!HU0000012T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 012 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 72480 (22) A bejelentés napja: 04. 03. 31. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 072480 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 18388 A1 04.. 14. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 18388 B1 07... (1) Int. Cl.: A61K 36/2 (06.01) A61P 11/00 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 087183 PCT/EP 04/034 () Elsõbbségi adatok: 031931 03. 04. 02. DE (72) Feltalálók: Runkel, Frank, Buseck (DE); Engelhard, Karl-Michael, Friedrichsdorf (DE); Engelhard, Georg Maximilian, Kronberg (DE) (73) Jogosult: Engelhard Arzneimittel GmbH & Co. KG, Niederdorfelden (DE) (74) Képviselõ: Schläfer László, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl (7) Kivonat A találmány tárgya eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl egy extrahálószer alkalmazásával, ahol az extraktum ¹hederint tartalmaz, mely eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: a) szárított borostyánlevelek egy mennyiségét aprítják, b) víz hozzáadásával fermentálják, melynek során a C komponenst ¹hederinné alakítják, c) az extrahálószer hozzáadásával extrahálják, és d) az extraktumot adott esetben szárítják. A találmány kiterjed az így elõállított extraktumra, annak alkalmazására és azt tartalmazó gyógyszerkészítményre. HU 003 012 T2 A leírás terjedelme 8 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
A jelen találmány tárgya eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl egy extrahálószer alkalmazásával, ahol a száraz extraktum ¹hederint tartalmaz. A borostyánlevelekbõl elõállított extraktumot manapság sikeresen alkalmazzák elsõsorban légúti betegségek terápiájában, mivel az extraktum spazmolitikus, expektoráló és antiobstruktív hatást mutat. Ezek a hatások elsõsorban a borostyánlevél-extraktum terápiásan fontos hatóanyagaira vezethetõk vissza, amelyek a triterpén-szaponinok osztályába tartoznak. Itt a fõ szaponin a biszdezmozidos C és az abból észterhidrolízissel keletkezõ ¹hederin. További szaponinként a hederagenin mutatható ki. Mivel extraktumok a borostyánlevelekbõl különbözõ eljárásokkal elõállíthatók, ezek az extraktumok gyakran eltérõ hatásfokkal rendelkeznek. Ez abból ered, hogy a hatóanyagok az extraktum elõállításához alkalmazott mindenkori módszertõl függ. A bejelentõ vizsgálatok alapján megállapította, hogy az ¹hederin jelentõs mértékben hozzájárul a bronchospazmolízishez. Megállapítottuk, hogy az ¹hederin a ¹adrenerg receptorok internalizálási folyamatait specifikus módon gátolja. Egy ligandumnak a ¹adrenerg receptorokhoz történõ kötõdésével elõször az adenilátcikláz-rendszer aktiválódik, melynek egyik következménye például, hogy elernyed a bronchiális rendszer simaizomzata. A hatás túlzott mértékû kialakulása ellen hat többek között a membránon található receptorok alulszabályozása a sejtekben bekövetkezõ internalizálás hatására. Ebben az összefüggésben kimutatható, hogy az ¹hederin nem közvetlenül támadja a ¹adrenerg receptort, hanem sokkal inkább a sejtben lejátszódó receptor-ligandum internalizálást gátolja. A receptor-ligandum komplex internalizálásának gátlásával folytatódik az adenilátcikláz-rendszer aktiválása, ami a hörgõkben kiváltja a simaizmok elernyedését (spazmolízis). A C vagy hederageninanyagok azonban az internalizálás folyamatát nem gátolják. Ezért gyógyszerként elsõsorban a nagy mennyiségû ¹hederint tartalmazó extraktumok alkalmazhatók. Száraz extraktumoknak növényi anyagokból történõ elõállítására alkalmas eljárásokat a gyógyszerészet, és elsõsorban a gyógyszer-elõállítás területén sokoldalúan leírtak. Száraz extraktumoknak növényi anyagokból történõ elõállítására alkalmas eljárást ismertet például a DE 1 12 168 A1. Az ott ismertetett eljárással beállítható a lipofil és hidrofil anyagok. Itt a növényi anyagot legalább kétszer extrahálják eltérõ lipofilitással rendelkezõ oldószerekkel, és így az extraktumokat elkülönítve nyerik ki. Az extraktumokat egymástól külön megszárítják, és a kívánt arányban keverik. Így a lipofil és hidrofil anyagok beállítható. Az eljárás alkalmas lehet száraz extraktumnak borostyánból (Hedera helix) történõ elõállítására is. Az ilyen eljárás hátránya azonban az a körülmény, hogy két külön extrahálást kell megvalósítani, és ezért az eljárás összességében nagyon körülményes. 1 2 3 4 0 Emellett a DE 2 223 A1 ismertet egy gyógyszerkészítményt borostyánextraktum alapján, és egy eljárást ennek elõállítására, melynek során aceton és metanol alkalmazásával, illetve 90% hederaszaponin C¹tartalmat mutató borostyánextraktum nyerhetõ. A hederaszaponin C, illetve C ¹hederinné történõ átalakításához, és ezáltal csupán ¹hederint tartalmazó extraktum elõállításához az említett bejelentésben a 90%¹os extraktumot nátrium-hidroxiddal vagy kálium-hidroxiddal elszappanosítják. Az ilyen eljárás hátránya azonban a nagy ráfordítás, amit az olyan további lépések váltanak ki, amelyek a Hederarosid C kinyerése után a, illetve a hederaszaponin ¹hederinné történõ átalakításához szükséges. G. Wulff: Neuere Entwicklungen auf dem Saponingebiet, Deutsche Apotheker Zeitung, 8 (23), 797 808 (1968) azt ismerteti, hogy friss borostyánleveleket aprítva és egy éjszakán keresztül vízben áztatva végül csak ¹hederin található. Ezért azokat az enzimeket teszik felelõssé, amelyek megtalálhatók a friss levelekben. A gyógyszeriparban azonban szárított drogokat alkalmaznak, mivel ezek eltarthatók és jobban kezelhetõk. Enzimatikus aktivitás az ilyen szárított drogokban nem várható. A jelen találmány feladata ezért olyan eljárás kidolgozása, amellyel kevés lépésben és nagy idõráfordítás nélkül extraktum, elsõsorban száraz extraktum nyerhetõ, amelyben az ¹hederin legalábbis erõsen feldúsított mennyiségben fordul elõ. A korábban említett eljárással a találmány alapját képezõ feladat úgy oldható meg, hogy az eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: a) szárított borostyánlevelek egy mennyiségét aprítjuk, b) víz hozzáadásával fermentáljuk, melynek során a C komponenst ¹hederinné alakítjuk, c) az extrahálószer hozzáadásával extraháljuk, és d) az extraktumot adott esetben szárítjuk. A találmány alapját képezõ feladat ily módon teljesen megoldható. A találmány szerinti eljárással ugyanis egy olyan extraktum nyerhetõ, amely hatóanyagként alfa-hederint tartalmaz dúsított formában, illetve melynek elõállítása során a borostyánlevélben eredetileg jelen lévõ C nagy része, vagy adott esetben teljesen ¹hederinné lett átalakítva. A feltalálók saját kísérleteikkel kimutatták, hogy a fermentációs lépéssel a szárított borostyánlevélnél a C közel teljesen ¹hederinné alakítható. Ezért az extrahálás után nincs szükség további lépésekre a kinyert hatóanyag további átalakításához. Sokkal inkább érvényes, hogy a teljes eljárás pont a köztes fermentációs lépés miatt mind az idõráfordítás, mind az alkalmazott anyagok vonatkozásában gazdaságosan megvalósítható, ami egy nagy elõny a technika állása szerint ismert eljárásokhoz képest. A fermentálás jelen esetben az eredeti anyagban jelen lévõ hatóanyag lebontását, illetve más anyaggá 2
történõ átalakítását jelenti egy fermentálóközegnek, például folyadéknak az eredeti anyaghoz történõ hozzáadásával, melynek során adott esetben meghatározott paramétereket, például az idõt és a hõmérsékletet a fermentációs folyamat szempontjából összehangolunk. A feltalálók felismerték, hogy a fermentációs lépéshez különösen elõnyösen alkalmazható a víz. A víz hozzáadásával megindul a C ¹hederinné történõ átalakulásának folyamata. A találmány szerinti eljárással ezáltal egy különösen nagy ¹hederintartalommal rendelkezõ extraktum állítható elõ. A nagy ¹hederintartalmat mutató extraktum elsõsorban a légúti betegségek kezelésénél szükséges, mivel a bejelentõ által végzett kísérletek megállapították, hogy ezért az ¹hederin felelõs. Mint említettük, a borostyánban elõforduló szaponinok közül elsõsorban az ¹hederin felelõs a hörgõkben kifejtett spazmolitikus hatásért. Ezért ez az extraktum a nagy ¹hederintartalmával lényegesen javított hatékonyságot mutat az olyan extraktumokkal szemben, amelyekben viszonylag nagy mennyiségû C található. A gyógyszerkészítmények elõállítása során a szárított drogok elõnye, hogy jobban eltarthatók és jobban kezelhetõk, mint a friss drogok. A szárított gyógynövényeket és gyógynövényrészeket a gyógyszerészet területén érvényes meghatározás értelmében drog néven ismerik. Az ilyen drogként elõforduló gyógynövények felhasználását vagy változatlan formában, vagy aprított formában végzik. Szakember számára meglepõnek minõsül, hogy a szárított borostyánlevélnél, ahogy ezt a gyógyszeriparban alkalmazzák, az ¹hederinné történõ átalakítás csupán víz hozzáadásával elérhetõ. A bevezetõben említett DE 2 223 A1 szerint az elszappanosításhoz alkálifém-hidroxidot kell adagolni a kémiai folyamat kiváltásához. Elõnyös továbbá, ha az a) lépésben a borostyánlevelek aprítását mm, különösen elõnyösen 2 2 mm méretig végezzük. A borostyánleveleknek a megadott méretre történõ aprítása különösen elõnyös a találmány szerint elõállított extraktum ¹hederintartalmának befolyásolása szempontjából. Megállapítottuk, hogy növekvõ részecskemérettel együttesen a hatóanyagok rosszabb extrahálása és fermentálása következik be. A találmány szerinti eljárásnál elõnyös továbbá, ha az extrahálószer alkohol- és vízrészbõl álló elegy. Különösen elõnyös, ha alkoholként C 2 C alkoholt, elsõsorban etanolt alkalmazunk. Az etanol egy jól bevált gyógyszerészeti oldószer, és a gyógyszer-technológia területén kiterjedten alkalmazzák extrahálószerként. Természetesen azonban alkalmazhatók más alkoholok is, például propanol, izopropanol és hasonlók, vagyis minden olyan alkohol, amely víz/alkohol elegy formájában gyógyszerkészítmények elõállításánál extraháláshoz felhasználható. Elõnyös továbbá, ha az extrahálószer víz/alkohol részének aránya (t/t) /90 és 90/ tartományba esik, elsõsorban, ha a víz/alkohol arány 70/. 1 2 3 4 0 A jelen találmány keretei között különbözõ alkohol/víz arányok alkalmasak a találmány szerinti eljárás sikeres megvalósításához. Ennek során különösen elõnyösnek bizonyult az olyan extrahálószer alkalmazása, melynek alkoholrésze %. Elõnyös továbbá, ha a borostyánlevelek aránya az extrahálószerhez 1:1 1:0 tartományba esik, elsõsorban 1:12 értékû. A feldolgozandó borostyánlevelek és az extrahálószer meghatározott mennyiségi arányának kiválasztásával a találmány szerinti eljárásban befolyásolható az ¹hederin az extraktumban. A mennyiségi arány meghatározásánál figyelembe kell venni, hogy egyrészt a C komponenst adott esetben teljesen át kell alakítani. Másrészt az alkalmazott extrahálószer-t úgy kell az eljáráshoz igazítani, hogy optimálisan alacsony k alkalmazásával sikeres extrahálást érjünk el. Szakember számára nyilvánvaló, hogy ehhez különbözõ mennyiségi arányok alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban. A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módjánál elõnyös, ha a b) lépésben az extrahálószer egyik vízrészét adagoljuk, és különösen, ha elõször csupán az extrahálószer fele mennyiségének vízrészét adagoljuk. Ennél a megvalósítási módnál az extrahálószer alkoholrészét, és adott esetben a további extrahálószert csak a fermentálás után adagoljuk. Az a tény, hogy az extrahálószer alkoholrészét a vízrésszel végzett fermentálás után adagoljuk, eljárástechnikailag elõnyös, mivel így az extrahálószer adagolandó a különbözõ tételeknél egyenként elõre, pontosan és egyszerûen számolható és beállítható. A víz és az alkohol külön térfogatrészei egymástól elkülönítve, illetve a b) és c) lépésben kiegészítõleg adagolhatók. Ennél különösen elõnyös, ha a fermentáláshoz az extrahálószer fele mennyiségének megfelelõ vízrészt adagoljuk, ami az eljárást még elõnyösebbé teszi. Nem zárható ki azonban az sem, hogy a fermentálás céljára más vízket adagolunk a C ¹hederinné történõ átalakítási folyamatának befolyásolásához. Elõnyös továbbá, ha a b) lépést 1 perc és 1 perc tartományba esõ idõtartam alatt, elsõsorban perc idõtartam alatt végezzük. A fermentáció idõtartamának változtatásával az extraktum ¹hederintartalma a találmány szerinti eljárásban tovább szabályozható. Itt különösen elõnyös, ha a fermentálást C, elsõsorban C hõmérsékleten végezzük. A találmány szerinti eljárás egy további megvalósítási módjánál elõnyös, ha az extrahálást a c) lépésben elõduzzasztással és perkolálással végezzük. Mindkét mûvelet a technika állásához tartozik, és elsõsorban gyógyszerkészítmények növényekbõl történõ elõállításának területén szokásos módszerek. Az elõduzzasztás és perkolálás lépéseivel biztosítható a borostyánlevelek teljes extrahálása. A vízrésszel végzett fermentálás után ennek megfelelõen az elegyhez hozzáadagoljuk a megfelelõ alkoholrészt, majd végre- 3
1 2 3 4 0 hajtjuk az elõduzzasztást. A perkoláláshoz elõnyösen adagoljuk az extrahálószer maradék mennyiségét, amelybõl meghatározott részeket elõzetesen a fermentáláshoz és más extrakciós lépésekhez használtunk. Itt elõnyös, ha az elõduzzasztást 1 óra és óra tartományba esõ idõtartam alatt, elsõsorban 6 óra idõtartam alatt végezzük. A találmány szerinti eljárás továbbvitelében elõnyös, ha a szárítást a d) lépésben vékonyfilmes bepárlással és ezt követõ permetezve szárítással végezzük. Mindkét eljárás szokásos szárítási eljárás, ahol a vékonyfilmes bepárlás gyógyszerkészítmények elõállításánál kíméletes bepárlási eljárásnak bizonyult, ugyanúgy, mint a permetezve szárítás, melyekkel a tapasztalatok szerint folyékony készítmények por alakú végsõ termékekké száríthatók, amelyekre különösen jellemzõ, hogy például vízzel ismét könnyen felhasználható készítményekké keverhetõk el. Elõnyös továbbá, ha a találmány szerinti eljárást az ¹hederin- és tartalom szabályozására alkalmazzuk egy borostyánlevelekbõl készített extraktumban. A találmány szerinti eljárással ezenkívül lehetõvé válik az ¹hederintartalom célzott szabályozása az extraktumban. Ennek értelmében a találmány szerinti eljárás felhasználható a teljes átalakítására ¹hederinné egy borostyánlevelekbõl készített extraktumban, vagy akár a részleges átalakítására ¹hederinné. Ennek megfelelõen lehetséges például, hogy elõször a drognak csak meghatározott részét fermentáljuk vízzel, és a fermentálás lejátszódása után a drog maradék részét extraháljuk. Ily módon célzott száraz extraktum állítható elõ, amelyben nincs a teljes C¹tartalom ¹hederinné átalakítva. Emellett ily módon lehetõvé válik az is, hogy az ¹hederintartalmat az extraktumban pontosan szabályozzuk. Ez például akkor szükséges, ha azt akarjuk, hogy az ¹hederintartalom az extraktumban ne legyen túl magas, hanem egy meghatározott mennyiségû C még jelen legyen. A találmány tárgya kiterjed a borostyánlevelekbõl találmány szerinti eljárással elõállított extraktumra. A nagy mennyiségû ¹hederint tartalmazó extraktumok elõnyösek például a légúti betegségek kezelésénél, mivel a koncentrált formában jelen lévõ ¹hederinnel a levelek legaktívabb hatóanyaga van koncentrált formában. A találmány tárgya kiterjed továbbá a találmány szerint elõállított extraktum, elsõsorban a száraz extraktum alkalmazására, gyógyszerkészítmények elõállítására és elsõsorban légúti betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények elõállítására. A találmány tárgya kiterjed továbbá az olyan gyógyszerkészítményre, amely találmány szerinti eljárással elõállított extraktumot tartalmaz. Itt a gyógyszerkészítmény lehet kapszula, tabletta, drazsé, kúp, granulátum, por, oldat, krém, emulzió, aeroszol, kenõcs és olaj formájában. Különösen elõnyösek az orálisan adagolható formák. A gyógyszerkészítmény tartalmazhat gyógyszerek elõállításánál szokásos segédanyagokat. A megfelelõ anyagok felsorolása megtalálható például: A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. kiadás, 00, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical Press. A további elõnyök megismerhetõk a leírásból és a csatolt ábrákból. Ezek a következõk: 1a. ábra fermentálás nélküli próba kromatogramja, és 1b. ábra fermentálásnak alávetett próba kromatogramja. Megjegyezzük, hogy a fent megadott és a késõbb ismertetett jellemzõk nemcsak a mindenkor megadott kombinációkban, hanem más kombinációkban és önmagukban is alkalmazhatók anélkül, hogy eltérnénk a találmány lényegétõl. Példák A technika állása szerint eddig alkalmazott extrakciós eljárások egy többlépéses extrakciós eljárásból állnak, amelyeknél a szárított drogot az aprítás után közvetlenül %¹os etanollal (t/t) elegyítik. A száraz extraktumban a C/ -hederin arány ezért megfelel a drogban jelen lévõ aránynak. Az utóbbi években elõállított extraktumok analízise szerint a C¹tartalom mintegy % a teljes extraktumra vonatkoztatva, míg az ¹hederin mintegy 1 % a teljes extraktumra vonatkoztatva. A technika állása szerint ismert módszerek alapján ezért olyan eljárást kellett kidolgozni, amellyel a C átalakítása ¹hederinné bevonható az extrakciós eljárásba. Ehhez elõször néhány elõkísérletet végeztünk. 1. Friss, még nem szárított levelek erõs és intenzív aprítása a drog ezt követõ szárításával A post harvesting processing mûveletnek a drogra és a késõbbi extraktumra gyakorolt hatásának vizsgálatához kézzel frissen és gondosan betakarítjuk a borostyánleveleket. Valamennyi levelet ugyanabban az idõpontban és ugyanazon a helyen gyûjtjük, és betakarítás után különbözõ eljárási folyamatokban vetjük alá. Ezután a próbákat az alábbiak szerint analizáljuk: egy próbat, ami mintegy 0 mg szárított drognak felel meg, malomban porítunk és ml 4% etanollal (v/v) 1 órán keresztül rázzuk. Egy kromatografálócsõbe történõ betöltés után friss 4% etanollal (v/v) 0 ml térfogatra perkoláljuk. Különbözõ próbák elõállításához az aprítás és a szárítás idõpontjait változtatjuk: 1. próba: A friss leveleket 3 3 mm nagyságú darabokra vágjuk, és csak 12 órás tárolás után szárítjuk. 2. próba: A friss leveleket 3 3 mm nagyságú darabokra vágjuk, és ezután azonnal szárítjuk. 3. próba: A vágatlan leveleket betakarítás után 0 C hõmérsékleten szárítjuk, és csak röviddel az extrahálási folyamat elõtt mintegy 3 3 mm nagyságú darabokra aprítjuk. A kromatográfiás vizsgálatokat az ¹hederin- és C¹tartalomra vonatkozóan a következõ táblázatban adjuk meg. 4
1. táblázat 2. próba: A drogot az 1. próbánál leírt módon kezeljük, de víz helyett % etanolt (t/t) alkalmazunk. A kromatográfiás eredményeket az ¹hederin- és C¹tartalomra vonatkozóan a 3. táblázatban adjuk meg. 3. táblázat 1. próba 1,2 6,0 8,08 2. próba 1,,4 7,73 3. próba 1,13,7 7,9 Az eredmények egymással összehasonlíthatók, és szignifikáns eltérést nem mutatnak, bár a friss állapotban aprított leveleknél a C/ -hederin arány kismértékben eltolódni látszik az ¹hederin irányába. A további vizsgálatokban a borostyánlevelek aprításának mértékét és a tartalommeghatározás idõpontját változtatjuk: 1. próba: A friss leveleket finoman eldörzsöljük, és azonnal 4% etanollal (v/v) extraháljuk. 2. próba: A friss leveleket finoman eldörzsöljük, és 4 perc várakozás után 4% etanollal (v/v) extraháljuk. 3. próba: A vágatlan leveleket betakarítás után 0 C hõmérsékleten szárítjuk, és röviddel az extrahálási mûvelet elõtt aprítjuk. A kromatográfiás vizsgálatok eredményeit az ¹hederin- és C¹tartalomra vonatkozóan a következõ 2. táblázat mutatja. 2. táblázat 1. próba 3,74 0,37 6,4 2. próba 3,17 0,19,34 3. próba 1,13,7 7,9 Mint a táblázatból látható, az intenzív aprítással közel a teljes C ¹hederinné alakítható. 2. Szárított és aprított drog fermentálása az extrahálás elõtt A sejtek épségének szétroncsolásához erõs aprítással és víz hozzáadásával megkezdjük a C átalakítását ¹hederinné. Ezt a következõ kísérletek szerint végezzük. Egész, szárított borostyánleveleket, melyek elõzetesen meghatározott hatóanyag-tartalma 7,94% C és 0,9% ¹hederin, az alábbiak szerint kezelünk: 1. próba: 0 mg erõsen aprított levelet ml vízzel elegyítünk. A vizet vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot a szokásos módon 4% etanollal (v/v) extraháljuk. 1 2 3 4 0 1. próba 4, 0 7,1 2. próba 1,12 6,1 8,33 Kiindulás 0,9 7,94 8,90 Mint az adatokból látható, ha az aprított droghoz vizet adagolunk, a C teljesen ¹hederinné bomlik le. Az 1. ábra HPLC eljárással nyert kromatogramot mutat az 1. próba (1b. ábra) és a 2. próba (1a. ábra) esetében. Az ábrákon a C anyag által adott csúcsot HC jelöli, az ¹hederin által adott csúcsot mindenkor ¹H jelöli. Mint az 1a. és 1b. ábrán található csúcsok összehasonlításából adódik, a C az ¹hederin javára szinte teljesen lecsökken, ami arra utal, hogy a teljes C átalakult. A %¹os etanollal (t/t) végzett fermentálás szintén a C lebomlásához vezet, azonban lényegesen kisebb mértékben. További vizsgálatokkal kimutatható, hogy a drog aprításának mértéke és a víz adagolt döntõ jelentõségû az átalakulás mértéke szempontjából: a mintegy mm nagyságú levélfragmensekkel végzett extrakciós kísérletek, amiket az ismertetett módon vízzel fermentáltunk, azt mutatják, hogy az ¹hederin a C rovására feldúsul, de az átalakulás nem teljes, mert sok sejt ép maradt. Abban a kísérletben, ahol finoman aprított leveleket a vízzel csak enyhén megpermeteztünk, azt találtuk, hogy a C átalakulása nem teljes. Ahhoz, hogy a C komponensnek ¹hederinné történõ átalakulásáról a fent megadott eddig ismert ismereteket eredményesen egy hatásos extrakciós eljárásba tudjuk építeni, az extrakciós eljárás következõ változatait végeztük el: 1. extraktum: 3,0 g aprított borostyánlevelet ( mm) 12¹szeres mennyiségû % etanollal (t/t) extrahálunk (normálextrakció). 2. extraktum: 3,0 g aprított borostyánlevelet ( mm) egy kromatografálóoszlopban vízzel lefedünk. 1 óra elteltével a vizet egy leeresztõcsapon keresztül leeresztjük, majd 12¹szeres mennyiségû % etanollal (t/t) extrahálunk. 3. extraktum: 3,0 g aprított borostyánlevélhez ( mm) 12 rész extrahálószer [%
etanol (t/t)] vízrészét adagoljuk. 1 óra fermentációs idõ után hozzáadjuk a 12 rész extrahálószer etanolrészét az extraháláshoz. A kromatográfiás kiértékeléssel a következõ 4. táblázatban megadott eredményeket kaptuk. 4. táblázat 1. extraktum 0,48 19,80,8 2. extraktum 4,11 1,38 8,06 3. extraktum 8,38,88 19,1 1 2 3 4 0 Mivel a drogot ezeknél az extrahálásoknál csak mm méretre aprítottuk, az átalakulás nem teljes mértékû. A táblázatból egyértelmûen felismerhetõ, hogy a fermentációs víz levezetése (2. extraktum) hatóanyag-veszteséghez vezet. A fent ismertetett elõkísérletek kombinálásával egy további extrakciós eljárást fejlesztettünk ki, amellyel szabályozható a borostyánlevél száraz extraktum ¹hederintartalma. 3. Extrakciós eljárás borostyánlevelekbõl szabályozott ¹hederintartalommal rendelkezõ száraz extraktum elõállítására A minõség és felszabadulás minõség-ellenõrzéssel történõ vizsgálata után a drog (borostyánlevelek, DAC) egy részét egy malomban erõsen aprítjuk, ahol a fragmensek nagyságát egy védõszitával legfeljebb 2 2 mm értéken biztosítjuk. Ezután a szitáit anyagot optikailag nagyobb szemcseméret és szennyezõdések alapján vizsgáljuk. Az aprított próbához 6 rész extrahálószer [% etanol (t/t)] vízrészét adjuk. Ezt az elegyet C hõmérsékleten esetenkénti kevertetés mellett percen keresztül fermentáljuk. Ezután hozzáadjuk a 6 rész extrahálószer 96% etanolrészét, és az elegyet kevertetéssel homogenizáljuk. Egy 6 órás duzzasztási fázis után az eluátumot elválasztjuk, és a visszamaradó drogot a maradék 6 rész extrahálószerrel perkoláljuk. Az egyesített eluátumokat kis drogszemcsék kizárása érdekében ismét szûrjük és homogenizáljuk, majd vékonyfilmes bepárlással C hõmérsékleten és mbar nyomáson szárítjuk. A maradékot homogenizáljuk, és ezután permetezve szárítjuk 4 C hõmérsékleten borostyánlevelekbõl készült száraz extraktum kialakulásáig. A fenti elõállítási eljárás vizsgálatához a következõ extraktumokat állítottuk elõ: 3,91% C¹ és 0,% ¹hederintartalommal rendelkezõ borostyánlevelekbõl kiindulva extraktumot készítünk egyszer a szokásos módszerrel [a szárított próbát aprítjuk és közvetlenül % etanollal (t/t) elegyítjük és extraháljuk] és egyszer az új módszerrel. A kromatográfiás eredményeket az ¹hederin- és tartalomra vonatkozóan a következõ. táblázatban adjuk meg. (%). táblázat (%) Szokásos 0,3 8,68 9,4 Új 4,74 0 7,71 Mint a táblázatból látható, az új extrakciós eljárással a levelekben található C teljesen ¹hederinné alakítható. Mivel a számolt teljes szaponintartalom is ugyanabban a nagyságrendben mozog, lehetõvé válik a drogban mért megfelelõ szaponinkoncentráció ismeretében és a mintegy 2 3-szoros dúsítási faktor figyelembevételével az extraktum végsõ ¹hederintartalmának becslése. Ahhoz, hogy a drogban elõforduló C komponensnek csak egy részét alakítsuk át ¹hederinné, ennek megfelelõen a drognak csak meghatározott részét fermentáljuk vízzel, melynek során minden más paramétert állandó értéken tartunk. A perces fermentálás lejátszódása után a 6 órás duzzasztáshoz hozzáadjuk a maradék drogot és az etanolt. A találmány szerinti eljárással lehetõvé vált, hogy a borostyánlevelekbõl készült száraz extraktum hatóanyagspektrumát egy fermentálás beiktatásával jelentõsen megváltoztassuk túl nagy idõ és forrásfelhasználás ráfordítása nélkül. Az ¹hederin hatékonyságáról szóló számos publikáció ismeretében az ¹hederintartalom célzott befolyásolása egy száraz extraktumban, illetve gyógyszerkészítményben pozitív hatást gyakorol az extraktum hatékonyságára. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás extraktum elõállítására borostyánlevelekbõl egy extrahálószer alkalmazásával, ahol az extraktum ¹hederint tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a következõ lépéseket tartalmazza: a) szárított borostyánlevelek egy mennyiségét aprítjuk, b) víz hozzáadásával fermentáljuk, melynek során a C komponenst ¹hederinné alakítjuk, c) az extrahálószer hozzáadásával extraháljuk, és d) az extraktumot adott esetben szárítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben a borostyánlevelek aprítását mm méretre végezzük. 6
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a borostyánlevelek aprítását 2 2 mm méretre végezzük. 4. Az 1 3. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy extrahálószerként alkohol- és vízrészbõl álló elegyet alkalmazunk.. Az 1 4. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extrahálószerben alkoholként egy C 2 C alkoholt alkalmazunk. 6. Az. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkoholként 96%¹os etanolt alkalmazunk. 7. Az 1 6. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extrahálószer víz/alkohol részének aránya (t/t) /90 90/. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a víz/alkohol arány 70/. 9. Az 1 8. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a borostyánlevelek aránya az extrahálószerhez 1:1 1:0.. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a borostyánlevelek aránya az extrahálószerhez 1:12. 11. Az 1 9. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az extrahálószer egyik vízrészét alkalmazzuk. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a teljes extrahálószer fele mennyiségének vízrészét adagoljuk. 13. A 12. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extrahálószer 6 részének vízrészét adagoljuk. 14. Az 1 13. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést 1 perc és 1 perc tartományba esõ idõtartam alatt végezzük. 1 2 1. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést perc idõtartam alatt végezzük. 16. Az 1 1. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést C tartományba esõ hõmérsékleten végezzük. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépést C hõmérsékleten végezzük. 18. Az 1 17. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben az extrahálást elõduzzasztással és perkolálással végezzük. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elõduzzasztást 1 óra és óra tartományba esõ idõtartam alatt végezzük.. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elõduzzasztást 6 óra idõtartam alatt végezzük. 21. Az 1. igénypontok egyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a d) lépésben a szárítást vékonyfilmes bepárlással, és ezt követõen permetezve szárítással végezzük. 22. Az 1 21. igénypontok egyike szerinti eljárás az ¹hederin- és tartalom szabályozására egy borostyánlevél-extraktumban. 23. Borostyánlevelekbõl készített extraktum, azzal jellemezve, hogy az 1 22. igénypontok egyike szerinti eljárással van elõállítva. 24. A 23. igénypont szerinti extraktum alkalmazása gyógyszerkészítmény elõállítására. 2. A 24. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítményt légúti betegségek kezelésére alkalmazzuk. 26. Gyógyszerkészítmény, amely 2. igénypont szerinti extraktumot tartalmaz. 7
HU 003 012 T2 Int. Cl.: A61K 36/2 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törõcsik Zsuzsanna fõosztályvezetõ-helyettes Windor Bt., Budapest