválásának legjobb módszere a legalább 1 órán keresztül tartó, 121 C-on történő autoklávozás. 6

7 NÁTRIUM-HIPOKLORITOT TARTALMAZÓ OLDATOT NE TEGYÜNK AUTOKLÁVBA. Kérésre megküldjük az anyagok munkavédelmi adatlapját. HIV és HB vírusok inaktiválására megfelelő módszer az is, ha az elszennyeződött folyadékokat és felületeket nátrium-hipoklorittal kezeljük úgy, hogy a végső koncentráció 5%-os legyen a fertőtlenítőszerre nézve. Vigyázzunk, hogy a szubsztrát puffer, a kromogén és a leállító oldat ne kerüljön bőrre és a nyálkahártyákra (mérgezést, irritációt és égési sérüléseket okozhat). A vegyszereket a Helyes Laboratóriumi Gyakorlat (GLP) előírásainak megfelelően kell kezelni és kidobni. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE Megjegyzés: felhasználás előtt hagyjuk a reagenseket szobahőmérsékletre ( C) melegedni. R1 reagens: Mikrolemez Mindegyik, 12 csíkot tartalmazó tartókeret lezárt alumínium tasakban található. Vágja el a tasakot ollóval vagy szikével 0.5 vagy 1 centiméterrel a hegesztés fölött. Nyissa ki a tasakot, és vegye ki a keretet. A fel nem használt csíkokat tegye vissza a tasalba. Gondosan zárjuk vissza a tasakot, majd tegye vissza a +2-8 C hőmérsékletű tárolóhelyiségbe. R2 reagens: koncentrált mosófolyadék (20X töménységű) Desztillált vízzel 1:20 arányban hígítva kapjuk a felhasználásra kész mosófolyadékot. Egy 12 tesztcsíkos lemezhez 800 ml-t készítsünk. R3 reagens: negatív kontroll szérum (felhasználásra kész) HIV-1 és HIV-2 antitestekre, HCV antitestre és HBs Ag-ra negatív humán szérum. Tartósítószerként 0,1% nátrium-azidot tartalmaz. R4 reagens: cut-off szérum (felhasználásra kész) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószerként 0,1% nátrium-azidot tartalmaz. R5 reagens: pozitív kontroll szérum (felhasználásra kész) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószerként 0,1% nátrium-azidot tartalmaz. R6 reagens: mintahígító (felhasználásra kész) Borjú szérum oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal, ProClin 300 és színes indikátorral). R7a reagens: liofilizált konjugát Peroxidázzal jelölt, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigének. BSA-t és 0,1% ProClint tartalmaz. Finoman koppantsuk oda az üveg fenekét az asztalra, hogy a gumisapkára feltapadt port eltávolítsuk. Óvatosan vegyük le a gumisapkát, és a konjugát hígító üveg tartalmát öntsük bele a liofilizált konjugát üvegébe. Tegyük vissza a sapkát, hagyjuk 10 percig állni. Időnként finoman rázogassuk és forgassuk át, hogy könnyebben feloldódjék. 7

8 R7b reagens: konjugát hígító Sovány tejből készült oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal és ProClin 300). R8 reagens: szubsztrát puffer 0,015% hidrogén-peroxidot és 4% dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmazó, 4,0 ph-jú citromsav és nátri um-acetát oldat, amely előkészítés nélkül, azonnal felhasználható. R9 reagens: tömény kromogén szubsztrát oldat Tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó oldat. Hígítsuk az oldatot 1:11 arányban a szubsztrát pufferrel (például 1 ml R ml R8). Előkészítés után sötétben tárolva 6 órán át megőrzi minőségét. R10 reagens: leállító oldat Azonnal felhasználható 1 N kénsav oldat. 9 - HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ Szigorúan tartsuk magunkat a javasolt tesztprotokollhoz. Tartsuk be az alábbi GLP ajánlásokat: A teszteredmények érvényességéhez minden egyes sorozathoz használjuk a negatív, a pozitív és a cut-off kontrollt. 1. Gondosan készítsük elő a pipettázási listát a betegmintákra. 2. Készítsük el a hígított mosófolyadékot. 3. Vegyük ki a keretet és a tesztcsíkokat (R1) a védőcsomagolásból. 4. A lemez előmosása nélkül közvetlenül, az alábbi sorrendben mérjük be a reagenseket: 25 µl hígítót minden tesztlyukba 75 µl negatív kontroll szérumot (R3) az A1 tesztlyukba 75 µl cut-off kontroll szérumot (R4) a B1, C1 és D1 tesztlyukba 75 µl pozitív kontroll szérumot (R5) az E1 tesztlyukba 75 µl 1. mintát az F1 tesztlyukba 75 µl 2. mintát a G1 tesztlyukba, stb. Az alkalmazott készüléktől függően a kontrollok elhelyezése és a bemérés sorrendje megváltoztatható. Pipettázás után homogenizáljuk az elegyet 75 µl-es pipettával legalább háromszori felszívással, vagy a mikrolemez rázatásával. Az is lehetséges megoldás, hogy 100 µl, előzőleg 3:4 arányban hígított mintát mérünk be (pl. 150 µl szérum + 50 µl hígító). Megjegyzés: A minta bemérés előrehaladását szemmel is jól láthatjuk ennél a lépésnél: a minta bemérése után a hígító színe bíborból kékbe csap át (l. 12. pont: automatikus ellenőrzés: A MINTA ÉS KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE). 5. Ha lehetséges, fedjük le öntapadó fóliával a mikrolemezt, óvatosan rányomva a fóliát az egész felületre, hogy szorosan lezárjon. 6. Inkubáljuk termosztát vízfürdőn vagy mikrolemez inkubátorban 30± 5 percig 37±1 Con. 7. Vegyük le az öntapadó fóliát, szívjuk föl a tesztlyukakból azok tartalmát és ürítsük ki egy (nátrium-hipokloritot tartalmazó) szennyes gyűjtő tartályba. Mérjünk be minden tesztlyukba legalább 370 µl mosófolyadékot. Hagyjunk legalább 30 másodpercnyi áztatási időt. Megint szívjuk föl a folyadékot. Ezt a műveletsort ismételjük meg még legalább kétszer (vagyis összesen legalább háromszor mossunk). A tesztlyukban visszamaradó térfogat nem érheti el a 10 µl-t (ha szükséges, fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt és így távolítsuk el a folyadékot a tesztlyukakból). 8

9 Ha automatamosót használunk, ugyanerre a műveletsorra állítsuk be (l. 10. pont: ajánlások). 8. Gyorsan mérjünk be 100 µl konjugát oldatot minden tesztlyukba. Az oldatot felhasználás előtt finoman rázzuk fel. Megjegyzés: a konjugát oldat bemérését, amely zöld színű, szabad szemmel is ellenőrizhetjük (l. 12. pont: automatikus ellenőrzés: A MINTA ÉS KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE). 9. Ha lehetséges, fedjük le újabb öntapadó fóliával a mikrolemezt. Inkubáljuk 30±5 percig szobahőmérsékleten. 10. Vegyük le az öntapadó fóliát, szívjuk föl a tesztlyukakból azok tartalmát és mossunk legalább ötször a fentiek szerint. A tesztlyukban visszamaradó térfogat nem érheti el a 10 µl-t (ha szükséges, fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt és így távolítsuk el a folyadékot a tesztlyukakból). 11. Gyorsan mérjünk be 80 µl frissen előkészített színelőhívó oldatot (R8+R9) mindegyik tesztlyukba. Hagyjuk 30 ± 5 percig sötétben állni szobahőmérsékleten (18 30 C), hogy a reakció végbemehessen. Ennél az inkubálási lépésnél ne használjunk öntapadó fóliát. Megjegyzés: a rózsaszín színkódos előhívó oldat bemérését szabad szemmel is ellenőrizhetjük: jól látható különbség van az üres tesztlyuk, és a rózsaszín szubsztráttal feltöltött tesztlyuk színe között (l. 12. pont, automatikus ellenőrzés: A MINTA- ÉS REAGENS BEMÉRÉS SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE). 12. Mérjünk be 100 µl leállító oldatot (R10) minden tesztlyukba. Ugyanabban a sorrendben és adagolási sebességgel dolgoz zunk, mint a szubsztrát oldatnál. Keverjük el az elegyet. Megjegyzés: a színtelen leállító oldat bemérését szabad szemmel is ellenőrizhetjük. Ha már bemértük a leállító oldatot, akkor a szubsztrát rózsaszíne eltűnik (a negatív minták esetében), vagy a korábban már rózsaszínből kékbe váltott szubsztrát oldat színe sárgára változik (a pozitív mintáknál). 13. Óvatosan töröljük le a lemez alját. 450/ nm-en olvassuk le az optikai denzitást egy lemezleolvasó fotométerrel a reakció leállításától számított legalább 4 perc múlva, de legfeljebb 30 percen belül. 14. Az eredmények kiszámítása előtt ellenőrizzük, hogy a leolvasás eredménye egyezik-e a pipettázási sémával AJÁNLÁSOK VIGYÁZAT: A MÉRÉS KIVITELEZÉSE SORÁN ÜGYELJÜNK ARRA, HOGY SZENNYEZŐDÉS NE TÖRTÉNJEN (folyadék kiömlése, stb.). A nem savas kémhatású kiömlött anyagot gondosan takarítsuk fel legalább 5%-os nátrium-hipoklorit oldattal. A savas kémhatású kiömlött folyadékkal szennyezett felületet teljesen szárazra kell törölni. Az elszennyeződött felületet legalább 5%-os nátrium-hipoklorittal kell fertőtleníteni. A tisztításhoz felhasznált anyagokat biológiailag veszélyes hulladék gyűjtésére szolgáló tartályba kell dobni, és a hatályos jogszabályok szerint kell ártalmatlanítani (l 7. pont, biztonsági előírások). SOHASE HASZNÁLJUK UGYANAZT A PALACKOT KONJUGÁT OLDAT ÉS SZÍNELŐHÍVÓ OLDAT ADAGOLÁSÁHOZ. ANNYISZOR MOSSUNK, AMENNYIT A TESZTPROTOKOLL ELŐÍR. BEMÉRÉS ELŐTT ELLENŐRIZZÜK A SZÍNELŐHÍVÓ OLDATOT (szubsztrát puffer és kromogén). Színtelennek kell lennie. 9

10 Ha az előkészítés után néhány percen belül kék színű lesz az oldat, akkor az azt jelentheti, hogy fémionok kerültek bele. Az ilyen reagens nem használható, újat kell készíteni. Javasolt a műanyag palackok és adagoló eszközök, vagy 1 N sósavval előzőleg elmosott, desztillált vízzel alaposan átöblített és megszárított üvegáru használata. Mosás: Pontosan tartsuk be a mosási előírásokat, hogy a lehető legjobb eredményeket kapjuk SZÁMÍTÁSOK ÉS AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE A HIV-1 és/vagy HIV-2 elleni antitestek jelenlétét vagy hiányát a mintában úgy állapítjuk meg, hogy összehasonlítjuk az egyes minták abszorbancia értékét a kiszámított cut-off értékkel. 1. A cut-off kontroll szérum abszorbancia átlagának kiszámítása (ODR4) OD (B1) + OD (C1) + OD (D1) ODR4 = Cut-off érték kiszámítása A cut-off értéket az alábbi arány adja meg: ODR4 C.O. = Az eredmények érvényességének megállapítása A negatív kontroll szérum abszorbanciájának kisebbnek kell lennie a cut-off érték 70%- ánál: ODR3 < 0,7 X C.O. A cut-off kontroll szérum abszorbancia átlagának nagyobbnak kell lennie 0,80-nál: ODR4 > 0,80 További lehetőség: az ODR5/ODR4 arány legyen nagyobb, vagy egyenlő, mint1,3 (ezt a képletet akkor alkalmazzuk, ha az alkalmazott leolvasó berendezés linearitása 3,000 fölött van). 4. Az eredmények kiértékelése A cut-off értéknél kisebb abszorbanciájú mintákat a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel negatívnak kell tekinteni. A cut-off értéknél éppen csak alacsonyabb eredményeket (C.O.-10% < OD < C.O.) azonban körültekintően kell értelmezni (ilyen esetben tanácsos két párhuzamos mintával újabb mérést végezni, ha az alkalmazott rendszer vagy laboratóriumi eljárás lehetővé teszi). A cut-off értéknél nagyobb, vagy azzal egyenlő abszorbanciájú minták a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel első mérésre pozitívnak tekintendők. A végeredmény megállapítása előtt két párhuzamos mintával újabb mérést kell végezni. Ha ismételt vizsgálat után mindkét párhuzamos abszorbancia értéke kisebb a cut-off értéknél, akkor az eredeti minta pozitivitása nem megismételhető, és azt a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel negatívnak kell tekinteni. A nem reprodukálható pozitív eredmény okai a következők lehetnek: nem megfelelő a lemez mosása, keresztszennyeződés történt: a negatív mintát egy magas titerű minta átszennyezte, 10

11 a színelőhívó oldat oxidálószerekkel (hypo, fémionok, stb.) szennyeződött, a leállító oldat elszennyeződött. Ha ismétlés után a két párhuzamos közül az egyik abszorbanciája nagyobb, vagy egyenlő, mint a cut-off érték, akkor az első eredmény reprodukálható, és a mintát pozitívnak kell tekinteni a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel, figyelembe véve a módszer későbbiekben felsorolt korlátait is A MINTA ÉS A KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE A minta bemérésének spektrofotometriás ellenőrzése A mintahígító (R6) és a minták bemérése után spektrofotométerrel, 620 nm-en leolvasva ellenőrizhető, hogy a minta bemérése ténylegesen megtörtént-e: a mintát tartalmazó tesztlyuk optikai denzitása nagyobb, mint 0,150 (ennél kisebb OD a minta elégtelen bemérését jelzi). Konjugát bemérésének ellenőrzése A konjugát (R7a+R7b) bemérése után spektrofotométerrel, 620 nm-en leolvasva ellenőrizhetjük, hogy az oldat bemérése ténylegesen megtörtént-e: a konjugátot tartalmazó tesztlyuk optikai denzitása nagyobb, mint 0,100 (ennél kisebb OD a konjugát elégtelen bemérését jelzi). A színelőhívó oldat bemérésének spektrofotometriás ellenőrzése 490 nm-en automatikusan leolvasva ellenőrizhetjük, hogy a rózsaszín előhívó oldat hogy az oldat bemérése ténylegesen megtörtént-e: a színelőhívó oldatot tartalmazó tesztlyuk optikai denzitása nagyobb, mint 0,100 (ennél kisebb OD az előhívó oldat elégtelen bemérését jelzi) TELJESÍTMÉNY A Genscreen HIV-1/2 Version 2 érzékenységi vizsgálatait AIDS-ben, vagy AIDS-szel kapcsolatos tünetegyüttesben (ARC) szenvedő betegektől származó pozitív mintákon, és a HIV vírussal frissen fertőződött betegektől származó, bevizsgált mintákból álló érzékenységi panelen vizsgálták. A HIV-1-re 100%-os volt az érzékenység. A vizsgálatot 413 AIDS-, vagy ARC-pozitív, Western blottal konfirmált M csoportú HIV-1 mintán, illetve 31 Western blot HIV-1-gyel konfirmált O csoportú HIV-1 mintán végezték. Az O csoportra vonatkozó érzékenységet szintén vizsgálták 4 Western blottal meghatározatlannak konfirmált O csoportú HIV-1 mintán. Az érzékenységet kielégítőnek tekintették: 3 minta bizonyult pozitívnak. A HIV-2-re 100%-os volt az érzékenység. A vizsgálatot összesen 119 Western blottal konfirmált hígított, vagy hígítatlan mintán végezték. Az M csoportú HIV-1re vonatkozó érzékenységet 29 kereskedelmi szerokonverziós panelen (BBI, NABI, Bioclinical partners), és az INTS érzékenységi panelen vizsgálták. Az eredmények megfeleltek a követelményeknek. Az INTS panelből a 45 szerokonverziós, és a 13 szerokonverzió előtti minta pozitív eredményt adott. 25 további friss pozitív mintát (a vérvételtől számítva 1 napon belül) teszteltek és mindegyik pozitívnak bizonyult. Legalább 42 korai szerokonverziós mintát teszteltek a Genscreen HIV-1/2 Version 2 kittel. Véradókon vizsgálva a teszt specificitása 99,98%-osnak adódott, 5025 minta vizsgálatából. 11

12 212-ből 3 esetben kaptak pozitív eredményt különféle betegségekben szenvedő, vagy HIV vírussal összefüggésbe nem hozható állapotú betegeknél (terhes asszonyok, rheumatoid faktor, anti-nuclearis IgG, vagy egyéb vírusfertőzés). A Genscreen HIV-1/2 Version 2 mérési pontosságát 4 minta elemzésével állapították meg: 1 negatív mintát (1. minta), 2 alacsony anti-hiv-1 titerű pozitív mintát (2. és 3. minta) és 1 magas anti-hiv-1 titerű pozitív mintát (4. minta) vizsgáltak. A teszten belüli ismételhetőséget úgy mérték, hogy ezt a négy mintát 30-szor mérték egy és ugyanazon futtatáson belül, a tesztek közötti ismételhetőséget pedig a 4 minta 3-szori, két mikrolemezen történő, két független vizsgálatban, 5 napon keresztül történő mindennapi tesztelésével állapítottuk meg. Az eredményeket az alábbi táblázat foglalja össze: 1. táblázat: teszten belüli ismételhetőség n = minta 2. minta 3. minta 4. minta arányok* átlaga 0,12 3,34 9,05 19,6 standard 0,04 0,45 0,30 0,73 deviáció (SD) CV (%) arány* 31,5% 13,6% 3,3% 3,7% * Arány = OD/CO 2. táblázat: futtatáson belüli ismételhetőség n = minta 2. minta 3. minta 4. minta arányok* átlaga 0,12 3,43 9,27 19,35 standard 0,02 0,41 0,89 1,93 deviáció (SD) CV (%) arány* 19,3% 12,1% 9,65% 10,0% * Arány = OD/CO 14 - AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI A fertőzés első stádiumában nagyon alacsony koncentrációban előforduló ellenanyag nem mutatható ki, vagyis az ekkor kapott negatív eredmény csak azt jelenti, hogy a vizsgált minta nem tartalmaz a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel kimutatható anti-hiv ellenanyagot. Ez az eredmény azonban nem zárja ki annak lehetőségét, hogy a beteg HIV-1/HIV-2 fertőzés kockázatának van kitéve. A HIV-1 (M és O csoport) és a HIV-2 vírus változékonysága miatt nem zárható ki a hamis negatív eredmény előfordulása. Egyetlen ismert vizsgálati módszer sem nyújt teljes biztonságot annak tekintetében, hogy a HIV vírus tényleg nincs jelen. A nagy érzékenységű ELISA technika hamis pozitív eredményeket is produkálhat. A reakció specificitásának igazolásához minden, a Genscreen HIV-1/2 Version 2 értékelési kritériumai szerint pozitív ered ményt megfelelő módszerrel konfirmálni kell (Western blot). A minták felmelegítése befolyásolhatja az eredményt. A minták, a konjugát és a színelőhívó oldat bemérésének színkódos igazolása nem jelenti azt, hogy pontos mennyiség lett bemérve. Csak annyit tudhatunk meg belőle, hogy került minta, konjugát és előhívó oldat a tesztlyukba. A téves eredmények gyakorisága szoros összefüggést mutat az alkalmazott berendezések, eszközök pontosságával (ha a bemérések és a leolvasás összegződő variációs koefficiense túllépi a 10%-ot, akkor szignifikánsan csökken a bemérés ellenőrzésének megbízhatósága). Ha a konjugáttal történő inkubálás utáni mosás nem eléggé hatékony, akkor az előhívó oldat bemérésének automatikus ellenőrzése (a tesztlyuk OD-jének leolvasása 490 nm-en) 0,100 OD fölötti eredményt produkálhat akkor is, ha nem került előhívó oldat a tesztlyukba. Ezt a jelenséget mindazonáltal nem észleltük a 939 vizsgált minta kiértékelésekor. 12

13 15 - HIVATKOZÁSOK 1. BARRE-SINOUSSI F., CHERMANN J.C., REY F. et al Isolation of a T. lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Science, 1983, 220, ALIZON M., SONIGO P., BARRE-SINOUSSI F. et al. Molecular cloning of lymphadenopathy associated virus Nature, 1984, 312, CLAVEL F., GUETARD D., BRUN-VEZINET F. et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 1986, 233, CLAVEL F., GUYADER M., GUETARD D. et al. Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 1986, 324, BRUN-VEZINET F., ROUZIOUX C., BARRE-SIOUSSI F. et al. Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus (LAV) by ELISA, in patients with acquired immunodeficiency syndrome or lymphadenopathy syndrome. Lancet. 1984, June, MATHIESEN T., CHIODI F., BROLIDEN P.A., et al. Analysis of a subclass restricted HIV-1 gp 41 epitope by omission peptides. Immunology, 1989, 67, NORRBY E., BIBERFELD G., JOHNSON PR et al. The chemistry of site directed serology for HIV Infections. AIDS Res Human Retroviruses. 1989, 5, 487/ McKEATING J.A., WILLEY R.L. Structure and fonction of the HIV envelope. AIDS, 1989, 3, S35-S41 9. PASQUALI J.L., KIENY M.P., KOLBE H. et al. Immunogenicity and epitope mapping of a recombinant soluble gp 160 of the human immunodeficiency virus type 1 envelop glycoprotein. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, NEURATH A.R., STRICK N., TAYLOR P. et al Search for eptiope specific antibody responses to human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoproteins signifying resistance to disease development. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, NAIR B.C., FORD G., KALYANARAMAN V.S. et al. Enzyme immunoassay using native envelope glycoprotein (gp 160) for detection of human immunodeficiency virus type 1 antibodies. J. Clin. Microbio. 1994, 32, ZAAIJER H.L., EXEL-OEHLERS P.V., KRAAIJEVELDT T., et al. Early detection of antibodies to HIV-1 by third generation assays. The Lancet, 1992, 340, CONSTANTINE N.T., VAN DER GROEN G., BELSEY E.M. et al Sensitivity of HIV antibody assays determined by seroconversion panels AIDS, 1994, 8, ENGELBRECHT S., DE JAGER G.J., VAN RENSBURG E.J. Evaluation of commercially available assays for antibodies to HIV-1 in serum obtained from south african patients infected with HIV-1 subtypes B, C, and D. J. Med. Viroloogy 1994, 44, COUROUCE A.M. et al. Trousses de dépistage des anticorps anti VIH1 et VIH2. Spectra Biologie, 1994, 6, DONDERO T.J., HU D.J., GEORGE J.R. HIV-1 variants : yet another challenge to public health. The Lancet 1994, 343, SIMON F., LY T.D., BAILLOU-BEAUFILS A., et al Sensitivity of screening kits for anti HIV-1 subtypes O antibodies. AIDS, 1994, 8, JANSSENS W., HEYNDRICKX L. FRANSEN et al. Genetic and phylogenetic analysis of ENV subtypes G and H in Central Africa AIDS Res. Hum. Retrovirus 1994, 10, GAOF., YUE L. ROBERTSON D.L. et al. Genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2 : evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology. J. Virol. 1994, 68,

14 14

15 15

16 16

17 17

18 18