A hisztamin és hisztamin H4 receptor hiányának hatása a dendritikus sejtek működésére Doktori tézisek Jelinek Ivett Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. László Valéria egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Berki Tímea egyetemi docens, Ph.D. Dr. Dérfalvi Beáta egyetemi tanársegéd, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Oláh Imre egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Lányi Árpád egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Kiss András egyetemi adjunktus, Ph.D. Budapest 2007
Bevezetés Jelen doktori értekezés tárgyát egy kismolekulájú biogén amin, a hisztamin, dendritikus sejtek működését, érését és migrációját befolyásoló hatásainak elemzése képezte. A dendritikus sejtek (DC-k), mint professzionális antigénprezentáló sejtek meghatározó szerepet töltenek be az immunválasz megindításában és szabályozásában. Fő feladatuk az antigének felvétele, feldolgozása és bemutatása a T-limfocitáknak. A perifériás szövetekben a még éretlen DC-k saját és idegen eredetű antigéneket vesznek fel. Ezek az éretlen DC-k igen csekély T-sejt aktivációs képességgel rendelkeznek, ugyanakkor hihetetlen aktív antigén felismerő képességgel bírnak. Egy fertőzés során a DC-k, miután megérkeznek a fertőzési kapu helyszínére, felveszik az antigéneket, aktiválódnak és érési folyamaton mennek keresztül. A DC-k érése elengedhetetlen az effektív immunválasz kialakulásához, mivel ennek során emelkedik meg az antigén prezentáló MHCII proteinek, és számos kostimulációs molekula expressziója is a DC-k felszínén. A DC-k ezen érési folyamatát azonban egy sor külső hatás és egyéb molekuláris jel is befolyásolhatja, így a PAMP-ok (patogénekre jellemző molekuláris mintázatok), gyulladásos citokinek (pl. IL-1, TNFα) és a különböző bakteriális termékek (pl. LPS). Ilyen környezeti faktor a hisztamin is, amelynek hatásaival a jelen doktori dolgozat foglalkozik. A már érett DC-k bevándorolnak a környéki nyirokcsomókba, ahol bemutatják a felvett és feldolgozott antigéneket a naív T-sejteknek, és hatékony immunválaszt indítanak meg. A hisztamin jól ismert gyulladási és allergiás mediátor. Ezen kívül immunmodulatórikus hatásai is ismertté váltak, így az immunfolyamatok szabályozásában is szerepet játszik. Leírták hatásait a legkülönfélébb immunsejtek, így az antigénbemutató sejtek működése során is. A hisztamin számos hatását igazolták DC-ken, monocitákon, és T-sejteken, amelyekre hatva elsősorban a Th1/Th2 regulációban vesz részt. A hisztamin hatással van a leukociták migrációjára is. Úgy tűnik, hogy a hisztamin negyedik receptorának, 1
a H4R-nak különösen nagy szerepe van ezekben a folyamatokban, mivel eozinofileken és hízósejteken a H4R kemotaktikus hatásokat közvetít. Doktori munkám során elsősorban azt a kérdést kívántam vizsgálni, hogy a hisztamin hatással van-e a dendritikus sejtek működésére, és ha igen, milyen szerepet tölt be abban. A kérdések megválaszolásához és a hisztaminközvetített hatások elemzéséhez olyan egérmodelleket használtunk fel, amelyek vagy nem rendelkeznek a hisztamint előállítani képes hisztidin-dekarboxiláz enzim génjével (HDC -/- ), vagy a hisztamin négyes típusú receptorát ütötték ki bennük homológ rekombinációval (H4R -/-). Dolgozatomban egér lépekből izolált DC-ken vizsgáltuk a hisztamin (illetve annak hiányának) hatásait, különösen azokat, amelyek közvetítésében a H4R is szerepet játszik. A DC-k antigénprezentáló képességét, T-sejt polarizáló képességét és migrációját is elemeztük, melyek a DC-k három legalapvetőbb funkcióját képezik. Mivel a kísérleteink során az eddigi vizsgálati rendszerektől eltérő módon nem in vitro rendszerekben differenciált DC-ket, hanem lép-eredetű sejteket vizsgáltunk, ez a modell alkalmasabb a hisztamin által a DC-k differenciálódására és működésére gyakorolt hatások megvilágítására. 2
Célkitűzések A doktori dolgozat célkitűzései röviden a következők voltak: 1. A hisztamin szerepének megvizsgálása a DC-k a legfontosabb ellátandó feladata, az antigénprezentáció során. 2. A DC sejtfelszíni molekuláinak analízise abból a célból, hogy feltérképezzük a hisztamin lehetséges hatását a DC-k szubpopulációinak megoszlására, illetve kostimulációs molekuláik expressziójára. 3. A hisztamin hatásának vizsgálata a DC-k in vitro citokin termelésére. 4. A hisztamin hatásának vizsgálata a DC-k in vivo citokin termelésére. A hisztamin lehetséges regulatórikus szerepétnek elemezése a DC-k T-sejt polarizációjában. 5. Egér eredetű DC-k hisztamin receptor expressziójának vizsgálata. 6. A H4R szerepének tanulmányozása az antigénprezentáció folyamatában. 7. A H4R szerepének elemzése dendritikus sejtek in vitro citokin termelésében. 8. A H4R hatásának vizsgálata dendritikus sejtek migrációjára. 3
Metodikák Állatok: Kísérleteinkhez kétféle génkiütött egérmodellt használtunk. Az egyik egértörzs genetikailag hisztamin hiányos (HDC -/- ), a másik pedig genetikailag H4R hiányos (H4R -/- ). Mindkét esetben a kísérletekhez génkiütött egerek mellett kontrollként vad genotípusú egyedeket alkalmaztunk. Sejtek: Izolált dendritikus sejtek: HDC -/-, H4R -/- és vad típusú egerek lépeiből, mágneses gyöngyök segítségével dendritikus sejteket szeparáltunk, ezeket a sejteket használtuk fel későbbi kísérleteinkhez. CTLL-2: Limfoblaszt sejtvonal, citotoxikus T-sejt klón. Ez a vonal IL-2 dependens, ezért kiválóan alkalmas az IL-2 citokin mennyiségi változásának pontos és érzékeny nyomon követésére. 5/4E8: Egér T-sejt hibridóma sejtvonal, amely a humán aggrekán peptid epitópjának specifikus felismerésére képes T-sejt receptorral rendelkezik In vitro antigénprezentációs bioassay: Vad típusú, HDC -/- és H4R -/- DC-ket humán aggrekán peptidre specifikus, 5/4 E8 T-sejt hibridóma sejtvonallal tenyésztettük együtt, aggrekán peptid jelenlétében. Az antigénprezentáció hatékonyságát, a termelődött IL-2 citokin mennyisége alapján CTLL proliferációs assay-t követő MTT-reakció segítségével határoztuk meg. In vitro DC stimulációs kísérletek: Vad típusú és HDC -/- DC-ket 1 μg LPS-sel és/vagy 10-6 M hisztaminnal kezeltük 24 órán keresztül, illetve egy másik kísérletsorozatban LPS-stimulált vad típusú DC-ket 10-6 M hisztaminnal, illetve specifikus H4R antagonistával (JNJ7777120, 10-6 M) kezeltük ugynancsak 24 órán át. A kísérletek végeztével a sejtekből RNS-t izoláltunk, a felülúszóból pedig meghatároztuk a termelődött IL-12 és IFNγ fehérjék koncentrációját. 4
In vivo DC stimulációs kísérletek: Az in vivo kísérletekhez HDC -/-, illetve vad egereket 0.2 ml PBS-sel (kontroll), illetve CFA emulzióval kezeltünk intraperitoneálisan. Az immunizálás 9. napján DC-ket szeparáltunk, majd a sejtekből RNS-t izoláltunk és a termelődött citokinek mrns expresszióját real time PCR-rel vizsgáltuk. In vitro migrációs assay (Transwell rendszer): A migrációhoz előkészítettük a transwell rendszert, a kamrákba inzerteket helyeztünk és RPMI médiummal kezeltük elő. Ezután az alsó kamrákba CCL19-et (100 ng/ml), hisztamint (10-6 M), illetve a kettő elegyét tettük. A felső inzertekbe az RPMI helyére óvatosan 200μl DC-ket tartalmazó sejtszuszpenziót rétegeztünk és a sejteket 37 C-on, termosztátban, 90 percig migráltattuk a membránon keresztül. A kísérletek egy részében a DC-ket H4R antagonistával (JNJ7777120) kezeltük elő (10-6 M) a migrációs assayt megelőző 10 percben, majd a felső inzertekbe helyeztük őket és a fent leírt módon jártunk el. Az átvándorolt DC-k számát adott számú mikropartikulumra normalizálva, áramlási citometriásan határoztuk meg. In vivo migrációs assay (FITC painting): H4R -/- és vad típusú egerek abdominális (hasi) tájékát FITC - dibutil-ftalát - aceton oldattal kezeltünk. 18 órával később az egerekből izoláltuk az inguinális nyirokcsomókat és áramlási citometriásan meghatároztuk a FITC+ CD11c+ sejtek, azaz a nyirokcsomóba vándorolt Langerhans sejtek arányát. 5
Eredmények Vizsgálataink során a hisztamin, mint az egyik fontos környezeti faktor szerepét vizsgáltuk a dendritikus sejtek alapvető feladatainak betöltése során. Kísérleteink első felében genetikailag hisztamin hiányos (HDC -/- ) és vad egerek DC-jeit hasonlítottuk össze, elsőként egy antigénprezentációs bioassay során. Ez az assay igen érzékeny, igazoltuk, hogy már 10 3 darab dendritikus sejt is elegendően hatékonyan mutat be antigéneket és stimulál T limfocitákat ahhoz, hogy azok a rendszer számára mérhető mennyiségű IL-2 citokint termeljenek (p<0,001). Eredményeik azt mutatják, hogy a genetikailag hisztamin hiányos DC-k szignifikánsan jobb antigénprezentáló képességgel rendelkeztek, mint vad társaik (p=0,002). Különböző alpopulációkba tartozó DC-k eltérő antigénbemutató képességgel rendelkezhetnek, és más-más módon aktiválják a T-sejteket, így ha a vizsgált csoportok DC alpopulációi eltérnének egymástól, ez magyarázhatná a tapasztalt eltérő antigénprezentációt. Mi azonban sem a fő DC marker, a CD11c sejtfelszíni megjelenésében, sem a sejtek MHCII expressziójában nem találtunk eltérést, és ugyanígy nem találtunk eltérést a DC alpopulációk megoszlásában sem a HDC -/- és vad típusú egerek szeparált DC-jeit összehasonlítva. Három alapvető fontosságú kostimulációs molekula sejtfelszíni expresszióját is megvizsgáltuk (CD80, CD86, CD40), de ezekben sem találtunk eltérést a HDC -/- és vad típusú DC-k között. Mivel az antigénprezentáció hatékonyságát a DC-k által termelt citokinek nagyban befolyásolhatják, megvizsgáltuk ezen sejtek citokin termelő képességét is. LPS stimulációt követően a hisztamin hiányos DC-k több IFNγ-t termeltek mind mrns (p=0,015), mind fehérje szinten (p=0,007) és ez által erőteljes TH-1 irányú polarizációt eredményeznek. In vivo kísérleteink szintén azt mutatták, hogy a hisztamin hiányában differenciálódott DC-k Th1 irányú polarizációt indukálnak, hiszen ebben az esetben a stimulált HDC -/- DC-k mind IL-12-ből (p=0,015), mind IFNγ-ból (p=0,023) is többet termeltek. Az IL-10 esetében e sejteket a kontroll, kezeletlen állatokból származó DC-kkel összehasonlítva megállapítottuk, hogy a hisztamin hiánya (HDC -/- ) e citokin 6
esetében is szignifikáns emelkedést eredményezett (p<0,001). Azonban a stimulálást követően ezekben a mintákban jelentősen csökkent az expressziós szintjük (p=0,008), míg a vad állatok DC-iben nem volt megfigyelhető ilyen, szignifikáns változás. Kísérleteink második felében azt vizsgáltuk, mely receptorok játszanak szerepet a hisztamin hatásainak közvetítésében. Kimutattuk, hogy egér lép eredetű DC-k három hisztamin receptor típust expresszálnak; kimutattuk a H1R, a H2R és az újonnan felfedezett H4R mrns expresszióját a DC-kben. Mivel a H4R szerepét DC-ken csak igen csekély számú adat igazolja, a további kísérletekben megvizsgáltuk a H4R szerepét az előzőekben vázolt hisztamin hatások közvetítésében. A vizsgálatokhoz H4R -/- DC-ket vizsgáltunk, illetve egyes esetekben a H4R működését specifikus H4R antagonistával (JNJ7777120) gátoltuk. Azt tapasztaltuk, hogy a H4R -/- DC-k szintén jobb antigénprezentációs képességgel rendelkeztek (p<0,001), hasonlóan, mint a hisztamin hiányos DC-k. Amikor pedig a hisztamin különböző receptorait specifikus antagonistákkal gátoltuk, megállapítottuk, hogy kizárólag a H4R antagonista kompenzálta a hisztamin negatív hatását (p=0,003), tehát feltételezhető, hogy a H4R fontos szerepet játszik a hisztamin antigénprezentációt csökkentő hatásának közvetítésében. Hasonló eredményt kaptunk, amikor a DC-k IFNγ expresszióját vizsgáltuk, amennyiben itt is azt a tendenciát figyeltük meg, hogy a H4 receptor blokkolásával kivédhető volt a hisztamin mérsékelt, ám nem szignifikáns IFNγ expressziót csökkentő hatása. Az IL-12 esetében ez a hisztamin hatás nem volt számottevő, és érdekes módon a H4R blokkolásával nem volt kompenzálható a hisztamin IL-10 expresszióra gyakorolt, mérséklő hatása sem. A DC-k jellegzetes vándorló sejtek. Mivel a H4R -/- DC-kben szignifikánsan alacsonyabb CCR7 mrns expressziót mértünk a vad DC-khez képest (p=0,040), ezért egy in vitro migrációs assay-ben összehasonlítottuk a vad és H4R -/- DC-k vándorlási képességét. Eredményeink azt mutatják, hogy a DC-k migrációs képessége lecsökken H4R hiányában (p=0,028) és ugyanezt a tendenciát figyeltük meg H4R antagonistával elvégzett kísérleteinkben is. 7
Végezetül megvizsgáltuk a H4R migrációban betöltött szerepét egy in vivo rendszerben is, FITC painting assay segítségével. Kísérleteink eredményei egyértelműen megerősítették, hogy H4R hiányában a DC-k, jelen esetben a Langerhans sejtek (LC-k) migrációja gátolt. A nyirokcsomókban talált LC-k aránya szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a vad egerek esetében (p=0,013). Következtetések A jelen doktori dolgozatban arra kerestük a választ, hogy a hisztamin, mint fontos gyulladási és immunmodulátor, gyakorol-e bármilyen releváns hatást az immunrendszer fő antigénprezentáló sejtjeinek, a dendritikus sejteknek a működésére, és ha igen, akkor vajon ez a hatás miben nyilvánul meg, és milyen receptorokon keresztül érvényesül. A doktori dolgozatban a DC-k három alapvető feladatát vizsgáltuk meg. Az első ilyen feladat a DC-k antigén felvétele, feldolgozása és bemutatása. A második a citoknek és egyéb molekulák termelése a környezet által ért stimulusoknak megfelelően. A legvégső pedig a migráció, amely során a DC-k az antigének felvételének helyszínéről egy meghatározott helyre, a nyirokszövetek T-sejtes zónáiba vándorolnak, és ott immunválaszt indítanak el. E három folyamat eredményeként a DC-k a T-sejtek közreműködésével a lehető legmegfelelőbb választ váltják ki az immunrendszerből. Antigénprezentációs kísérleteink alapján elmondhatjuk, hogy a hisztamin negatívan befolyásolja a DC-k antigénprezentációját és ezt a gátló hatást elsősorban H4R-on keresztül fejti ki. Mivel az antigénprezentáció egy igen komplex folyamat, megvizsgáltuk, melyek lehetnek azok az elemek, amelyekre hatva a hisztamin, vagy épp annak hiánya ilyen különbséget hozhat létre az érett DC-k működésében. Ezért megvizsgáltuk az antigénprezentációban alapvető kostimulációs molekulák expresszióját, de nem találtunk eltérést a két vizsgált csoport között. Összehasonlítottuk a két egértörzsből származó dendritikus sejteket az alapján is, hogy van-e eltérés a dendritikus sejt alpopulációk megoszlása között, de 8
ebben az esetben sem találtunk eltérést. Megállapíthattuk tehát, hogy a HDC -/- és vad típusú DC-k nem mutatnak jelentős fenotípusos eltéréseket egymástól. Ugyanakkor mikor megvizsgáltuk a hisztamin hatását a DC-k citokin produkciójára azt tapasztaltuk, hogy a hisztamin megváltoztatja a DC-k citokin termelését, amennyiben a hiányában intenzívebb citokin expresszió volt megfigyelhető. Azonban a hisztaminnak a DC-k citokin termelésére gyakorolt hatásának közvetítésében a H4R nem játszik kizárólagos szerepet, ezekben a folyamatokban egyéb hisztamin receptorok szerepe is valószínűsíthető. Legvégül megmutattuk, hogy a H4R közvetítette szignálok meghatározóak a DC-k migrációjában, a receptor hiányában lecsökken a DC-k migrációja mind in vitro, mind in vivo. Összefoglalásul elmondhatjuk, hogy a hisztamin releváns moduláló faktor a DC-k környezetében, befolyásolja a dendritikus sejtek antigénprezentáló képességét, citokin profilját és migrációs képességét. Ezen felül azt is bebizonyítottuk, hogy ezen hatások kiváltásában a H4R-nak a dendritikus sejtek felszínén alapvető szerepe van. Eredményeink hozzájárulhatnak H4R-on keresztül ható target molekulák kifejlesztéséhez, amelyek új lehetőséget nyitnak meg számos, az immunrendszert érintő betegségek kezelésében. 9
Saját publikációk jegyzéke A doktori dolgozat témájában írt közlemények listája: 1. Jelinek I, Laszlo V, Buzas E, Pallinger E, Hangya B, Horvath Z, Falus A. Increased antigen presentation and T(h)1 polarization in genetically histamine-free mice. Int Immunol. 2007;19:51-58. IF: 3,317 2. Buzas EI, Gyorgy B, Pasztoi M, Jelinek I, Falus A, Gabius HJ. Carbohydrate recognition systems in autoimmunity. Autoimmunity. 2006;39:691-704. IF: 1,49 3. Kis Z, Pallinger E, Endresz V, Burian K, Jelinek I, Gonczol E, Valyi- Nagy I. The interactions between human dendritic cells and microbes; possible clinical applications of dendritic cells. Inflamm Res. 2004;53:413-423. IF: 1,45 Egyéb közlemények listája: 1. Horvath Z, Pallinger E, Horvath G, Jelinek I, Falus A, Buzas EI. Histamine H1 and H2 receptors but not H4 receptors are upregulated during bone marrow regeneration. Cell Immunol. 2006 Dec;244(2):110-5. IF: 1,558 10
Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet nyilvánítani mindazoknak, akik ennek a doktori dolgozatnak a megtervezéséhez, az elkészültéhez, hozzájárultak. Először is családomnak, akik mindvégig támogattak ebben a munkában, türelemmel viselték ezt az időszakot, és mindig kiálltak mellettem, ha szükségem volt rá. Másodszor főnökeimnek, akikkel együtt dolgozhattam ez alatt a bő négy év alatt, és akik nemcsak kibírtak maguk mellett, de mindvégig istápoltak, tanácsaikkal, figyelmükkel segítették a munkámat: Falus Andrásnak, László Valériának, Buzás Editnek, Martin Zenkének, és Thomas Hieronymusnak. Harmadszor köszönet illeti azokat, akikkel egy laborban, vagy egyazon témán dolgozhattam ez alatt a pár év alatt, és akik a tudásukkal, ötleteikkel és kérdéseikkel, és különösen az egyéni szemléletükkel különösen sokat lendítettek ezen a munkán. Wiener Zoltán, Pós Zoltán, Hegyi Krisztina, Keszei Márton, Horváth Zsuzsanna, Erdélyi Dániel, Molnár Viktor, Pásztói Mária, Gilicze Anna, Láng Orsolya, Lajkó Eszter, Pócza Péter, Ungvári Ildikó, Félné Semsei Ágnes, Tölgyesi Gergő, Rácz Melinda, Piritta Jäntti and Steffen Gräber voltak azok a TDK-sok, doktoranduszok, technikusok és postdoc-ok, akik a legtöbb segítséget nyújtották nekem, és akiknek ezért név szerint is szeretnék köszönetet mondani. Negyedszer szeretném köszönetemet kifejezni mindazoknak, akikkel a SE Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézete, és az RWTH Institute for Biomedical Engineering, Department of Cell Biology munkatársaként egy intézetben dogozhattam ez alatt az idő alatt, és akik befogadtak abba a társaságba, amiben már hosszú ideje dolgoztak. Közülük is külön köszönettel tartozom László Valériának, aki nélkül a doktori dolgozatom nem jöhetett volna létre, aki már TDK-s korom óta egyengette utamat, megértésével, tanácsaival mindvégig segítségemre volt, Pállinger Évának, amiért bevezetett az áramlási citometria rejtelmeibe, és Farkasné Nagy Krisztinának, amiért megtanított arra, hogyan kell sejteket életben tartani. 11