Genetikai vizsgálatok módszerei Dr. Gál Anikó galaniko77@gmail.com
Genetikai vizsgálat fogalma A vizsgált egyén DNS állományában (genomjában) történő elkésések kimutatása A genetikai vizsgálatot A humángenetikai adatok védelméről, a humángenetikai vizsgálatok és kutatások, valamint a biobankok működésének szabályairól szóló 2008. évi XXI. törvény alapján minden esetben genetikai tanácsadásnak kell megelőznie
Genetikai vizsgálat céljai 1. Betegség hátterében álló patogén mutációk kimutatása 2. Genetikai rizikófaktorok vizsgálata hajlamosító és védő polimorfizmusok elemzése 3. Farmakogenomikai vizsgálatok 4. Személyazonosítás igazságügyi DNS vizsgálatok 5. Apasági vizsgálatok 6. Prenatális vizsgálat szűrés, ismert mutációk kimutatása 7. Szervezetben lévő vírusok, baktériumok kimutatása 8. Transzplantációs genetika HLA tipizálás
A talált eltérés patogenitásának eldöntése Irodalmi adatok Fenotípus genotípus korreláció vizsgálata Kontroll személyekben történő vizsgálat Funkcionális vizsgálatok RNS, fehérje szinten
Genetikai vizsgálatok főbb csoportosítása Citogenetika Molekuláris genetika Biokémiai genetika
Metabolitok: Biokémiai genetika hosszú szénláncú zsírsavak gázkromatográfiája Fehérje szerkezet: dystrophin Western blot dystrophinopathiak esetében Enzimaktivitás: (protein- és metabolitrendellenességek) foszforiláz aktivitás McArdle betegség alfa glükozidáz - Pompe kór
Citogenetika
A citogenetika feladata Különböző genom- és kromoszómamutációk azonosítása a preimplantációs, preés posztnatális genetikában.
Citogenetikai módszerek Kariotipizálás FISH CGH
Vizsgálati minták Lymphocyta vér Csontvelő Fibroblast Amnionfolyadék
Kromoszómák morfológiája (NOR) heterokromatin eukromatin Kromoszóma azonosítás szempontjai - méret - centromer helyzete - másodlagos befűződés helye - festési mintázat - heterokromatin eloszlása
A számbeli elváltozások leggyakrabban a nemi kromoszómákat érintik (Turner-, Klinefelter-szindróma). A testi sejteket érintő számbeli (Patau-, Edwards-, Downszindróma) kromoszóma elváltozások több szerv rendellenességeihez vezetnek. Szerkezeti kromoszóma rendellenességek: kromoszómaszakasz elvesztése (deléció). kromoszómadarab áthelyeződése egy másik kromoszómára (transzlokáció) Kiegyensúlyozott a letörött nem vész el (más helyen megvan másik kromoszómára rátapad) az adott egyedre nincsen súlyos következményük ivarsejteknél keletkezhetnek olyan ivarsejtek amelyek hiányos genetikai információval járó sejtek Kiegyensúlyozatlan: a letört darab kikerül a rdsz-ből azon lévő gének hiányoznak (több 100 gén hatása is kieshet Kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulása (inverzió).
Kariotípus: Az egyed kromoszómáinak összessége, iil. az egyed kromoszómáinak száma, alak és nagyság szerinti meghatározottsága. A kariotípust az idiogramm segítségével rögzítik. Az eljárás segítségével felismerhetők egyes kromoszóma rendellenességek illetve öröklődő betegségek.
Kromoszóma sávok: G-sávozás: savas-sós Giemsa festés R-sávozás: (reverse) emelt hőmérsékleten történő Giemsa festés C-sávozás: centroméra specifikus festés T-sávozás: teloméra specifikus festés Q-sávozás: quinacrin festés (fluoreszcens mikroszkópban vizsgálható)
Kariotipizálás Phitohaemoglutinin növényi lektin) Go-G1 fázis átvitelét segíti 1-3 napig tenyésztik Colhicin kezelés gátolja az osztódási orsó működését, de a mitózisba lépést nem Hipotonizálás KCL hatására a sejtek megdúzzadnak, kromoszómák elkülönülnek egymástól Fixálás metanol-ecetsav keverék Gimsa festés
Standard karyotípus Bármilyen metafázisos sejteket tartalmazó, osztódni képes sejtpopuláció Általában: lymphocyta (ezek proliferációját könnyű indukálni) egyéb szövetek bőr (fibroblastok) Csontvelő amnion folyadék Chorionboholy szájnyálkahártya
Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) A DNS fragmentumokat fluoreszkáló festékkel jelölünk meg és ezáltal fénymikroszkóppal nem látható kromoszóma részleteket is azonosíthatunk. FISH-el kromoszómák, kromoszómaszegmentek, mint különálló egységek, vagy akár gének tehetők láthatóvá. Lehet Direkt FISH - A fluoreszcensen jelölt Indirekt FISH - reporter molekula kell A módszer használható Interfázisos sejtmagokban (pl. vérkenet, vagy akár 10-100 mikrométer vastagságú szöveti metszet) Kromoszómapreparátumokon (metafázis)
Jellemzői: Nagy érzékenység 100 bázisnyi méret alatti szekvencia is kimutatható Lehetséges több DNS-szekvencia egyidejű kimutatása A kicsiny kromoszóma részletek kiesésével járó ún. mikrodeléciós kórképek (Prader-Willi-, Angelman-, Williams-, DiGeorge-,Miller-Dieker-, Smith-Magenisszindróma) célzott FISH vizsgálattal diagnosztizálhatók. Az ismeretlen eredetű értelmi fogyatékossággal társuló mikrodeléciókat a kromoszóma végdarabjait elemző szubtelomérikus próbákkal lehet kimutatni Tumor specifikus transzlokációk kimutatása
Multikolor FISH (Spektrális kariotipizálás)
Komparatív genomikus hibridizáció (CGH) Egészséges egyénből származó, tárgylemezen fixált, metafázisban lévő kromoszómákat denaturáljuk és etanolban dehidratáljuk A beteg és a referencia DNS 1:1 arányú keverékét szintén denaturáljuk (a DNS ket előzőleg eltérő fluoreszcens festékkel jelölik) Ezt hibridizáltatjuk a normális kromoszómákat tartalmazó preparátumra A nem hibridizált DNS-t eltávolítjuk A kromoszómákat antifase -ban oldott DAPI-val (kék festék, amely a DNS-t specifikusan jelzi és a G-sávozáshoz hasonló mintázatban kötödö molekula: 1,6 diamino-fenil-indol) jelöljük E három eredőjeként kapjuk meg a CGH képet
CGH értéklése Ha citogenetikai eltérés nem található: a két szín egyenlő arányú kombinációját narancssárga fluoreszcenciaként látjuk A fluoreszcencia intenzitás arányából valamennyi kromoszóma anomális feltérképezhető deléció, duplikáció Digitális image analízis: a három fluoreszcencia intenzitást zöld, piros, kék optikai szűrőkkel CCD kamerával rögzítjük. A kromoszómák azonosítása a DAPI sávozott image segítségével automatizált színes kariotípus analizáló programmal történik. Módszer előnye A teljes genom vizsgálható egyetlen hibridizáció során Sejtkultúra, vagy a vizsgálni kívánt sejtekből származó metafázis indukció nem szükséges A korábban nem ismert duplikált vagy deletált DNS szakasz kimutatására is alkalmas
Deléció Duplikáció
Molekuláris biológiai módszerek
PCR alapú technikák VNTR meghatározás PCR-RFLP Multiplex PCR Trinukleotid repeat meghatározások Real-time PCR MLPA Fragment elemzés Szekvenálási metodikák Sanger Piroszekvenálás Újgenerációs szekvenálás GWAS vizsgálatok
PCR (polimeráz láncreakció) DNS megsokszorozása
Elektroforézis _ A töltéssel rendelkező makromolekuláknak (pl. DNS) az a tulajdonsága, hogy elektromos erőtér hatására elmozdulnak. A negatív töltésű DNS a pozitív töltés felé vándorol +
Nested PCR PCR specificitását növeli
Multiplex PCR Egyszerre több primerrel történő PCR vizsgálat Pl. homozigóta exoni deléciók kimutatása (dystrophin)
VNTR vizsgálatok
Trinukleotid repeat kimutatás Huntington kór Spinocerebelláris ataxiák (SCA) Friedreich ataxia Dystonia myotonica Huntington kór CAG repeats 4-es kromoszóma IT 15 gén - huntingtin protein
RFLP (restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) Enzimatikus hasítás
Bioanalyser
Real-time PCR PCR reakció eredménye valós időben követhető PCR-t követően olvadáspont analízis is elvégezhető (olvadáspont arányos a DNS összetétellel GC arány/ és hossz) a fragmensek azonosíthatók SyberGreen interkaláris festék, ha van termék zöld fluoreszcenciát mutat TaqMan próba két hagyományos próba és egy hibridizáló próba a kettő között A PCR reakcióban a hibridizáló primer hozzátapad az egyszálúított DNS-hez Taq poliemeráz 3 >5 exonukleáz aktivitással a hibridizáló primert nukleotidokra bontja A kioltótó enzim (qencer) nem gátolja a fluorokróm működését Nagyon specifikus, könnyen multiplexezhető
TaqMan SNP assay CC C allél C allél CT T allél T allél TT
Génexpresziós változások mérése Bcl-2 Bcl-2 kezelt Bax hypoxia kontroll normoxia Bcl-XL Bcl-XL kezelt Syn1 Bcl-XL kezelt Bcl-2 kezelt kontroll kontroll
Fluoreszcens fragment analízis
MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification Génen belüli nagyobb kópiaszám változások kimutatására használható Egyszerre több gén is vizsgálható
Kontroll PMP22 duplikáció PMP22 deléció
DNS szekvenáló módszerek Sanger szekvenálás Piroszekvenálás Újgenerációs szekvenálás
Sanger szekvenálás
Felhasználás Ismert gének szekvencia analízise Patogén mutációk keresése
Piroszekvenálás DNS másolásakor beépülő nukleotidról leszakad egy pirofoszfát Ezt a luciferáz felvillanása jelzi
Felhasználás Mutációk pontos mozaicizmus rátájának a megadása (pl. tumorokban szomatikus mutációk vizsgálata KRAS 2.exon 12. és 13. kodon) Pontos heteroplazmia arány
Újgenerációs szekvenálás A genomot 50-1000bp közti darabokban lehet szekvenálni Ezt de novo módszerekkel lehet összerakni - min 30 millio fragment Covarage (lefedettség) 1 bp hányszor van előhívva humánnál min 10x-es lefedettség kell
Sanger szekvenálás Újgenerációs Max 1000bp Nagy pontosság Kicsi akapcitás Drága Munka és időigényes Nem multiplexezhető Elektroforetikus elvű Több millió bp egyidejű szekvenálása gyors olcsóbb Jól automatizálható Nincs elektroforetikus elválasztás multiplexezhető
NGS vizsgálatok felhasználhatósága Teljes genom Teljes exom Teljes transzkriptom NGS panelek (enrichment) Célzottan, betegségre specifikus gének egyidejű szekvenálása
NGS szakaszai Könyvtárkészítés A genomot szekvenálható darabokra bontjuk Ismert szekvenciájú oligonukleotidokat mindkét végére hozzáadjuk - egységessen szekvenálható a minta Barcode adható hozzá (megjelöli melyik minta) Klonális amplifikáció 1 fragmentből kb 1 millió Szekvenálás Bioinformatikai kiértékelés
Könyvtárkészítés
Klonális amplifikáció Emúlziós PCR Olajban vízcseppek vannak (mikroreaktorok) amiben minden benne van Fragmentet juttatjuk bele SOLID és Roche Bridge amplifikáció A komplamenter oligok üveglemezen vannak és a ph változás miatt lesz grid képzés Illumina
Szekvenálás Sanger alapú - Illumina Piroszekvenálás alapú SOLID és Roche Proton detektálás - Iontorrent
Blot technikák Western blot fehérje Southern blot - DNS Northern blot - RNS
Fehérje meghatározás Western blot biomolekulák komplexében lévő fehérje kimutatására Ez egy analitikus technológia, a fehérje expressziójának, mérésére Detektálás: autoradiográfiával, rtg filmre Kiértékelés: denzitometrálás Pl. Qantity One Software
Denzitás meghatározás meghatározás Kvantifikálás
Northern blot
Southern blot
GWAS
A fenotípusos jellel (pl. beteg) rendelkező, illetve kontroll populációt genotipizálnak Megkeresik, hogy melyik marker (SNP) gyakorisága különbözött a két populáció között Multifaktoriális jellegek genomikai hátterének tisztázására
Microarray ( génchip ) technológia Nagyságrendekkel emelik az egyidejűleg vizsgálható gének számát Szerkezeti (nukleotidsorrend) és funkcionális (génkifejeződésmrns) információk tömegét képes nyújtani A génchipek (génlapok) rendezetten (microarray), sorokban és oszlopokban több tízezer ismert nukleotidszálat tartalmaznak, ezekhez kapcsolódik a jelzett minta nukleinsav A fluoreszcens festékekkel láthatóvá tett kötődési mintázatot a komputer értékeli, és ismerve a génlapon levő elrendezést, a pozitív/negatív reakció alapján jellemzi a minta genetikai tartalmát Egyszerre több tízezer (akár a teljes genom) gén kifejeződése értékelhető ezzel az eljárással