Tömegspektrometriás módszerek a klinikai kémiában Takáts Zoltán SE I.sz. Gyermekklinika
Tömegspektrometria Mi az? Ionizáció Molekulák a kondenzált fázisban Gázfázisú ionok Töltés Tömeg Gázfázisú ionok Intenzitás Tömeganalízis Tömeg / töltés
A tömegspektrum Egyszeres töltésű molekulaionok Intenzitás Kétszeres töltésű molekulaion Egyszeres töltésű adduktion Koncentráció! Izotópcsúcs Molekulatömeg! Tömeg / töltés
Tandem tömegspektrometria Első tömeganalízis Fragmentáció Második tömeganalízis Detektor A fragmentáció során keletkezett fragmens ionok m/z eloszlása szerkezeti információt hordoz, valamint alkalmas a vegyületek azonosítására is. Molekulaszerkezet felderítése Kvalitatív ill. kvantitatív analitika
Tömegspektrometria felhasználási területei Szerkezetkutatás általános szerkezetmeghatározás metabolizmus vizsgálatok fehérjeszekvenálás fehérjék poszttranszlációs módosításainak meghatározása Analitika Nyomnyi mennyiségben jelen levő szerves vegyületek meghatározása gyógyszerszint meghatározás anyagcseretermékek szintjének meghatározása toxikológiai alkalmazások
Tömegspektrometriásan vizsgálható minták Megfelelő mintaelőkészítéssel lényegében tetszőleges minta vizsgálható Minta elpárologtatás extrakció oldószercsere szűrés gázkromatográfia származékképzés folyadékkromatográfia elektroforézis... MS A tömegspektrometriában általában a mintaelőlészítés a szűk keresztmetszet Ha ezt tágítjuk, tágul az alkalmazhatóság köre A mintaelőkészítési eljárások minden esetben invazívak
Ionforrás Tömespektrométer Analizátor Detektor
Ionizációs módszerek 1. Hagyományos technikák Vákuumban történő ionizáció Gázhalmazállapotú minta GC csatolás Elektronütköztetéses ionizáció M ionok Fragmentáció Spektrumtár alapján kvalitativ analizis lehetősége Kémiai ionizáció Csak molekulaion Molekulatömeg megállapitás MS/MS segitségével szerkezeti információ Deszorpciós technikák Kondenzált fázisú minták ionizációja Nem igényli a minták elpárologtatását Nincs keresztszennyezés! SIMS Nagy sebességű primer ionsugár Jó térbeli felbontás Gyenge érzékenység MALDI Lézer Felület ún. mátrixvegyülettel boritott Gyengébb térbeli felbontás
Ionizációs technikák Hagyományos 1. Elpárologtatás Elektronütköztetés 2. Ionizáció elektron 70 ev Fragmentáció Csak illékony molekulák Fragmentációs mintázatból azonosítás Nem illékony molekulák csak származékként, de MW < 1000!!!!
GC-MS Gázkromatográfia MS detektálással Származékképzés nélkül csak illékony és termikusan stabil anyagok Származékképzés után bármilyen kis molekula EI/CI ionizáció Nagyon jó elválasztás Alkalmazási területek Környezetanalitika Élelmiszeranalitika Lipidomika (származékképzéssel) Diagnosztika Abszolút érzékenység : fg pg tartomány Lineáris tartomány akár 5 nagyságrend EI spektrumok kvalitativ analízis lehetősége Általában bonyolult mintaelőkészítést igényel Csak illékony komponensek lehetnek a mintában Származékképzés Kromatográfia Kapilláris GC, 0,1-0,25 mm ID oszlopok
Modern technikák Ionizációs technikák Mátrix segített lézer deszorpciós ionizáció (MALDI) lézer Tetszőleges molekuláris komponens vizsgálható (vízmolekula - egész vírus) Nem kvantitatív (Bár ) Elsősorban kvalitatív, proteomikai analízis
MALDI-MS Matrix assisted laser desorption ionization Általában UV (nitrogén vagy Nd-YAG) lézer, néha IR (CO 2 v. Er-YAG) lézer Mátrix általában aromás karbonsav Mintákat oldatfázisban keverjük el 1000 X 10.000 X mátrixfelesleggel Tetszőleges, a mátrix tömegénél nehezebb molekula vizsgálható Elsősorban bottom-up proteomika Nem kvantitatív Érzékenység fg pg tarományban Mintaelőkészítés automatizálható - High throughput analitics Egyéb alkalmazási területek: Intakt fehérje vizsgálat Oligoszacharid és glikopeptid vizsgálatok Oligonukleotid analízis (High throughput SNP detektálás) Kémiai képalkotás (imaging) Polimer analitika
Ionizációs módszerek 2. Spray technikák Atmoszferikus nyomású ionizáció Folyadékhalmazállapotú minta LC csatolás Electrospray ionizáció Vezetőképes folyadék elektrosztatikus porlasztása Molekulaionok v. Komplexek Többszörösen töltött ionok Csak oldatban eleve ionként előforduló specieszek Atmoszferikus nyomású kémiai ionizáció Pneumatikus porlasztás Korona kisülés Spektrálisan hasonló a kémiai ionizációhoz Mérsékelten poláros, termikusan stabil vegyületek Egyéb technikák Atmoszferikus nyomású fotoionizáció Térdeszorpciós ionizáció Direkt ionizációs technikák DESI DART JeDI ASAP
Elektrospray ionizáció (ESI) Electrospray tű Csepp kialakulás Coulomb hasadás Oldószer párolgása Ion evaporáció
LC-MS HPLC elválasztás MS detektálással ESI vagy APCI ionizáció Általában kis molekulák (MW<5 kda) kvantitatív meghatározása Gyógyszeranalitika ADME TDM Proteomika Metabolomika Érzékenység : LLOQ ~ 1-10 pg általában Mintaelőkészítés SPE Oldószeres extrakció Kromatográfia: RP-HPLC (ESI, APCI) (NP-HPLC (APCI)) CE
Kvantitatív meghatározások Külső kalibráció Hígítási sor az analitból, az eredeti mátrixban A mintákkal azonos mintaelőkészítés Belső standard Kémiailag hasonló vegyület, ideálisan stabil izotóp ( 2 H, 13 C, 15 N, etc.) jelzett originális vegyület Tömegspektrométer képes szelektíven detektálni a nehéz izotóppal jelzett iont Kvantitatív meghatározásoknál mindig külső kalibráció belső standard
Tömegspektrometriai klinikai Gyógyszer-szintmérés Toxikológia kémiai alkalmazásai Metabolikus komponensek meghatározása Hormonok, egyéb jelátviteli komponensek meghatározása Fehérjék azonosítása Fehérjék funkcionális és szerkezeti jellemzése
Gyógyszerszintmérés Gyógyszermolekulák mennyiségi meghatározása Szérum, vizelet, teljes vér, liquor Szűk terápiás tartomány < 1 nagyságrend Gyors metabolizmus Nagy egyéni variancia Személyreszabott orvoslás (Personalized medicine) Immunszuppresszánsok Sirolimus, Tacrolimus, Cyclosporin A Rejekció Fertőzés Tirozin kináz inhibitorok Imatinib, Dasatinib, Gefitinib Nagy dózis potenciális vese és májkárosodás
Gyógyszerszintmérés - módszertan Mintaelőkészítés Fehérjementesítés Kicsapás acetonitrillel, triklór ecetsavval, etc. Ultraszűrés 3 kda-os szűrővel SPE Lipidmentesítés (csak teljes vér esetén) Extrakció kloroformmal SPE fordított fázison Extrakció Gyakran együtt a fehérje- ill. Lipidmenetsítéssel Oldószeres extrakció Szilárd fázisú extrakció (fordított fázis vagy ioncsere) Oldószercsere Minta a HPLC módszernek megfelelő összetételű és ph-jú oldószerben kell legyen
Gyógyszerszintmérés módszertan Gázkromatográfia tömegspektrometria Illékony vagy könnyen illékonnyá tehető gyógyszermolekulák esetén Egyes szteroidok, lipid jellegű komponensek Ritka alkalmazás, inkább doppinganalitika HPLC tömegspektrometria Általánosságban használt Lényegében bármilyen gyógyszermolekula esetében
Gyógyszerszintmérés - módszertan HPLC tömegspektrometria Általában fordított fázisú HPLC Oktadecil-szilika, oktil-szilika Gyógyszermolekulák általában alacsony polaritásúak Gradiens elúció 5% szerves oldószer - 95% szerves oldószer Metanol / víz, acetoniril / víz Illékony puffer, pl. ammónium acetát Gradiens végig kell menjen! (reziduális lipidek)
Metabolikus komponensek meghatározása Anyagcsere diagnosztika Veleszületett anyagcserebetegségek diagnosztikája Máj, ill. vesefunkció vizsgálata Kvantitatív vizsgálatok Kromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria Általában célzott vizsgálat, pl. aminosavak meghatározása Szemi-kvantitatív vizsgálatok Közvetlen tandem tömegspektrometria Általában szűrővizsgálatok, vagy szűrővizsgálatok megerősítő vizsgálatai
Tömegspektrometria az endokrionológiában Szteroid hormonok meghatározása Aminosavszármazék hormonok meghatározása Peptidhormonok meghatározása
Szteroid hormonok meghatározása
Szteroid hormonok meghatározása GC-MS technikák Extrakció Kombinált származékképzés Hidroxilamin BSTFA Gázkromatográfiás elválasztás Pozitív ion EI detektálás Kvantifikálás: Stabil izotópjelzett standardokkal Érzékenység: LLOQ ~ 1-10 pg/ml Időigény: 1-1,5 h / minta 1. androsterone 2. dehydroepiandrosterone 3. 17-α-estradiol 4. estrone 5. 17-β-estradiol 6. testosterone
Szteroid hormonok meghatározása LC-MS/MS technikák Mintaelőkészítés Oldószeres extrakció Szilárd fázisú extrakció Fordított fázisú (oktadecilszilika) HPLC, gradiens elúció ESI vagy APCI ionizáció, pozitív ion mód Protonaffinitás problémák! Paraméterek: Kvantifikálás: izotópjelzett belső standard LLOQ: 1 pg/ml 5 ng/ml Időigény: 2-10 min/minta (1) cortisone (2) cortisol (3) 21-dexycortisol (4) cortiscosterone (5) 11-deoxycortisol (6) androstenedione (7) dexycortiscosterone (8) 17-hydroxy progesterone (9) progesterone (10) pregnenolone
Congenitalis adrenalis hyperplasia Számos országban része az újszülöttkori szűrőprogramnak (Magyarországon nem) Szűrés 17-OH Progesterone Immunkémiai módszerrel (ELISA) Magas fals pozitív ráta (akár 3%) Mátrix hatás, stress eredetű 17OHP emelkedés MS módszer nem jön számításba 2nd tier testing LC-MS alapú szteroid profil vizsgálat Szűrésre beérkezett szárított vércsepp mintából Lacey, J. M. et al. Clin Chem 2004;50:621-625 Egészséges Fals pozitív CAH 1. Kortizon 2. Androszténdion 3. d8-17ohp 4. 17-OHP
Katecholaminok és egyéb aminosav származékok meghatározása Kísérleti jelleggel Általában LC-MS/MS technikával Módszerek érzékenysége megfelelő, de ezek a komponensek HPLC-UV módszerrel is meghatározhatóak Példák: Adrenalin/Noradrenalin meghatározása vizeletben T3, T4 meghatározása szárított vércsepp mintában
Fehérjék tömegspektrometriás vizsgálata Azonosítás Emésztés tripszinnel (Tripszin Arg és Lys után vág, tehát minden keletkező peptid tartalmaz legalább egy protonálható aminosavat) Triptikus peptidek MS és MS/MS vizsgálata Adatbázis keresés Szekvencia meghatározás Átfedő peptidfragmensek szekvenálása MS/MS módszerrel Genetikai információ felhasználása (ti. részleges aminosav szekvenciához tartozó DNS szekvencia keresése) Poszt Transzlációs Módosítások Foszforiláció, glikoziláció, etc. Ismert aminosav szekvenciájú peptidek MS és MS/MS vizsgálata Enzim assay Szubsztráttal történő inkubálás Szubsztrát vagy termék visszamérése LC-MS módszerrel
Intakt fehérjemolekulák ESI-MS vizsgálata Információ: MW Térszerkezet Komplexképzés Mintaelőkészítés: Puffercsere 0,1 10 mm ammónium acetátra Módszer Nanospray ESSI
Bottom-up Tömegspektrometria proteomikai alkalmazásai 2 D elektroforézis Kivágott folt triptikus emésztése MALDI-MS v. MALDI- MS/MS (esetleg ns- MS/MS) Triptikus emésztés 2D nhplc elválasztás ESI (ns) detektálás, estleg off-line MALDI Információ: szekvencia, PTM Top-down Fehérjetisztitás SEC UF Etc. ESI ionizáció Fehérjeion izoláció a gázfázisban Disszociáció Elektronbefogás (ECD) Elektrontranszfer (ETD) Ütközéses aktiváció Infra fotonos disszociáció (BIRD v. IRMPD)
Kémiai képalkotás MS módszerrel Deszorpciós ionizációs technikák MALDI SIMS DeszorpciósESI Mikroszkópos metszetek vizsgálata Pixelenként veszünk fel spektrumot Pixel élhossza 5-50 um Elsősorban biomarker kutatás Lipid jellegű markerek Eicosanoidok Foszfolipidek Fehérjék, peptidek
Relative Abundance A 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 MS kémiai kép 137.0232 230.9454 329.0060 366.9616 444.0924 Hypofizis kémiai képalkotás B Posterior lobe 500 µm Anterior lobe 500 µm 534.2953 562.3268 632.3549 772.5262 734.5707 798.5416 Optikai kép 820.5265 848.5573 896.6049 964.5095 1084.4458 1045.4000 1193.3623 200 400 600 800 1000 1200 m/z Egy adott pixelhez tartozó tömegspektrum Egér agyalapi mirigy metszet MALDI módszerrel készült kémiai képe Piros: Vazopresszin Kék: Foszfokolin Zöld: Foszfoinozitol Felbontás: 10 m Optikai kép a mérést követően készült Toluidinkék festés
Köszönöm a figyelmet!