Funkcionális enzimanalitika tömegspektrometriás módszerekkel Szabó Eszter, Takáts Zoltán SE, I. számú Gyermekklinika Anyagcsere Laboratórium MassProm Kft.
Újszülöttkori tömegszűrés hazánkban 3 betegség fotometriás/fluoreszcens szűrése: hipotireózis biotinidáz defektus galaktozémia 2007. október 1-től kiterjesztett szűrés 23 veleszületett anyagcsere betegség beszárított szűrőpapíros vérmintából Összesen 26 anyagcsere betegség Összesen 26 anyagcsere betegség Nyugat-Magyarországi régió: ~57 ezer újszülött évente
Anyagcsere betegségek diagnosztikus lehetőségei Klinikai kép Metabolit kimutatás kis molekulák műszeres analitikai meghatározása sok metabolit egy mérésből nem ad végső diagnózist Enzimaktivitás mérés a szubsztrát és/vagy a termék meghatározása konkrét k gyanú esetén végső diagnózist ad Genetika/mutáció analízis egy betegségnél is akár több mint 1000 mutáció nehezen kivitelezhető végső diagnózist ad
Enzimaktivitás mérés A minta Perifériás vérből gyűjtött mononukleáris sejt (PBMC) Szérum Szárított vércsepp A vizsgálat Enzimassay Szubsztráttal előre átitatott t tt szűrőkártya ű A mérés Szubsztrát fogyás Termék keletkezés
Enzimaktivitás mérés fehérvérsejtből I. 3-Metilkrotonil-CoA karboxiláz hiány (3MCC hiány) Recesszív módon öröklődő betegség MCCC1 és/vagy MCCC2 gének mutációja Leucin metabolizmus zavara Klinikai kép: tünetmentességtől halálig táplálkozási nehézségek, rohamok, hányás, hasmenés, levertség, gyenge izomtónus (hypotonia) Korai diagnózis fontos Kezelés: alacsony fehérjetartalmú étrend, gyógyszeres kezelés
Enzimaktivitás mérés fehérvérsejtből II. 3-Metilkrotonil-CoA karboxiláz hiány (3MCC hiány) 1. Leukocita sejtek izolálása 2. Lizálás Szuszpendálás TRIS-EDTA pufferben Assay mixoldat hozzáadása 3. Inkubálás 4. Reakció leállítása Stop oldat hozzáadása 5. Zavaró komponensek eltávolítása 6. HPLC-MS meghatározás
Enzimaktivitás mérés fehérvérsejtből III. 3-Metilkrotonil-CoA karboxiláz hiány (3MCC hiány) Vizelet-GC-MS 3-hidroxi- izovaleriánsav 3-metilkrotonil CoA 3-hidroxi-izovaleril CoA hidroxi-pentanoil karnitin (C5-OH-karnitin) 3-metilglutakonil CoA Enzimdefektus 3-metil-krotonil-glicin Vizelet- GC-MS beszárított vércsepp ESI-MS/MS
Enzimaktivitás mérés fehérvérsejtből IV. 3-Metilkrotonil-CoA karboxiláz hiány (3MCC hiány) Korábban: radioaktív 14 C-t tartalmazó karbonát beépülését mérték a szubsztrát és termék meghatározása HPLC-UV-vel HPLC-MS paraméterek: C18 oszlop Eluensek: 95 % 100 mm ammónium-formiát és 5 % metanol 90 % metanol és 10 % 100 mm ammónium-formiát Áramlási sebesség: 300 µl/min n Elektrospray ionforrás, negatív ion mód, Q1, NL 3-MCC: m/z 848 80 CoA: m/z 766 80
Enzimaktivitás mérés fehérvérsejtből V. 3-Metilkrotonil-CoA karboxiláz hiány (3MCC hiány) Egészséges minta Pozitív minta TICof -Q1 MI (8 ions): fromsample 1 (1) of Data080828_megegyszer.wiff (Turbo Spray) Max. 4.2e6 cps. TIC of -Q1 MI (8 ions): fromsample 2 (3) of Data080828_megegyszer.wiff (Turbo Spray) Max. 3.6e6 cps. 4.2e6 4.0e6 386 3.8e6 3.6e6 3.4e6 8.67 3.6e6 3.4e6 3.0e6 3-hidroxi-izovaleril-CoA 3.2e6 melléktermék 8.52 3.2e6 3.0e6 2.8e6 2.6e6 3-metilkrotonil-CoA 2.8e6 2.6e6 2.4e6 2.2e6 206 2.0e6 1.8e6 valószínűsíthető: 3-metilglutakonil-CoA 9.68 2.4e6 2.2e6 2.0e6 1.8e6 1.6e6 kiindulási szubsztrát 9.61 1.6e6 1.4e6 7.56 1.4e6 1.2e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 koenzima termék 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 koenzima termék 205 2.0e5 2.53 20e5 2.0e5 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time, min 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time, min
Enzimaktivitás mérése szérumból I. Biotinidáz defektus Autoszómális recesszív módon öröklődő betegség Tünetek: hányás, letargia, hypotonia, ataxia, acidosis, hajhullás, ekcéma, halláscsökkenés Szűrés 1989 óta, 1 : 30.000 000 Újszülöttkori anyagcsereszűrés: kolorimetriás enzimaktivitás mérés Mesterséges szubsztrát: biotinil-paraaminobenzoesav Színreakció: PABA + N-1-naftiletiléndiamin Pozitivitás esetén másodlagos megerősítő vizsgálat szérumból
Enzimaktivitás mérése szérumból II. Biotinidáz defektus 1. Vérvétel géles csőbe Centrifugálás Biotinidáz enzim 2. Szérum Assay mixoldat hozzáadása 3. Inkubálás Stop oldat hozzáadása 4. Reakció leállítása szérum+assay mix 37 C, 1 h 5. Zavaró komponensek eltávolítása 6. HPLC-MS meghatározás
Enzimaktivitás mérése szérumból III. Biotinidáz defektus XIC of +MRM(3 pairs): 138.0/120.0 amu fromsample 8 (900) of Data2011_08_24.wiff (Turbo Spray) Max. 3.5e5 cps. 3.4e5 3.2e5 3.0e5 1.20 p-amino benzoesav LC-MS paraméterek: 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 80e4 8.0e4 6.0e4 p-nitroanilin C18 oszlop eluens: 75 % 10 mm ammóniumacetát (0,1 % CH 3 COOH) 25 % acetonitril áramlási sebesség: 200 µl/min elektrospray ionforrás, pozitív ionmód, MRM PABA: m/z 138 120 p-nitroanilin: m/z 139 65; 92 4.0e4 1.33 2.0e4 0.0 1.53 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Time, min
Enzimaktivitás mérése szárított vércseppből I. Lizoszomális tárolási betegségek kb. 50 ritka öröklődő öklődő anyagcserezavar szfingolipideket, glikoproteineket lebontó enzimek hiánya lebontás, vagy újrahasznosítás helyett termékek feldúsulnak 1:100.000 tünetek nagyon változatosak: fejlődésben elmaradottság, mozgási zavarok, elmezavar, süketség, vakság, megnagyobbodott máj, szívproblémák az enzimaktivitás mérés a leghatékonyabb diagnosztikai módszer terápia: csontvelő átültetés, enzimpótló terápia
Enzimaktivitás mérése szárított vércseppből II. Lizoszomális tárolási betegségek A szárított vércsepp minta: Alternatív mintavétel (vs. teljes vér vagy plazma) Mintavétel: a vércsepp egyenesen szűrőpapírra kerül, tárolás és szállítás csak teljes száradás után Újszülöttkori tömegszűrésben vezették be Alkalmas akár gyógyszerszint z monitorozásra ra (TDM) is Egyszerű extrakció után mérhetőek a komponensek Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérrel itatni! VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve: Gyermek utóneve/i: Születési dátum: Tejtáplálás kezdete: SO ORSZÁM Beküldő intézet kódja: SORSZÁM VONALKÓD Beküldő orvos pecsétszáma: Születési súly: Terhességi hét: Vérvétel dátuma: g Táplálás: Ismételt szűrés: anyatej tápszer parenteralis Transzfúzió időpontja: idősebb>48 h fiatalabb<48 h <32gest. hét transzfúzió Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van): Elérhetőség (telefonszám): Irányítószám: Település: Utca/út és házszám: szűrőpapíros vérminta dried blood sample:dbs lyukasztás géppel
Enzimaktivitás mérése szárított vércseppből III. Lizoszomális tárolási betegségek 5 betegség meghatározása egy mérésből Pompe-kór: α-glukozidáz enzim defektusa izom és idegsejtek károsodása glikogén felhalmozódás a lizoszómában MPS1 (mukopoliszacharidózis): α-iduronidáz enzim defektusa egymáshoz kapcsolódó cukormolekulák, mukopoliszacharidok lebontása károsodik kötőszövet alkotói számos szerv károsodik
Enzimaktivitás mérése szárított vércseppből IV. Lizoszomális tárolási betegségek Fabry-kór: α-galaktozidáz A enzim defektusa egy glikolipid (globotriaozil ceramid vagy GL-3) lebontása a szervezetben nem történik meg felhalmozódik az érfalakban a szív, a vese és az agy nem képes szabályos működésre Krabbe-kór: galaktocerebrozid- béta-galaktozidáz enzim hiánya galaktocerebrozid halmozódik fel az idegrendszer sejtjeiben Gaucher-kór: β-glukocerebrozidáz enzim defektusa Gaucher kór: β glukocerebrozidáz enzim defektusa glukocerebrozidok különböző szervekben történő felhalmozódása lép, máj megnagyobbodása, vérzékenység, lassabb fejlődés
Enzimaktivitás mérése szárított vércseppből V. Lizoszomális tárolási betegségek 1. DBS lyukasztás extrakciós puffer 2. Extrakció assay mix hozzáadása 3. Inkubáció stop oldat hozzáadása 4. Reakció leállítása 5. Folyadék/folyadék extrakció 6. Bepárlás 7. SPE 8. LC/MS/MS meghatározás
Enzimaktivitás mérése szárított vércseppből VI. Lizoszomális tárolási betegségek XIC of +MRM (10 pairs): 454.3/264.3 amu from Sample 7 (cdchigh1) of Data20110202.wiff (Turbo Spray) Max. 1.7e5 cps. LC-MS paraméterek: 2.9e5 2.8e5 2.6e5 eluens: 80 % acetonitril (0,2 % HCOOH) 20 % víz (0,2 % HCOOH) áramlási sebesség: 200 µl/min elektrospray ionforrás, pozitív ionmód, MRM 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 80e4 8.0e4 6.0e4 0.89 4.0e4 2.0e4 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Time, min
Enzimaktivitás mérése előkezelt szűrőkártyából I. Biotinidáz defektus 1. Szubsztrát szárítása szűrőkártyára Figyelem! A karikákat teljesen át kell vérre el itatni! VONALKÓD DNS BANKBA Gyermek családneve: Gyermek utóneve/i: Születési dátum: Tejtáplálás kezdete: SORSZÁM Beküldő intézet kódja: Beküldő orvos pecsétszáma: Születési súly: Terhességi hét: g Táplálás: anyatej tápszer SORSZÁM VONALKÓD Vérvétel dátuma: Ismételt szűrés: parenteralis Transzfúzió időpontja: idősebb>48 h fiatalabb<48 h <32gest. hét transzfúzió Anya családi és utóneve: Gyermek TAJ száma (ha van): Elérhetőség (telefonszám): Irányítószám: Település: Utca/út és házszám: 2. Mintavételezés szűrőkártyára 3. Termék extrakciója 4. HPLC-MS meghatározás Biotinidáz enzim
Enzimaktivitás mérése előkezelt szűrőkártyából II. Biotinidáz defektus gyors egyszerűbb mintaelőkészítés kalibráció: termékkel spike-olt vérminta LC-MS paraméterek: XICof +MRM(3 pairs): 138.0/120.0 amu fromsample 8 (900) of Data2011_08_24.wiff (Turbo Spray) 1.20 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 24e5 2.4e5 p-amino benzoesav Max. 3.5e5 cps. 2.2e5 C18 oszlop 2.0e5 eluens: 1.8e5 75 % 10 mm ammónium-acetát acetát 1.6e5 1.4e5 (0,1 % CH3COOH) 1.2e5 25 % acetonitril p-nitroanilin 1.0e5 áramlási sebesség: 200 µl/min 8.0e4 elektrospray ionforrás, pozitív 6.0e4 1.33 4.0e4 ionmód, MRM 2.0e4 PABA: m/z 138 120 1.53 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 p-nitroanilin: m/z 139 65; 92 Time, min
Enzimaktivitás mérése előkezelt szűrőkártyából III. Biotinidáz defektus Előzetes eredmények: Enzimaktivitás Enzimaktivitás Enzimaktivitás szűrőkártyában, szűrőkártyában / % szérumban / % extrakcióval / % Pozitív kontroll 0-10% 8 6 3 Pozitív kontroll 10-30% 29 31 25 Negatív kontroll 30-100% 90 44 59 További oá tervek: tr módszer kidolgozása további enzimaktivitás mérésekre egy mintából több enzim aktivitásának mérése egyidejűleg pl. májenzimek (GGT, GPT, GOT)
Köszönöm a figyelmet!