QUANTA Lite TM gp210 708995 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas

QUANTA Lite TM gp210 708995 In vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA komplexitás: Magas Javasolt alkalmazás A QUANTA Lite TM gp210 egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat (ELISA), amely a humán szérumban lévő IgG osztályú anti-gp210 antitestek félkvantitatív kimutatására szolgál. Ennek a tesztnek az a rendeltetése, hogy elősegítse az elsődleges biliaris cirrhosis (PBC) diagnózisát. A teszt összegzése és magyarázata Az elsődleges biliaris cirrhosis (PBC) egy krónikus májbetegség, melyet a kis intrahepatikus epevezetékek elpusztulása jellemez. A progresszív epevezeték pusztulás a máj egyre jelentősebb funkcionális károsodását okozza, és idővel májelégtelenséghez, majd a májátültetés szükségességéhez vezethet. 1,2 A PBC etilógiája ismeretlen, jóllehet egy genetikai összetevő és más tényezők is fontosak lehetnek a betegség kifejlődésében. 1,3,4 A PBC tipikusan 30 és 65 éves kor között fordul elő és a nőket gyakrabban érinti, mint a férfiakat (a becsült nő:férfi arány 9:1), 1,3 valamint a PBC gyakorisága a PBC-betegek elsőfokú rokonságában 1,3% - 6,4% között mozog 3,5,6. A PBC világszerte minden emberfajnál előfordul. Az előfordulási gyakoriság a jelentések szerint földrajzi helyenként igen eltérő, a becslések szerint 2 per 100 000 főtől (Japánban és Ausztráliában) a 40 per 100 000 főig (az Egyesült Államokban) terjed. 7,8 A szerológiai tesztek fontos segítséget nyújtanak a PBC azonosításában és diagnózisában, mivel több, a PBC-vel összefüggő antitest már a tünetek egyértelművé válása előtt jelen van. 9 Az indirekt immunfluoreszcens teszttel (IFA) kimutathatók az anti-mitokondriális antitestek (AMA), a PBC klasszikus szerológiai markerei. Az AMA a PBC betegek 90-95%-ában kimutatható. Míg a klasszikus IFA mintázat könnyen értékelhető, értelmezése nehéz lehet, különösen akkor, ha más specificitások antitestei is jelen vannak. Az AMA reaktivitás elsődleges targetjei a mitokondriális membránban lévő 2-oxosav dehidrogenáz komplexek. Azok az ELISA tesztek, melyek ezeket a fehérjéket célozzák, érzékenyebbek, mint az AMA kimutatásra alkalmas IFA tesztek. 4,10,11 Mindamellett a PBC betegek legalább 5-10 %-a negatív teszt eredményt szolgáltat IFA és ELISA teszten is. Az AMA vagy a PBC más markereinek sikertelen kimutatása hozzájárulhat a PBC késedelmes diagnosztizálásához, ami a máj további károsodásának lehetőségét rejti magában. A PBC betegek szérumának közelítőleg 50 %-a tartalmaz anti-nukleáris antitesteket (ANA). 12,13 A PBCvel összefüggő ANA egyik specificitása a sejtmag membránban a gp210 pórus membrán protein festődése. 12,14 Ez a protein része annak a fehérjekomplexnek, amely a sejtmag membrán pórusait alkotja. Az anti-gp210 antitestek az összes PBC betegek kb. 25%-ában, illetve az AMA-negatív betegek 10-50%-ában. 12-16. Habár a gp210 antitestek viszonylag alacsony szenzitivitással bírnak a PBC tekintetében, specificitásuk, több mint 99%-osnak mutatkozik. 12,15-17 12,15-17 Továbbá a gp210 antitestek azonosíthatják azon betegek alcsoportját, akiknek betegség lefolyása szigorúbb. 13,18-20 Azokban az esetekben, amikor a klinikai jelek tisztázatlanok, a gp210 antitestek jelenléte megerősítheti a PBC diagnózisát. Az AMA és a gp210 antitestek jelenléte megelőzheti a tüneti betegség kifejlődését. 9,20,21 A PBC-gyanús betegek pontosabb és gyorsabb meghatározása lehetővé teszi az ellenőrzést és a kezelés hamarabbi megkezdését, ami lassíthatja a betegség előrehaladását. Az anti-gp210 antitestekkel összefüggő sejtmag membrán festési mintázatát gyakran nehéz értelmezni az azt kísérő AMA vagy ANA festődése miatt, illetve a mintázat lehet nem-gp210 specificitás is. Az antigp210 antitestek western blot módszerrel történő kimutatása sok munkával jár, technikaigényes, és függ a sávintenzitások szubjektív értelmezésétől. 15 Molekuláris vizsgálatok során a gp210 fehérje karboxilterminális citoplazmatikus farokrészén azonosították a gp210 egy immundomináns epitópját. Ez tette lehetővé a gp210 antitestek kimutatására szolgáló ELISA tesztek kidolgozását. 16,17,22,23 A módszer elve Az gp210 fehérje megfelelő szakaszát tartalmazó tisztított peptidet a polisztirol mikrotiter lemez celláihoz kötik. Az előzetesen hígított kontroll mintákat és a betegek hígított szérummintáit a különbözõ cellákba adagolják, lehetővé téve bármely jelenlévő gp210 autoantitest immobilizált antigénhez kötõdését. A nem kötődött mintát lemossák és mindegyik cellához enzimjelölt anti-humán IgG konjugátumot adnak. Egy második inkubáció lehetővé teszi, hogy az enzimjelölt anti-humán IgG minden olyan, a beteg mintájából származó antitesthez hozzákötődjön, amely korábban a cellához kötődött. Az összes megkötetlen enzimjelölt anti-humán IgG lemosása után a megmaradó enzimaktivitást kromogén szubsztrát hozzáadásával, és a kialakuló szín intenzitásának mérésével határozzák meg. A teszt spektrofotometriával értékelhető oly módon, hogy a betegminták celláiban kialakult szín intenzitását mérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirol mikrotiter ELISA lemez, tisztított gp210 peptid antigénnel bevonva (12-1 x 8 cella) tartókerettel, deszikkánst tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA negatív kontroll, 1 ampulla tartósítószert és humán szérumot tartalmazó puffer, gp210 1

elleni antitestek nélkül, előhígítva, 1,2 ml. 3. gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint gp210 elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml. 4. gp210 ELISA erősen pozitív kontroll, 1 ampulla tartósítószert, valamint gp210 elleni humán szérum antitesteket tartalmazó puffer, előhígítva, 1,2 ml. 5. HRP mintahígító, 1 üveg rózsaszín, tartalmaz: Tris-pufferolt sóoldatot, Tween 20-at, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat, 50 ml. 6. HRP mosókoncentrátum, 1 üveg, 40-szeres koncentrátum - vöröses színű, tartalmaz: Trispufferolt sóoldatot és Tween 20-at, 25 ml. A hígítási javaslatok a Módszerek fejezetben találhatók. 7. HS HRP IgG konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg lilás színű, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10 ml. 8. TMB kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10 ml. 9. HRP top oldat, 0,344 M kénsav, 1 üveg színtelen, 10 ml. Figyelmeztetések 1. FIGYELMEZTETÉS: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0,02% kloramfenikol) tartalmaz a mintahígítóban, a kontrollokban és a konjugátumban, amelyet Kalifornia államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során ehhez a termékhez felhasználtak, az FDA által jóváhagyott módszerekkel ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve. Egy teszt módszer sem tud tökéletes bizonyosságot szolgáltatni afelől, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az gp210 ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 24 3. Az oldatok stabilizálására nátrium-azidot használtak. A nátrium-azid egy méreg, ami lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium-azid ólom- vagy réztartalmú vízvezetékcsövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azidokat képezve. Ha a reagensek maradványait a lefolyóba önti, az azid-képződés megakadályozása céljából öblítse le nagy mennyiségű vízzel. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB kromogén olyan irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP stop oldat hígított kénsav oldatot tartalmaz. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. A reagensekkel végzett műveletek során használjon megfelelő személyi védőeszközöket. 8. A kicseppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolításakor tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Óvintézkedések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek más termékekkel történő helyettesítése téves eredményekhez vezethet. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA cellákból nem megfelelõ pontosságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. A teszt adaptációja automatikus mintakezelő rendszerek, vagy más folyadékkezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja a manuális módszerhez képest. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az alkalmazott automatizált rendszer validálása, annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt teljesítményét több tényezõ befolyásolhatja. Ilyen a reagensek kezdeti hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványok az ELISA lemez celláiból történő eltávolításának alapossága, a kiértékeléshez használt fotométer, illetve az inkubációs idők hossza. A kapott eredmények megbízhatóságának és reprodukálhatóságának érdekében nagy gondot kell fordítani a következetességre. 6. A protokoll szigorú betartása javasolt. 7. A mikrotiter csöveket és deszikkánst tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt pontosságának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak ugyanazon csövének bizonyos idõ elteltével két- vagy többszöri használata elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. Az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt a HRP konjugátum kémiailag szennyeződhet. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítőszerek, alkohol vagy detergensek maradványai idővel a HRP konjugátum lebomlását okozzák. Kémiai tisztítószerek/fertőtlenítőszerek használata után a készülékeket és az eszközöket alaposan le kell öblíteni. 2

Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem fagyasztható. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csövek a deszikkánssal együtt a fóliatasakot biztonságosan lezárva 2-8 C között tárolandók. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérumminták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják a mérési eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza le és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A lefagyasztott mintákat a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitban rendelkezésre álló anyagok 1 gp210 ELISA mikrotiter lemez (gp210 ELISA microwell plate), (12-1 x 8 cella) tartókerettel 1 1,2 ml előhígított ELISA negatív kontroll (ELISA Negative Control) 1 1,2 ml előhígított gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontroll (gp210 ELISA Low Positive) 1 1,2 ml előhígított gp210 ELISA erősen pozitív kontroll (gp210 ELISA High Positive) 1 50 ml HRP mintahígító (HRP Sample Diluent) 1 25 ml HRP mosókoncentrátum, 40-szeres koncentráció (HRP Wash Concentrate) 1 10 ml HS HRP IgG konjugátum (HRP IgG Conjugate), (kecske) anti-humán IgG 1 10 ml TMB kromogén (TMB Chromogen) 1 10 ml HRP stop oldat (HRP Stop Solution) 0,344 M kénsav További szükséges anyagok, melyeket a kit nem tartalmaz Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500 µl méréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4 ml térfogattal Desztillált vagy ioncserélt víz 1 l-es edény az HRP mosókoncentrátum hígításához Olyan mikrotiter lemez leolvasó, ami képes OD mérésre, 450 nm-en (illetve 620 nm-en a két hullámhosszon történő méréshez) Módszer Mielőtt hozzákezd 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosókoncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosókoncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez adja. Ha nem egyszerre kerül a teljes lemez felhasználásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó cellánként adjon 2,0 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez. A hígított puffer 2 8 C között tárolva 1 hétig stabil. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5 µl mintát 500 µl HRP mintahígítóhoz. A hígított mintákat az elkészítésüket követő 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a gp210 ELISA erősen pozitív kontrollt és az ELISA negatív kontrollt. 4. A gp210 antitestek jelenlétének vagy hiányának tetszõleges egységekben való meghatározásához használjon mindhárom kontroll méréséhez két-két cellát, és minden betegminta méréséhez egy vagy két cellát. A betegmintákból párhuzamos minták (duplikátumok) meghatározását javasoljuk. A teszt kivitelezése 1. A TESZT MEGKEZDÉSE ELŐTT VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBAHŐMÉRSÉKLETET (20-26 C). Helyezze a szükséges számú cellát/csövet a keretbe. A fel nem használt csöveket haladéktalanul tegye vissza a deszikkánst tartalmazó fóliatasakba és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a cellák minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100-100 µl-t az előhígított gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a gp210 ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított betegmintákból a cellákba. Fedje be és 30 percig szobahőmérsékleten inkubálja a lemezeket, egy vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta adagolása után kezdődik. 3

3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes cella tartalmát. Adjon 200-300 µl hígított HRP mosó puffert minden egyes cellához, majd ezt is szívassa le. Ismételje meg ezt az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen, finoman ütögetve tökéletesen távolítsa el az utolsó mosás után visszamaradt folyadékot. Nagyon fontos, hogy a cellák minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. Leszíváskor a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet tartsa be. 4. Minden egyes cellához adjon 100 μl HS HRP IgG konjugátumot. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között, és a helyes laboratóriumi eljárásoknak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a mérés elvégzéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a cellákat 30 percig úgy, mint a második lépésben. 5. Mosás: Ismételje meg a 3. lépést. 6. Adjon 100 µl TMB kromogént minden egyes cellába, és inkubálja sötét helyen, 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100 µl HRP stop oldatot minden egyes cellába. A HRP stop oldat adagolásakor ugyanazt az idõzítést és sorrendet tartsa, amit a TMB kromogén esetében alkalmazott. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, hogy a cellák tartalma alaposan összekeveredjen. 8. Olvassa le minden egyes cella abszorbancia (OD) értékét 450 nm-en, a reakció leállítását követő egy órán belül. Ha bikromatikus mérést kíván végezni, referencia hullámhossznak használja a 620 nm-t. Minőség-ellenőrzés 1. Futassa együtt a gp210 ELISA mérsékelten pozitív, a gp210 ELISA erősen pozitív és az ELISA negatív kontrollt minden egyes betegminta sorozattal annak ellenőrzésére, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is megfelelõen mûködik. 2. Ne feledje, hogy mivel a gp210 ELISA mérsékelten pozitív, gp210 ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll is elõhígított, ezért egyikük sem kontrollálja a minta hígításával kapcsolatos lépéseket. 3. Kiegészítő kontrollok is használhatók a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelő módon. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérumminták szétosztásával, és -20 C alatt történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit valósnak tekinthessük, valamennyi alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított gp210 erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell legyen, mint az előhígított gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, ami nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított gp210 ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 1,0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0,2- nél. c. A gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy nagyobbnak kell lennie, mint 0,25. d. Az ELISA negatív kontroll és a gp210 ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek alapvetõ hibájának jelzésére szolgál. Az gp210 ELISA erősen pozitív kontroll nem garantálja a precizitást a teszt diagnosztikai küszöbértékének közelében. e. A felhasználó az adott minõség-ellenõrzési eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A2 -ban találhat. 25 Az eredmények kiszámítása Először határozza meg az egyes párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután kiszámítható az egyes minták reaktivitása úgy, hogy a minta OD átlagát elosztja a gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontroll OD átlagával. Majd az így kapott eredményt megszorozza a gp210 ELISA mérsékelten pozitív kontroll címkéjén feltüntetett egységek számával. Minta OD Minta értéke = x gp210 ELISA mérsékelten pozitív (egységek) gp210 ELISA mérsékelten pozitív OD (egységek) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának hígítási sorát kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a minta antitest titerértékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. 4

Az eredmények értelmezése Az ELISA teszt a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, valamint képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alább mutatott értékek csak javaslatok. Minden egyes laboratóriumnak meg kell határoznia a saját referencia tartományait, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a saját eljárásaiknak megfelelően. A mintákat negatívként, (negatív gp210 elleni IgG antitestre), nem egyértelműként, vagy pozitívként (gp210 elleni IgG antitestet detektáltak) értékelik az alábbi táblázat szerint. Negatív 0.0-20.0 Egység Nem egyértelmű 20,1 24,9 Egység Pozitív 25 Egység 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában gp210 antitestek vannak, és felveti az elsődleges biliaris cirrhosis fennállásának lehetőségét. 2. Azok a minták, melyekben az gp210 IgG antitest koncentráció nem egyértelmű, alkalmatlanok az antitest státusz megállapítására. Ha az eredmény ismételt vizsgálattal is a kétes tartományba esik, az eredményt kétesként jelentjük, és/vagy a vizsgálatot frissen vett mintából megismételjük. 3. A negatív eredmény azt jelzi, hogy nincs jelen gp210 elleni IgG antitest, vagy a teszt kimutatási határa alatt van. 4. Azokról a mintákról, melyek lemezleolvasó mérési tartománya feletti OD értéket adnak úgy kell jelenteni, hogy a mérhető legmagasabb OD értéknél nagyobb értéket el kell osztani a mérsékelten pozitív kontroll OD-jának 25-szörösével, vagy egy számítható érték érdekében a mintát hígítani kell, majd újramérni. 5. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi megállapítást: Az itt következő eredményeket az INOVA QUANTA Plex TM gp210 ELISA használatával kaptuk. Más gyártók tesztjével kapott gp210 értékek ettől eltérőek lehetnek, ezek fel nem cserélhetőek. A közölt IgG érték mennyisége nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. A módszer korlátai 1. Egy negatív gp210 eredmény nem zárja ki az elsődleges biliaris cirrhosis lehetőségét. 2. Egy negatív gp210 antitest eredmény nem zárja ki az gp210 antitestek jelenlétének lehetőségét, mivel lehetséges, hogy az antitest koncentrációja a teszt kimutatási küszöbértéke alatt van. 3. A pozitív eredmény mindössze az gp210 antitest jelenlétét jelzi, és nem feltétlenül jelent elsődleges biliaris cirrhosist. 4. Az elsődleges biliaris cirrhosis diagnózisához a beteg demográfiai jellemzőinek, klinikai tüneteinek és más diagnosztika vizsgálatainak összegzése szükséges. 5. Ezen teszt eredményeit a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 6. A teszt működési jellemzői a szérumtól eltérő mátrixok vizsgálatára nincsenek kidolgozva. Várható értékek A PBC előfordulási sávja, becslések szerint 2 per 100 000 főtől (Japánban és Ausztráliában) a 40 per 100 000 főig (az Egyesült Államokban) terjed. 7,8 Az IFA, western blot és különböző ELISA módszereket alkalmazó vizsgálatok, azt sugallják, hogy a gp210 antitestek a PBC betegek mintegy 26%-ában jelen van. 15 A gp210 PBC specificitása közel 100%-os. 12 Referencia tartomány gp210 antitestek jelenléte tünetmentes, egészséges személyekben gp210 antitest kimutatás céljából QUANTA Lite TM gp210 ELISA teszten vizsgáltak egy 236 tünetmente, egészséges személyekből összeállított panelt. Életkor és nemi adatok 188 minta esetén álltak rendelkezésre, csak nemi adatok 28 minta esetén és 20 minta esetén nem álltak rendelkezésre adatok. 55 férfi és 78 nő tartozott a 17-től 73 évesig terjedő korcsoportba. Az assay specificitása 100% (236/236) volt. Ezen populáció átlag értéke 3,7 egység volt. Médián értéke pedig 3,4 egység. Egy 16,5 egységes mintát kihagyva, a többi 235 minta értéke alacsonyabb volt, mint 9,2 egység. Specifikus működési jellemzők A QUANTA Lite TM gp210 ELISA teszt összesen 343 PBC és 5 PBC/Autoimmun hepatitisz átfedő mintákon vizsgált gp210 antitest kimutatási gyakoriságát az 1. táblázat mutatja be. Az elemzés 3 klinikai csoport QUANTA Lite TM gp210 ELISA tesztel nyert eredményeit foglalja össze. A teszt teljes szenzitivitása 26,1% (91/348) volt. A teszt specificitása 100% volt. A pozitív prediktív érték 100%, míg a negatív prediktív érték 62% volt. Az összes nem-pbc vagy PBC/AIH esetén az átlag 3,59 egység, a medián 3,71 egység volt. 5

1. táblázat A QUANTA Lite TM gp210 ELISA teszt szenzitivitása QUANTA Lite TM gp210 ELISA Betegcsoport n= Poz.Nem egyért.neg. PBC 343 89 2 252 PBC/AIH 5 2 0 3 Összes 348 91 2 255 Érzékenység: 26,1% (91/348) Az assay specifitásának meghatározása érdekében a QUANTA Lite TM gp210 ELISA teszten 183 nem- PBC májbeteg, autoimmunbeteg és egyéb állapotú személy szérumát vizsgálták. Mint ahogy a 2. táblázat is mutatja nem volt egyetlen nem-pbc vagy nem-pbc/aih minta sem, amelyet a QUANTA Lite TM gp210 ELISA teszt pozitívnak értékelt volna. A QUANTA Lite TM gp210 assay teljes specificitása, beleértve az egészséges kontrollokat és a nem-pbc szérumokat is, 100% (419/419) volt. 2. táblázat A QUANTA Lite TM gp210 ELISA teszt specificitása QUANTA Lite TM gp210 ELISA Betegcsoport n= Poz.Nem egyért.neg. HBV 35 0 0 35 HCV 42 0 0 42 SLE 28 0 0 28 AIH1 9 0 0 9 AIH2 7 0 0 7 Rheumatoid Arthritis 56 0 0 56 Primer szklerotizáló cholangitis 1 0 0 1 Szkleroderma 5 0 0 5 Normál 236 0 0 236 Összes 419 0 0 419 Specificitás (összes nem-pbc vagy PBC/AIH minta) = 100 % (419/419) Pozitív prediktív érték: 100% Negatív prediktív érték: 62% Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay teljesítményt 10 minta, egyenként hatszori futtatásából értékelték ki. 3. táblázat A QUANTA Lite TM gp210 ELISA intra-assay teljesítménye A B C D E F G H I J középérték 83,5 113,8 140,8 5,3 5,4 18,6 29,3 21,0 25,0 25,8 SD 2,0 0,9 3,5 0,6 0,6 0,9 0,7 1,2 0,9 1,2 CV % 2,4 0,8 2,5 11,2 11,8 4,8 2,5 5,5 3,0 4,8 Az inter-assay változás vizsgálata során 3 napig duplikátumban teszteltek 5 mintát, naponta kétszer (reggel és délután egyszer-egyszer). 4. táblázat A QUANTA Lite TM gp210 ELISA inter-assay teljesítménye 1 2 3 4 5 középérték 82,9 84,8 117,6 147,0 5,8 SD 2,1 3,0 3,9 6,1 1,0 CV % 2,5 3,5 3,3 4,1 12,1 6

Hivatkozások 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335: 1570-1580, 1996. 2. Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31: 1005-1013, 2000. 3. Talwalkar, J. A., Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362: 53-61, 2003. 4. Vergani, D., Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98: 241-243, 2003. 5. Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F., James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30: 402-407, 1999. 6. Agarwal, K., Jones, D. E., Bassendine, M. F. Genetic susceptibility to primary biliary cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 11: 603-606, 1999. 7. Kim, W. R. et al. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119: 1631-1636, 2000. 8. Feld, J. J., Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18: 1118-1128, 2003. 9. Metcalf, J. V. et al. Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet 348: 1399-1402, 1996. 10. Miyakawa, H. et al. Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMAnegative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34: 243-248, 2001. 11. Moteki, S. et al. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 24: 97-103, 1996. 12. Worman, H. J., Courvalin, J. C. Antinuclear antibodies specific for primary biliary cirrhosis. Autoimmun Rev 2: 211-217, 2003. 13. Muratori, P. et al. Characterization and clinical impact of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis. Am J Gastroenterol 98: 431-437, 2003. 14. Fritzler, M. J., Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3: 87-113, 2002. 15. Miyachi, K. et al. Profile and clinical significance of anti-nuclear envelope antibodies found in patients with primary biliary cirrhosis: a multicenter study. J Autoimmun 20: 247-254, 2003. 16. Bandin, O. et al. Specificity and sensitivity of gp210 autoantibodies detected using an enzymelinked immunosorbent assay and a synthetic polypeptide in the diagnosis of primary biliary cirrhosis. Hepatology 23: 1020-1024, 1996. 17. Nickowitz, R. E., Wozniak, R. W., Schaffner, F., Worman, H. J. Autoantibodies against integral membrane proteins of the nuclear envelope in patients with primary biliary cirrhosis. Gastroenterology 106: 193-199, 1994. 18. Itoh, S. et al. Autoantibodies against a 210 kda glycoprotein of the nuclear pore complex as a prognostic marker in patients with primary biliary cirrhosis. J Gastroenterol Hepatol 13: 257-265, 1998. 19. Invernizzi, P. et al. Autoantibodies against nuclear pore complexes are associated with more active and severe liver disease in primary biliary cirrhosis. J Hepatol 34: 366-372, 2001. 20. Miyachi, K. et al. A male patient who developed late-onset primary biliary cirrhosis presenting with antinuclear envelope antibodies. Mod Rheumatol 12: 246-249, 2002. 21. Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V., James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123: 1044-1051, 2002. 22. Shibata, M. et al. Detection of anti-gp210 antibodies in primary biliary cirrhosis by enzyme-linked immunosorbent assay with a synthesized polypeptide. Progress in Hepatology 5: 125-133, 1999. 23. Tartakovsky, F., Worman, H. J. Detection of gp210 autoantibodies in primary biliary cirrhosis using a recombinant protein containing the predominant autoepitope. Hepatology 21: 495-500, 1995. 24. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 25. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Internal Quality Control: Principles and Definitions; Approved Guideline. NCCLS Document C24-A2 11(6): 1991. 7

A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628995HUN January 2009 Revision 0 8