GENETIKAI INSTABILITÁS VIZSGÁLATA A B-SEJTES KRÓNIKUS LYMPHOCYTÁS LEUKÉMIA RICHTER TRANSZFORMÁCIÓJA SORÁN PhD értekezés Dr. Fülöp Zsolt Ferenc Témavezeto: Dr. Matolcsy András Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Budapest, 2005
TARTALOM I. ÖSSZEFOGLALÁS II. ABSTRACT III. BEVEZETÉS IV. A B-CLL PATOLÓGIAI JELLEMZOI IV.1. A B-CLL hisztológiai megjelenése IV.2. A B-CLL immunhisztológiai megjelenése IV.3. A B-CLL patogenetikai jellemzoi és sejtes eredete V. A RICHTER-SZINDRÓMA JELLEMZOI V.1. A lymphoma progresszió általános terminológiája V.2. A Richter-szindróma definíciója V.3. A Richter-szindróma hisztológiája és immunfenotípusa V.4. A B-CLL és a Richter-szindróma klonális kapcsolata V.5. A Richter-szindrómában eloforduló genetikai zavarok VI. MIKROSZATELLITA SZEKVENCIÁK VI.1. A mikroszatellita szekvenciák genomiális szervezodése, funkciója VI.2. A mikroszatellita instabilitás és a mismatch repair gének VII. DNS METILÁCIÓ VII.1. A metilált DNS szekvenciák szervezodése a genomban VII.2. DNS metiláció és transzkripció gátlás VII.3. A mismatch repair gének DNS metiláció általi inaktivációja tumoros szövetekben VIII. A MIKROSZATELLITA INSTABILITÁS ÉS A MISMATCH REPAIR GÉNEK SZEREPE HEMATOLÓGIAI MALIGNITÁSOKBAN IX. CÉLKITUZÉSEK X. ANYAG ÉS MÓDSZER X.1. Szövettani minták X.2. DNS izolálás X.3. A biopsziás mintapárok klonalitásának igazolása X.4. Mikroszatellita instabilitás vizsgálatok X.5. A hmlh1 és a hmsh2 gén vizsgálata Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) módszerrel X.6. A hmlh1 gén promoter-metiláció vizsgálata XI. EREDMÉNYEK XI.1. Klonális kapcsolat a biopsziás mintapárok között XI.2. Mikroszatellita analízis XI.3. A hmlh1 és a hmsh2 gén PCR-SSCP vizsgálata IX.4. A hmlh1 gén promoter-metiláció vizsgálata XII. MEGBESZÉLÉS XIIII. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE XIV. IRODALOMJEGYZÉK XV. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE XVI. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS - 2 -
I. ÖSSZEFOGLALÁS A B-sejtes krónikus lymphocytás leukémia (B-CLL) egy indolens lefolyású non- Hodgkin lymphoma (NHL). Az esetek 5-10%-ában a kórkép klinikai progressziót és hisztológiai transzformációt mutathat diffúz nagy B-sejtes lymphomába (DLBL), melyet az irodalom Richter-szindróma, vagy Richter transzformáció néven ismer. Tanulmányunkban azt a kérdést vizsgáltuk, hogy a B-CLL Richter transzformációja során szerepet tölt-e be a mikroszatellita instabilitás (MSI), és az instabilitás kialakulásának hátterében állhat-e a hmlh1 és hmsh2 mismatch repair gének esetleges genetikai alterációja. Vizsgálatainkat tizenkilenc B-CLL-ben szenvedo beteg biopsziás mintapárjain végeztük. Tíz esetben a második mintavétel az elozohöz hasonló szövettani viszonyokat mutatott, kilenc esetben viszont a második biopsziás készítményen a DLBL szöveti képe látszott. A biopsziás mintákból izolált DNS-ben a MSI mértékét nyolc, különbözo kromoszómákon elhelyezkedo mikroszatellita marker polimeráz láncreakción alapuló amplifikációjával mértük fel. A kilenc DLBL-ba transzformálódott szövettani minta közül négy esetben nagyfokú MSI-t mutattunk ki a megelozo B-CLL-bol származó biopsziás mintához képest. A szövettani transzformációt nem mutató B-CLL-bol származó mintapárok közül három esetben alacsony mértéku MSI-t, hat esetben stabil mikroszatellita szekvenciákat mutattunk ki. A hmlh1 és hmsh2 gének egyetlen mintában sem hordoztak szomatikus mutációt a vizsgált régiókban. A kilenc DLBL-ba transzformálódott szövettani minta közül öt esetben a hmlh1 gén promoter szakaszának hipermetilációja egyaránt kimutatható volt a DLBLbol és a megelozo B-CLL-bol származó mintákban. Ezen esetek közül a hmlh1 gén promoterének hipermetilációja négy esetben a vizsgált mikroszatellita markerek nagyfokú, egy esetben pedig alacsony mértéku instabilitásával járt együtt. Eredményeink arra utalnak, hogy a B-CLL Richter transzformációjának egyes eseteiben a hmlh1 gén epigenetikai inaktiválódása által kiváltott genetikai instabilitás hozzájárulhat a B-CLL progressziójához, ugyanakkor a hmlh1 és hmsh2 gének a folyamat során strukturálisan nem érintettek. - 3 -
II. ABSTRACT B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is an indolent non-hodgkin lymphoma that may transform into diffuse large B-cell lymphoma (DLBL). DLBL arising from the transformation of B-CLL is referred to as Richter s syndrome or Richter s transformation. To analyze whether microsatellite instability (MSI) and DNA mismatch repair defects are associated with Richter s transformation, we have performed microsatellite analysis, mutational analysis of the hmlh1 and hmsh2 mismatch repair genes and methylation status analysis of the CpG island of the hmlh1 promoter on serial biopsy specimens from 19 patients with B-CLL. Ten cases of B-CLL showed no histologic alteration in the second biopsy, and nine cases of B-CLL underwent morphologic transformation to DLBL in the second biopsy. Investigating eight microsatellite loci, a high level of MSI was associated with Richter s transformation in four cases of B-CLL, but none of the B-CLL displayed this level of MSI without transformation. Mutations of the hmlh1 and hmsh2 genes were not detected in any of the lymphoma samples. In five cases of Richter s transformation the hmlh1 promoter was hypermethylated both in the B-CLL and in the DLBL samples. Hypermethylation of the hmlh1 promoter associated with high levels of MSI in four cases, and low levels of MSI in one case. These findings suggest that in some cases of Richter s transformation the genetic instability initiated by the defect of the DNA mismatch repair system plays a role in tumor progression. - 4 -
III. BEVEZETÉS A B-sejtes krónikus lymphocytás leukémia (B-CLL) az egyik leggyakoribb klonális lymphoproliferatív betegség, a felnottkori leukémiák 40%-át teszi ki. Klinikailag indolens viselkedésu non-hodgkin lymphoma (NHL), amely leginkább 60-70 éves korban jelentkezik [21, 219]. Incidenciája 3/100000 lakos/év [206]. A B-CLL átlagos túlélési ideje 8-25 év [51, 106], azonban az esetek 5-10%-ában a kórkép kevesebb mint fél év alatt fatális a B-CLL agresszív lymphomába való transzformációja miatt [231]. A B-CLL talaján kialakuló diffúz nagy B-sejtes lymphoma (DLBL) a kórlefolyás akcelerációjával együtt (progresszív lymphadenopátia, láz és fokozott testsúlyvesztés, extranodális manifesztáció) a szakirodalomban Richter-szindrómaként (RS), vagy a B-CLL Richter transzformációjaként ismert a tünetegyüttes elso leírója után [90, 229]. A B-CLL hisztológiai transzformációjának és klinikai progressziójának pontos mechanizmusa nem teljesen ismert. A RS kialakulása számos kromoszomális, illetve génszintu anomáliával járhat együtt. A genetikai aberrációk részben már a B-CLL stádiumban megjelennek, és változatlanul megfigyelhetok a lymphoma transzformációja után is. Ebbe a csoportba tartoznak egyes kromoszóma-deléciók (del 13q14, del 11q22-q23, del 17p13), a 12. kromoszóma triszómiája, valamint a p53 tumorszuppresszor gént érinto mutációk [73]. A B-CLL transzformáció utáni stádiumához további genetikai és epigenetikai eltérések megjelenése kapcsolható. A 8p és a 9. kromoszómát érinto deléciók [15], a p16/ink4a deléciója [215], a C-MYC amplifikációja [6], az A-MYB csökkent expressziója [92], a p27 expressziójának hiánya és a ciklin D1 fokozott expressziója [45] irodalmi adatok szerint a RS kialakulásához társul, B-CLL-re nem jellemzo. Kérdéses, hogy az említett genetikai zavarok között van-e olyan domináns eltérés, amely önmagában elégséges ahhoz, hogy a B-CLL agresszív lymphomába transzformálódjon. Jelenleg nincs olyan ismert genetikai lézió, amely minden egyes RS-ban detektálható, azaz felelos lehetne a B-CLL transzformációjáért. A sejtciklust szabályozó, proliferációt serkento (ciklin D1), és azt gátló (p16/ink4a, p27, p53) fehérjék közti egyensúly felborulása, továbbá a génexpressziót szabályozó transzkripciós faktorok (C-MYC, A-MYB) mennyiségi zavara hozzájárulhat a RS kialakulásához. A heterogén genetikai eltérések jelenléte arra utal, hogy - 5 -
a B-CLL daganatos sejtjei a sejtciklus szabályozásának zavara miatt újabb és újabb genetikai hibákat halmozhatnak fel, általános genetikai instabilitás alakulhat ki bennük, és a szelektív növekedési elonyhöz jutó sejtek végül kialakítják a RS-ra jellemzo agresszív lymphoma képét [45, 175, 194]. A tumorsejteket érinto genetikai instabilitásnak négyféle megnyilvánulási formája lehet: 1. Génamplifikációk: egy meghatározott génszakasz több kópiában való megjelenése, amely 0,5-10 megabázis hosszúságú járulékos örökítoanyagot jelent. A génamplifikációk ismert példája az elorehaladott neuroblastomák 30%- ában az N-MYC amplifikációja [248]. 2. Kromoszóma-transzlokációk: különbözo kromoszóma-szakaszok fúzióját, vagy egy adott kromoszómán belüli, egymástól távol elhelyezkedo DNS-szakaszok összekapcsolódását jelenti. Példaként említheto a C-ABL és a BCR régiók fúziójához vezeto t(9;22) transzlokáció krónikus myeloid leukémiában (CML) [203]. 3. Kromoszómákat érinto számbeli eltérések: egész kromoszómák elvesztése, vagy számfeletti megjelenése tartozik ebbe a csoportba. A genetikai instabilitásnak egyik gyakori megnyilvánulási formája, majdnem az összes humán daganatos betegségben elofordul az ane uploiditás valamilyen formája [186]. 4. DNS-szekvenciát érinto változások: ide sorolhatók a pontmutációk, néhány nukleotidnyi szakaszok deléciója vagy inszerciója és a tandem ismétlodo DNSszakaszok kópiaszámának megváltozása [161]. A DNS bázissorrendjét módosító változások sajátos csoportját képezik a tandem ismétlodo rövid szekvenciák (mikroszatelliták) hosszbeli változásai. A mikroszatelliták hosszbeli változásához vezeto genetikai instabilitás két élesen elkülönítheto osztályba sorolható. Az I. osztályú genetikai instabilitás dinamikus expanzió (DiE), vagy dinamikus mutáció néven ismert a szakirodalomban [267]. A DiE alapvetoen a CAG és CCG trinukleotidokból álló repetitív elemek expanzióját jelenti a csírasejtekben. Amennyiben az expanzió során az ismétlodések száma egy küszöbérték fölé emelkedik, akkor az adott mikroszatellita - kromoszomális lokalizációjának megfeleloen - fragilis - 6 -
kromoszóma-régiók megjelenéséhez (és az ennek megfelelo tünetegyüttesekhez, például fragilis X szindrómához), vagy neurodegeneratív kórképek (Huntington-kór, I. típusú spinocerebelláris ataxia, myotóniás dystrophia) kialakulásához vezet [8, 267]. A DiE jellegébol fakadóan ezekre a betegségekre jellemzo az anticipáció: a kórkép egyre fiatalabb életkorban és súlyosabb formában jelentkezik az egymást követo generációkban [181]. A II. osztályú genetikai instabilitás - a klasszikus értelemben vett mikroszatellita instabilitás (MSI) - egyenlo arányban bekövetkezo deléciókat és inszerciókat jelent a szomatikus sejtekben. Nemcsak trinukleotid mikroszatellitákat, hanem mono-, di- és tetranukleotid ismétlodéseket is érint. A MSI-t eloször colorectalis tumorokban figyelték meg [1, 129, 272], és azóta a legtöbb szolid tumorban kimutatták [7]. A DiE-vel szemben a MSI nem vezet anticipációhoz. Annak ellenére, hogy a DiE és a MSI egyaránt vezethet repetitív DNS szekvenciák instabilitásához, mechanizmusuk meroben eltér egymástól. A MSI okaként a DNS mismatch repair (MMR) aktivitás elvesztése jelölheto meg [137, 211], a DiE viszont MMR-tol függetlenül következik be, valószínuleg a CAG és CCG mikroszatelliták által facilitált hajtukanyar-szeru DNS struktúrák megjelenése és azok stabilizálódása miatt [75, 91]. Epidemiológiai és kísérletes bizonyítékok szólnak amellett, hogy a B-CLL patogenezisében helyt kaphat a trinukleotid mikroszatellitákat érinto DiE. Epidemiológiai tanulmányok szerint a B-CLL 6%-a familiáris [123] és anticipációt mutat [93, 298], ami feltételezi a trinukleotid ismétlodo elemek dinamikus expanzióját. A 11q22-23 kromoszómarégióban CCG-trinukleotidokból álló repetitív elemek azonosíthatók, melyek a B-CLL elorehaladott stádiumában jelentos expanziót mutatnak, és kromoszómatörésekhez vezethetnek. Ezek az eredmények magyarázatot adnak a B-CLL-ben gyakran kimutatható allélvesztésre ebben a kromoszómarégióban [9]. Nyitott kérdés, hogy a MSI szerepet kaphat-e a B-CLL patogenezisében és progressziójában. Irodalmi adatok szerint a MSI egyéb B-sejtes NHL-ban elenyészo [86, 287], ugyanakkor a B-CLL patogenezise során a vizsgált esetek 7-13%-ában megfigyelheto [87, 243], és egy esetben RS-ban is kimutatták [287]. A MSI és a B-CLL transzformációja közti összefüggést átfogó módon még nem vizsgálták. - 7 -
IV. A B-CLL PATOLÓGIAI JELLEMZOI IV.1. A B-CLL hisztológiai megjelenése A B-CLL világszerte az idoskori lymphoproliferatív kórképek 90%-át teszi ki. Nemzetközi felmérések szerint az összes NHL 6-7%-át alkotja [193]. Szövettanilag a B-CLL a megnagyobbodott nyirokcsomók alapszerkezetét elmosó, diffúz növekedésu tumorként jelenik meg. A tumorsejtek kis, érett, differenciált lymphocyták, kerek maggal, rögös kromatinszerkezettel, vékony citoplazmaszegéllyel. A mitotikus aktivitás alacsony. A diffúz nyirokcsomó-infiltrátumban világos mezok, úgynevezett pseudofolliculusok azonosíthatók (1. ábra) [162], melyek a kis lymphocyták mellett prolymphocytákból (a kis lymphocytáknál nagyobb sejtek, lazább kromatinszerkezettel, kis magvacskával) és paraimmunoblastokból (nagy méretu sejtek, nagy kerek vagy ovális maggal, laza kromatinnal, eozinofil magvacskával) állnak [25]. A 1. ábra: A B -CLL hisztológiai megjelenése nyirokcsomóban A: A sötétebb háttérbol világosabb területekként kirajzolódó pseudofolliculusok azonosíthatók. HE, 40X. B: Nagy nagyítású felvételen a kis lymphocyták mellett lazább kromatinszerkezetu prolymphocyták és nagy, heterokromatinizált, prominens nucleolusszal rendelkezo paraimmunoblastok is megfigyelhetok (nyíl). HE, 400X. B - 8 -
Vérkenetben a daganatos sejtpopuláció mellett gyakran megfigyelhetok elkent sejtek (Gumprecht rögök) a kenetkészítés melléktermékeként. A prolymphocyták aránya általában kevesebb mint 3%; a 10% fe letti prolymphocyta-arány a kórkép agresszívebb klinikai lefolyású variánsát jelzi, amelyet krónikus lymphocytás leukémia / prolymphocytás lymphoma (CLL/PLL) diagnózissal kell illetni [17]. A B-CLL a csontvelot nodulárisan, intersticiálisan, vagy diffúzan infiltrálhatja, ez utóbbi rosszabb prognózist jelez [234]. IV.2. A B-CLL immunhisztológiai megjelenése A B-CLL kis lymphocytái a sejtfelszíni IgM (esetleg IgM és IgD) molekulákat gyengén expresszálják. Ugyancsak gyengén expresszálódik a CD20 és a CD22 marker. A CD5, CD19, CD23 markerek expressziója eroteljes és jellemzo a B-CLL-re [180, 190]. A CD10, FMC7, CD79b, ciklin-d1 nem mutatható ki B-CLL-ben [190]. Esetenként nehézséget jelenthet a B-CLL elkülönítése a köpenysejtes lymphomától, azonban a köpenysejtes malignus lymphomák csaknem mindig CD23 negatívak, illetve ciklin-d1 pozitívak [300]. Újabb vizsgálatok szerint CD38-at expresszálnak a B-CLL azon sejtjei, melyek az expresszált immunglobulin nehézlánc (IgH) és könnyulánc (IgL) gének hipervariábilis régióiban nem hordoznak szomatikus mutációt [51]. IV.3. A B-CLL patogenetikai jellemzoi és sejtes eredete Az utóbbi évek kutatási eredményei jelentos mértékben hozzájárultak a B-CLL citogenetikájának és molekuláris genetikai zavarainak pontosabb megismeréséhez. Jelenleg fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) technikával a B-CLL-ben szenvedo betegek biopsziás mintáinak 80%-ában kimutatható kromoszomális aberráció [59]. Az irodalmi adatok leggyakrabban a 12. kromoszóma triszómiáját [60, 179], valamint a 13q14, 11q22-23, 17p13, 6q21 kromoszóma -régiókat érinto deléciókat [57-61, 262] említik. A B-CLLben tapasztalható kromoszóma-törések pontos mechanizmusa nem tisztázott. Kromoszóma - festési eljárások alapján úgy tunik, hogy a B-CLL ismert kromoszomális töréspontjai - 9 -
fragilis kromoszómarégiók megjelenésével korrelálnak [84]. A kromoszómadeléciók több - részben még azonosításra váró - gén funkciójának megszunését eredményezhetik. Mindeddig a 17p13 és 11q22-23 deléció miatt kieso p53 és a p53-úthoz kapcsolódó ATM gén patogenetikai szerepét igazolták [214]. Ismeretes, hogy DNS-károsodás esetén a p53 gén terméke központi szerepet tölt be a sejtciklus leállításában, vagy az apoptotikus folyamatok elindításában: a sejtmagban szabályozza a p21/ WAF1 ciklin-dependens kináz inhibitor, a proapoptotikus BAX és az antiapoptotikus hatású BCL-2 gének transzkripcióját [157, 164]. A p53 fehérje aktivációjának egyik útja az ATM gén termékén keresztül valósul meg [269]. Az ATM egy szerin-treonin specifikus protein kináz, amely a p53 fehérjét meghatározott pontokon foszforilálva aktiválja [144]. A p53 fehérje nemcsak a génjét érinto mutáció esetén funkcióképtelen, de akkor is, ha elmarad az ATM által biztosított aktivációja. A B-CLL-ben szenvedo betegek 10-15%-ában kimutatható a p53 gén szomatikus mutációja [73], és elfogadott tény, hogy a p53 mutációi rossz kórlefolyást vetítenek elore [47, 201]. A 11q22-23 kromoszóma-deléció, amely csak az ATM egyik alléljának a delécióját jelenti, a betegek 20%-ában fordul elo, de a közölt esetek nagy részében a másik allél mutációi is kimutathatók. Az ATM biallélikus eredetu funkcióvesztése minden bizonnyal a p53 aktiváció egyik útjának elmaradását jelenti [61, 201]. A csökkent p53-hatás másik oka a p53 fehérje metabolizmusának a zavara lehet. A p53 fehérje intracelluláris lebontása az ubiquitin-proteaszóma rendszeren keresztül történik [160]. A B-CLL sejtek konstitutívan magas proteaszomális aktivitást mutatnak, ami jelentosen befolyásolhatja a sejten belüli p53-szintet, ezáltal a sejtek apoptózisra való hajlamát [174]. Feltételezheto tehát, hogy a p53 diszfunkciója B-CLL-ben gyakoribb, mint ahogy az a mutációs gyakorisága alapján elvárható lenne [104]. A B-CLL patogenezisének alternatív magyarázata szerint a kórkép kialakulásának oka a lymphoid homeosztázis zavara. Ez az elmélet abból a megfigyelésbol indul ki, hogy a BCL-2 onkoprotein szintje B-CLL-ben meglepoen magas, jóval magasabb, mint nem tumoros lymphocytákban [110]. A BCL-2 gén kórosan fokozott expressziója jellemzoen a follicularis lymphoma (FL) patogenezisében kap helyet. FL-ban az esetek 80%-ában kimutatható a t(14;18) kromoszóma-transzlokáció. Ennek során a 18-as kromoszómán - 10 -
elhelyezkedo BCL-2 gén expressziója a 14-es kromoszómán levo IgH gén szabá lyozása alá kerül [258]. A B-CLL-re nem jellemzo a t(14;18) kromoszóma-transzlokáció, a daganatos sejtek magas BCL-2 szintje epigenetikai tényezokre, a gén hipometilációjára vezetheto vissza [110]. A BCL-2 egyéb fehérjékkel (BAX, BAD, BAK, MCL1) aktívan részt vesz az apoptózis szabályozásában, és szerepet játszik a perifériás lymphoid szövetek konstans lymphocyta-populációjának fenntartásában [143]. Az apoptózis alapveto fiziológiás folyamat a perifériás nyirokszövetekben, ami kompenzálja a lymphocyta-beáramlás és a lokális lymphocyta-proliferáció sejtszámnövelo hatását. A homeosztatikus szabályozásnak ez a formája nyilvánvalóan zavart szenved B-CLL-ben, ugyanakkor a BCL-2, valamint a BCL-családba tartozó fehérjék expressziója és a terápiás válasz között nem sikerült összefüggést kimutatni [149]. A Rb gén delécióját a B-CLL 30%-ában írták le, azo nban ennek a tumorszuppresszor génnek a patogenetikai szerepe B-CLL-ben vitatható [168, 263]. A B- CLL-ben tapasztalható 13q14 kromoszóma -deléció valóban a Rb gén egyik alléljának elvesztését jelenti, de mindkét allél elvesztése B-CLL-ben elenyészoen ritka, ennélfogva a Rb gén teljes hiánya, mint lehetséges patogenetikai tényezo B-CLL-ben elvetheto [169, 264]. A B-CLL sejtjeiben az immunglobulin gének variábilis régióinak (IgV) vizsgálati eredményei átalakították a daganatos B-lymphocyták eredetérol alkotott korábbi elképzeléseket. Hosszú ideig úgy tunt, hogy a lymphocytákban az IgH és IgL gének átrendezodnek, de nem tartalmaznak szomatikus mutációkat [54, 64, 148], ami a daganatos B-sejtek prefollicularis eredetére utal [261]. Újabb tanulmányok a B-CLL esetek 50-60%- ában az átrendezett IgH és IgL gének hipervariábilis régióiban szomatikus mutációkat mutattak ki [51, 71, 207]. Ezen adatok alapján a B-CLL két altípusra különítheto. Az esetek 40-50%-ában a daganatos sejtek prefollicularis eredetu CD5+ B-sejtek, melyek természetes autoantitestekre emlékezteto, szomatikus mutációkat nem hordozó, IgM izotípusú, kismértékben autoreaktív, keresztreagáló idiotípusú (high idiotype connectivity) immunglobulinokat expresszálnak [33, 128]. A szomatikusan mutált immunglobulint hordozó daganatos B-sejtek, melyek a B-CLL másik alcsoportját alkotják, a jelenlegi álláspont szerint postfollicularis memória B-sejteknek felelnek meg [150]. Átfogó - 11 -
génexpressziós vizsgálatok tovább finomították a B-CLL funkcionális csoportosítását. A daganatos B-sejtek expressziós profiljuk alapján minden más B-sejtes NHL B-sejtjeitol különböznek, és leginkább a memória B-sejtekhez hasonlítanak, jóllehet az IgV-t érinto szomatikus mutációk meglétén vagy hiányán elkülönítheto két csoportjuk további 30 gén expressziójában is eltér egymástól [151, 233]. Mindazonáltal mindkét csoport expresszál CD27-et, amely a memória B-sejtek jellemzo sejtfelszíni markere [150]. A CD27 expressziója és a sejtek memória-sejt jellege nehezen egyeztetheto össze az IgV szomatikus mutációinak hiányával a prefollicularis eredetunek vélt sejtcsoportban. Ez az ellentmondás feloldható, ha a naiv B-sejtek a nyiroktüszokön kívül T-independens antigénekkel (Ag), vagy szuperantigénekkel találkoznak, amelyek a sejtfelszíni immunglobulinhoz (B-sejt receptor, BcR) nem az Ag-felismero régiónál, hanem a framework régiónál kötodnek; így elmarad a IgV szomatikus mutác ióin alapuló affinitásérés [51, 106]. A B-CLL patogenezise az ismertetett adatok alapján feltételez egy elsodleges defektust a betegség mindkét alcsoportjában, ami által a BcR stimulációja a B- sejtek részleges aktivációjához, anergiájához, és az apoptózis elmaradásához vezet [34]. Az IgV régióban szomatikus mutációkat hordozó daganatos B-sejtekben a BcR aktiválása konvencionálisan a nyiroktüszokben történik. A sejtek további sorsa a programozott sejthalál lenne, ehelyett lassan növekvo, indolens tumorként felhalmozódnak. A germline konfigurációjú IgH és IgL géneket hordozó B-sejtekben a BcR-t T-independens Ag, vagy szuperantigén stimulálhatja a nyiroktüszokön kívül. Az elozo csoporthoz hasonlóan sikertelen apoptózis révén túlélhetnek, és valószínu, hogy további stimulációjuk lassú sejtosztódásokhoz vezet [105]. A B-CLL patogenezisének eme modellje szerint a szomatikusan nem mutált IgV-t hordozó csoportban gyakoribbak a sejtosztódások. Valóban, ezek a sejtek a szomatikusan mutált IgV-t hordozó B-sejtekhez képest rövidebb telomer-szakaszokkal rendelkeznek [126], és intenzívebb Ki-67 festodést mutatnak [205]. - 12 -
V. A RICHTER-SZINDRÓMA JELLEMZOI V.1. A lymphoma progresszió általános terminológiája A lymphomagenezis többlépcsos modelljének megfeleloen a lymphomák gyakran tesznek szert agresszívebb fenotípusra a természetes lefolyásuk során [175, 194]. Ezt a folyamatot az irodalomban gyakran félreértheto módon transzformáció, progresszió, evolúció, variáció, konverzió, transzmutáció vagy dedifferenciáció szinonimákkal illetik. Az elso kísérletet a tumor progresszió pontosabb meghatározásásra Foulds tette 1954-ben, hangsúlyozva, hogy a daganat progressziója nemcsak egyszeruen a tumor térbeli és idobeli növekedését jelenti, hanem a tumor egy vagy több jellemzojének végleges és irreverzibilis minoségi változását [83]. A lymphoma progresszió egyaránt vonatkozhat a kérdéses lymphoma morfológiájának, klinikai megjelenésének, vagy biológiai viselkedésének megváltozására (2. ábra). A lymphoma progresszió különbözo aspektusai a legtöbb esetben átfedést mutatnak: a különbözo genetikai eltérések klonális megjelenése (biológiai progresszió) legtöbbször agresszívebb morfológiával (morfológiai progresszió), és a lymphoma akcelerált klinikai viselkedésével, disszeminációjával, terápiarezisztenciájával jár (klinikai progresszió). Ez az átfedés nem mindig teljes. Esetenként egy morfológiai és klinikai progressziót mutató lymphoma eredeti és progrediált komponense között nem mutatható ki klo nális kapcsolat, azaz a progresszió egy de novo másodlagosan kialakuló lymphomát is jelenthet. A kompozit lymphoma megjelölést pusztán morfológiai megfontolások alapján vezették be azokra az esetekre, ahol legalább két, szövettanilag különbözo megjelenésu lymphoid malignitás figyelheto meg több, vagy akár egy szerven belül [145, 146]. Az immunhisztokémiai és molekuláris genetikai vizsgálatok eredményeinek megfeleloen jelenleg a kompozit lymphoma elnevezés alatt egy klonális lymphoma különbözo fenotípusos megnyilvánulást, vagy két különbözo lymphoma egyideju fennállását értjük. Ez a megnevezés azonban nem feltétlenül takar klonális kapcsolatot a morfológiailag eltéronek ítélt lymphomák között. Biológiai szempontból célszeru a lymphoma progresszió - 13 -
meghatározást azokra az esetekre alkalmazni, ahol egy adott lymphoma entitás klonális fejlodésérol (biológiai értelemben vett valódi lymphoma progresszióról) van szó [194]. Kezdeti onkogén hatás Diagnózis Progresszió Példa Klinikai progresszió + Biológiai progresszió - Morfológiai progresszió - Térben terjedo B-CLL B-CLL p53 inaktivációval Klinikai progresszió + Biológiai progresszió + Morfológiai progresszió - B-CLL-bol kialakuló DLBL Klinikai progresszió + Biológiai progresszió + Morfológiai progresszió + 2. ábra: A lymphoma progresszió értelmezése A: A klinikai progresszió csak a tumormassza növekedését (a tumor disszeminációját) jelenti morfológiai és biológiai eltérések nélkül. B: A biológiai progresszió addícionális genetikai zavarok megjelenését jelenti (fekete nyíl), melyek az érintett sejteknek (feketével jelzett sejtek) szelektív növekedési elonyt biztosítanak. C: A morfológiai progresszió (lymphoma tarnszformáció) a tumorsejtek morfológiájának megváltozását vagy a tumor sejtes összetételének megváltozását jelenti, amely legtöbbször klinikai és biológiai progresszióval jár. V.2. A Richter-szindróma definíciója A RS a B-CLL kórlefolyása során kialakuló agresszív NHL, amely a B-CLL hisztológiai transzformációja mellett a kórkép klinikai viselkedésének megváltozásával is jár. Erre a jelenségre eloször Maurice Richter figyelt fel 1928-ban egy 46 éves férfibetegen, akinél fatális lefolyású generalizált lymphadenopathia, masszív organomegália és gyors testsúlycsökkenés volt megfigyelheto [229]. A tünetek hátterében szövettanilag a B-CLL-re jellemzo kis lymphocyták mellett diffúzan megjeleno, széles citoplazmájú, nagy, kissé - 14 -
irreguláris magvú, prominens magvacskával rendelkezó polimorf endothelioid sejtek voltak igazolhatók. Ez a szövettani kép a B-sejtes NHL-k jelenlegi WHO osztályozása szerint a DLBL immunoblasztos variánsának (DLBL-IB) felel meg [131]. A RS elnevezést Lortholary vezette be 1964-ben a B-CLL szövettani transzformációjának megjelölésére a kórlefolyás terminális fázisában [171]. A RS jelenlegi értelmezése magába foglalja mindazon lymphoid malignitásokat, melyek a B-CLL-ben szenvedo betegekben megjelenhetnek [283]. A B-CLL szövettani transzformációja leggyakrabban DLBL kialakulásához vezet [199], de ritkábban Hodgkin lymphoma (HL) [28, 90], vagy multiplex myeloma (MM) is kialakulhat [173, 241]. Rendkívül ritkán a B-CLL T-sejtes NHL-ba is transzformálódhat [159, 202]. A B-CLL Richter transzformációjának incidenciája 5-10% [283]. Az általános klinikai tünetek megjelenésével egyidoben lokalizált, vagy disszeminált nyirokcsomó - megnagyobbodást, gyakran hepatomegáliát, szplenomgáliát okoz. Ritkán extranodális megjelenést is mutathat a pleurában [90], a borben [38, 222], a gyomor-bélrendszerben [209], a központi idegrendszerben [172], a tüdoben [184] vagy a szemben [114]. A RS kezelésére jelenleg nincs széles körben elfogadott terápiás ajánlás [206]. A prognózis rossz, a kombinált kemoterápiára a betegek legtöbbször rezisztensek, az átlagos túlélési ido 5-8 hónap [50, 282]. V.3. A Richter-szindróma hisztológiája és immunfenotípusa A RS eredeti leírása a B-CLL talaján kialakuló immmunoblasztos lymphomát jelölt, ami a B-sejtes lymphomák jelenleg elfogadott osztályozása szerint DLBL-IB-nek felel meg, de irodalmi adatok szerint a DLBL centroblasztos variánsának (DLBL-CB) kialakulását is jelentheti [199]. A DLBL a nyirokcsomókat általában teljes egészében beszuri, de megjelenhet a B-CLL mellett is ugyanabban a preparátumban [283]. A csontvelo beszurodése RS-ban ritka jelenség [199]. Az agresszív lymphoma sejtjei a B- CLL kis sejtjeitol morfológiailag jól elkülöníthetok: a DLBL jellemzo sejtjei nagy, kerek vagy enyhén szabálytalan alakú sejtek, mérsékelten széles citoplazmával, laza - 15 -
magszerkezettel, a magban nagy, centrálisan elhelyezkedo erosen bazofil magvacskával (IB), vagy több, a maghártya mentén elhelyezkedo nucleolusszal (CB, 3. ábra). A B 3. ábra: A Richter-szindróma hisztológiai megjelenése nyirokcsomóban A: DLBL-IB. Az immunoblasztok nagy, mérsékelten pleiomorf sejtek. Szembetuno vonásuk a centrálisan elhelyezkedo, erosen bazofil nagy nucleolus, valamint a centroblasztokénál kissé szélesebb citoplazmaszegély. HE, 200X. B: DLBL-CB. A centroblasztok kerek magvú, laza megszerkezetu sejtek, melyekben a kis nucleoluszok a maghártya mentén helyezkednek el, citoplazmájuk keskeny, bazofil. HE, 200X. A RS immunfenotípusára vonatkozó szegényes irodalmi adatok arra utalnak, hogy bizonyos esetekben a RS megorzi a megelozo B-CLL immunfenotípusát (IgM +, IgD +/-, CD5 +, CD19 +, CD23 + ) [178, 187], egyéb esetekben viszont a RS immunhisztokémiai megjelenése eltér a B-CLL-tol (CD5 -, IgD -, Ki-67 + ) [14, 48, 177]. B-CLL-bol az esetek kevesebb, mint 0,5%-ában HL is kialakulhat. A RS keretében kialakuló HL-nak két megjelenési formája lehet. Az egyik csoportban a jellegzetes, CD15 +, CD30 + Reed-Sternberg sejtek (H-RS sejtek) a B-CLL sejtek alkotta háttérben jelennek meg [189, 251, 281, 295], ritkábban a HL jellegzetes gyulladásos hátterében láthatók a szövettani készítményen [28, 72, 292]. - 16 -
V.4. A B-CLL és a Richter-szindróma klonális kapcsolata A megelozo B-CLL-bol kialakuló DLBL nem mindig az eredeti tumorklónból növekszik ki, de novo is kialakulhat. A molekuláris genetikai vizsgálómódszerek elterjedése elott a klonalitást a B-sejtek sejtfelszíni IgL immunfenotípusa alapján állapították meg. Amennyiben a RS és a B-CLL neoplasztikus B-sejtjei ugyanazon IgL-t hordoztak, akkor a RS feltételezhetoen a megelozo B-CLL klónból alakult ki, különbözo IgL-k detektálása de novo megjeleno RS-ra utalt [117, 183, 286]. Az IgL vizsgálata azonban önmagában nem alkalmas a két lymphoma klonális kapcsolatának megerosítésére vagy kizárására, hiszen egy B-CLL talaján kialakuló DLBL-ben az IgL expresszió eltérhet a B-CLL-ben észlelttol, annak ellenére, hogy az IgH génátrendezodés azonos a két lymphoma entitásban [187, 198]. A klonalitás vizsgálatának hatékonyabb eszköze az IgH génátrendezodés DNS-próbával történo azonosítása (Southern blot) [257]. A Southern blot módszer a genomikus DNS restrikciós endonukleázokkal való emésztésén alapul. Az IgH gén konfigurációjáról a hasított DNS különbözo hosszúságú fragmentumainak gélelektroforézissel történo szétválasztása, majd nitrocellulóz filterre való blottolása után a joining (J H ) génszakaszra specifikus próbával történo hibridizációt követoen kaphatunk információt. Az azonos méretu terméket eredményezo IgH génátrendezodés B-CLL-ben és DLBL-ben megerosíti a sejtek közös eredetét, a különbözo hosszúságú átrendezett IgH szakaszok elméletileg kizárják a klonális kapcsolatot [46, 176, 187, 266, 275, 280]. Mivel a restrikciós endonukleázok felismerési szakaszait szomatikus mutációk módosíthatják, különbözo hosszúságú szakaszok jelenhetnek meg abban az esetben is, ha a két lymphoma B-sejtjeiben azonos az IgH génátrendezodés [177]. A lymphomák klonális kapcsolatának modern módszerekkel történo igazolása szükségessé teszi az IgH harmadik komplementaritást determináló régiójának (CDR3) polimeráz láncreakcióval (PCR) történo vizsgálatát. A CDR3 régió tartalmazza a B-sejtekben átrendezodo variábilis (V H ), diverzitás (D) és J H génszakaszok egyedi, sejtre jellemzo kombinációját [98, 125], mely végigkíséri az adott B-sejt differenciálódásának folyamatát [156]. A CDR3 régió PCRamplifikációja a V H és J H -génekre specifikus primerpárokkal érheto el [278]. A megegyezo hosszúságú és bázissorrendu amplifikált CDR3 szekvenciák a lymphomák közös klonális - 17 -
eredetére utalnak, a különbözo hosszúságú szakaszok kizárják a klonális kapcsolatot [39, 177]. Az irodalmi adatok szegényesek arra vonatkozóan, hogy a RS esetek hány százaléka mutat valódi klonális evolúciót a megelozo B-CLL-bol, és hány százalékban alakul ki de novo a B-CLL mellett. Kevés olyan tanulmány létezik, amely a klonalitás kérdését nukleotid szekvencia elemzéssel közelíti meg [273], a közlemények foleg citogenetikai vizsgálatokra és Southern blot eredményekre szorítkoznak [19, 82]. Ezek a tanulmányok arra utalnak, hogy a RS az esetek 50-60%-ban valódi klonális evolúció során fejlodik ki a megelozo B-CLL-bol [19, 82, 90]. A B-CLL esetek 50-60%-ában a B-sejtek az IgV régióban szomatikus mutációkat hordoznak, 40-50%-uk nem tartalmaz mutációkat [105]. Kérdéses, hogy az IgV régióban a mutációk jelenléte va gy hiánya B-CLL-ben hajlamot jelent-e lymphoma transzformációra. Az erre vonatkozó legfrissebb tanulmány szerint valódi klonális evolúció csak szomatikus mutációkat nem hordozó B-CLL eseteknél valósul meg [273]. V.5. A Richter-szindrómában eloforduló genetikai zavarok A legtöbb indolens B-sejtes NHL a lymphomagenezis jelenleg elfogadott elvei szerint leginkább az apoptotikus folyamatok zavarával jellemezheto [35]. A lymphocyták hiperproliferációja az agresszív lymphomák velejárója, ami számos esetben a másodlagosan bekövetkezo genetikai zavaroknak tudható be [152]. Ezek a másodlagos genetikai zavarok különbözo indolens B-sejtes NHL progresszióját egyaránt jellemezhetik, függetlenül azok entitásától [133, 175, 293]. Fontos megjegyezni, hogy ezek a másodlagos genetikai zavarok RS-ban attól függetlenül is megjelenhetnek, hogy történt-e megelozo kemoterápiás kezelés a lymphoma indolens fázisában [122, 199]. A RS-ban észlelt kromoszomális szintu genetikai zavarok gyakran komplex módon nyilvánulnak meg: a 12. kromoszóma triszómiája kombinálódhat 11q23, 13q14, 17p13 delécióval, vagy 14q expanzióval [31, 36, 108, 231]. A 11q23 deléció esetenként de novo DLBL-ben is megfigyelheto, de RS gyakrabban alakul ki azokban a B-CLL-ben szenvedo betegekben, akiknél ez a kromoszóma-deléció kimutatható [153, 299]. A 12. kromoszóma - 18 -
triszómiája egyedüli eltérésként vagy egyéb kromoszomális zavarokkal együtt jelenhet meg RS-ban [31, 108, 109]. A citogenetikai vizsgálatok eredményei megerosítették azt a feltételezést, hogy a B-CLL-ben detektálható komplex kariotípus-eltérések nagyobb valószínuséggel vezetnek RS-hoz, mint a kromoszomális eltérések hiánya, vagy a 12. triszómia önmagában [108]. A p53 tumorszuppresszor gén inaktivációja a legtöbb indolens lymphoma progressziójának velejárója [47, 57, 194]. A sejtet ért stresszhatások esetén a p53 fehérje egy sor sejtélettani változást indít el, melyek végeredményben leállítják a sejtciklust vagy apoptózist váltanak ki [115]. Hatásának egyik fontos elemeként represszálja a ciklin B1 gént, és aktiválja a p21 tumorszuppresszor gént, melynek terméke gátolja a CDK1 ciklindependens kinázt. A gátló hatás miatt elmarad a CDK1 és a ciklin B1 kapcsolódása, ami megakadályozza a sejtek átlépését a sejtciklus G1/S és G2/M ellenorzo pontjain [270]. Ezek alapján úgy tunt, hogy a p53 inaktivációja a lymphoma progresszió megértésének a kulcsát képezheti. A p53 inaktiválódása azonban már a B-CLL stádiumban is bekövetkezhet, és nem feltétlen velejárója a RS-nak sem [74, 85, 177]. A p53 inaktiváció mellett a p16 INK4A gén inaktiválódása is kapcsolatba hozható a RS kialakulásával [215]. A p16 fehérje a CDK4 és CDK6 enzimek regulatorikus alegységeihez kapcsolódva inaktiválja a ciklin D / CDK4/6 komplex hatását a G1/S határvonalon, ami a sejtciklus leállításához vezet [121]. A p27 fehérje expressziójának megszunése szintén a RS kialakulásához kötheto [45]. A p27 hatékonyan képes kapcsolódni a ciklin D / CDK4, valamint a ciklin E / CDK2 komplexhez, és azok funkcióját gátolva fékezo hatást fejt ki a sejtciklusra [216, 276]. A p27 hatását egérmodellekben is sikerült bizonyítani: a p27 gén kiesése lehetové tette a másodlagos genetikai zavarokat felhalmozó sejtek szökését a sejtciklus kontrollja alól, ami a kísérleti állatokban agresszív daganatok kialakulásához vezetett [208]. A p27 gén kiesése RS-ban megfelel a hisztológiailag agresszív lymphomákban tapasztalható funkcióvesztésnek [40, 218, 237, 242]. Ezeknek a kísérleteknek az eredményei arra utalnak, hogy a p27 sejtciklust fékezo hatása alól felszabadult sejtek újra osztódhatnak, és egyéb genetikai zavarokat halmozhatnak fel, amelyek hozzájárulhatnak a RS kialakulásához [45]. A C-MYC gén kópiaszámának növekedését [6], valamint az A-MYB gén expressziójának nagyfokú csökkenését [92] egyes RS esetekben szintén kimutatták. - 19 -
Mindkét gén terméke a sejtdifferenciálódásban vesz részt, hiányuk felveti patogenetikai szerepüket a lympho ma transzformációban [199]. A B-CLL talaján kialakuló HL esetek jelentos részében kimutatható az EBV fertozés, megelozo - még a B-CLL-ben történt - fertozés nélkül [213, 235]. Követéses vizsgálatok azt mutatják, hogy a B-CLL talaján kialakuló HL a klasszikus HL-nál rosszabb, de a DLBL típusú RS-nál jobb prognózisú [2]. - 20 -
VI. MIKROSZATELLITA SZEKVENCIÁK VI.1. A mikroszatellita szekvenciák genomiális szervezodése, funkciója A genetikai információ tárolásáért és átörökítéséért felelos kódoló DNS szekvenciák nagyfokú stabilitást és védettséget igényelnek a genomban. Ezzel szemben a genom nagyobb részét alkotó, részben ismétlodo szekvenciákba rendezodött nem kódoló örökítoanyag bizonyos mértéku instabilitást mutat, a genom dinamikus részét képezi. A mikroszatelliták a genomban szétszórtan elhelyezkedo, 2-6 bázispár tandem ismétlodéseibol felépülo DNS szakaszok [220]. Átlagosan 30 kilobázisonként fordulnak elo, egyedspecifikusak és általában stabilan öröklodnek [29, 220, 238]. Habár a szatellita DNS-ek minden organizmusban megtalálhatók, funkciójuk még nem teljesen tisztázott. Prokarióta szervezetekben - úgy tunik - szerepet játszhatnak különbözo gének ki-be kapcsolásában, ily módon lehetové teszik a változó környezethez való célirányos alkalmazkodást [76, 191]. Magasabb rendu szervezetekben a mikroszatellitákat érinto változások befolyásolhatják a génexpressziót és a mrns érést, ami fenotípusbeli megnyilvánuláshoz vezethet [165]. Protektív szerepük azonban a kromoszómavégek kódoló szekvenciáinak replikáció alatti védelmében kimerül [18]. Ismertebb a mikroszatelliták különbözo betegségekkel való asszociációja. Az egyes nukleotid egységek felhalmozódása megnöveli a kromoszómaszakaszok közti homológ rekombináció esélyét, megteremtve ezzel transzlokációk, deléciók és inverziók lehetoségét [56, 99, 220]. Számfeletti mikroszatellita amplifikációk fordulhatnak elo DNS replikációs hibaként fragilis-x szindrómában, myotóniás dystrophiában, Huntington-kórban és egyéb neurodegeneratív kórképekben [8, 52, 267]. VI.2. A mikroszatellita instabilitás és a mismatch repair gének Az utóbbi évtizedben számos genetikai zavart tártak fel humán daganatos kórképekben. A különbözo genetikai zavarok négy nagyobb csoportba oszthatók: apró - 21 -
DNS szekvencia változások (ide tartoznak a pontmutációk, néhány nukleotidnyi DNS szakaszok deléciója vagy inszerciója, mikroszatelliták hosszbeli változásai), kromoszómák számbeli eltérései, kromoszóma-transzlokációk, és génamplifikációk [161]. Korai megfigyelések szerint bizonyos sporadikus colorectalis tumorokban, illetve herediter nonpolyposis colorectalis carcinomában (HNPCC) a tumoros szövetekben vizsgált mikroszatellita szekvenciák hossza eltér az ép szövetben levo, megfelelo mikroszatelliták hosszától [1, 129, 272]. Ezt a jelenséget azóta a szakirodalomban MSI-nak nevezik [24]. A MSI egy mutációs folyamat eredményét jelenti a DNS-ben, ami inszerciók vagy deléciók képében jelenik meg [68]. In vitro tanulmányok bebizonyították, hogy a MSI molekuláris mechanizmusát a két DNS szál egymás melletti elcsúszása képezi a replikáció alatt, lehetové téve így a mikroszatelliták hosszának megváltozását [245]. A MSI jelenségérol szóló korai beszámolók egyike sem vetette fel a DNS repair rendszerek szerepét a MSI hátterében. Strand és munkatársai voltak az elsok, akik feltételezték, hogy a MSI defektív MMR kapcsán alakulhat ki. Megfigyeléseik szerint a MSI kimutatható volt olyan baktériumokban és gombákban, melyek defektív muts illetve mutl géneket hordoztak [265]. Az emlos MMR rendszer evolúciós szempontból konzerválódott, a bakteriális MMR rendszerhez hasonló [188], de annál komplexebb mechanizmus. Feladata a DNS replikáció alatt esetlegesen bekövetkezo pontmutációk és az apró (1-4 bp hosszú) inszerciók vagy deléciók felismerése és kijavítása. Míg prokarióta szervezetekben csak három fehérje alkotja a MMR rendszert (muts, muth, mutl), jelenleg kilenc olyan humán DNS repair gén ismert, melyek mutáció okozta inaktivációja MSI megjelenéséhez vezet: ezek a hmsh2, hmsh3, hmsh4, hmsh5, hmsh6 (MutS homológok), valamint a hmlh1, hmlh3, hpms1 és a hpms2 (MutL homológ) gének [188, 192]. Emlosökben a MMR elso lépéseként a replikációs hibát az MSH2-MSH6 (MutS? ), vagy az MSH2-MSH3 (MutS? ) fehérjék ismerik fel, melyek a hibásan párosodott bázisok számától függoen alkotnak egymással komplexet [66, 88, 103, 285] (4. ábra). Az MSH2-MSH6, illetve az MSH2- MSH3 fehérjekomplexekhez a továbbiakban MutL homológ fehérjék: MLH1-PMS2 (MutL? ), MLH1-PMS1 (MutL? ), vagy MLH1-MLH3 (MutL?) fehérjekomplexek kapcsolódnak. Ezek közül a MutL? komplex egyaránt képes a MutS? és a MutS? komplexekhez kapcsolódni. A két fehérjekomplex interakciója szükséges a MMR további - 22 -
lépéseinak aktivációjához [81, 289]. A MMR késoi enzimatikus folyamatai a hibás nukleotidot tartalmazó DNS-szál meghatározott szakaszának kihasítását és újraszintézisét jelentik. Ezeknek a folyamatoknak a pontos mechanizmusa még nem teljesen ismert, azonban az EXO1 exonukleáz és a DNS-szintézishez szükséges PCNA (proliferáló sejt mag-antigén) képes kapcsolódni az MLH1, MSH2, MSH3 és az MSH6 fehérjékhez [43, 80, 246, 279] és elképzelheto, hogy a két fehérje szükséges a repair folyamat befejezéséhez. A Hibás bázispárok felismerése MutS homológokkal B MutL homológok kapcsolódása a MutS homológokhoz C DNS hasítás és szintézis 4. ábra: Az emlos mismatch repair korai lépéseinek folyamatábrája A: Az MSH2-MSH6 fehérjekomplex csak 1 bázispárra, az MSH2 -MSH3 komplex 1-4 bázispárra kiterjedo hibás bázispárosodást ismer fel. B: A MutS homológ fehérjékhez MutL homológ fehérjék kapcsolódnak, melyek szükségesek a MMR késoi lépésihez. C: A MMR késoi lépései során a hibás nukleotidokat tartalmazó DNS-szál meghatározott szakasza kihasad és újjátermelodik. Ezeknek a folyamatoknak a részletei még nem teljesen ismertek. A MSI és a MMR gének funkcionális elégtelensége közötti kapcsolatot több tanulmány is igazolta [65, 274, 291]. Mivel a mikroszatelliták genomszerte megtalálhatók, változásaik, mint mutációs változások bárhol a genomban megjelenhetnek, daganatos megbetegedésekhez társulhatnak vagy azoknak lehetséges okozóivá válhatnak [29]. A MutS és a MutL repair gének humán homológjainak mutációit egyaránt sikerült kimutatni HNPCC-ben szenvedo betegekben [30, 158]. Biokémiai elemzések szerint MSI-t mutató daganatos szövetekben hiányzott a MMR aktivitás [210, 284]. A MMR génekre nullzigóta transzgén egerekben kísérletesen MSI-t és daganatképzodést lehetett eloidézni emésztorendszeri, hám-, és lymphoid szövetekben [53, 67, 217, 224, 225]. További - 23 -
vizsgálatok eredményei szerint a MSI túlnyomóan endodermális eredetu tumorokra: colon- [1, 129, 272], oesophagus- [182], gyomor- [42], tüdo- [252], endometrium- [32] és hólyagtumorokra [95] jellemzo, és egyes esetekben kedvezobb prognózissal társul [29]. A mikroszatelliták hosszbeli változásai nemcsak tumoros megbetegedésekhez társulhatnak [8]. A CCG és CAG tripletek ismétlodésébol álló mikroszatelliták hossza az öröklodés során generációról generációra növekedhet, és egy adott küszöbérték elérése után neurodegeneratív kórképeket vagy mentális retardációt válthat ki. Ezt a fajta mutációs mechanizmust az irodalomban DiE-nak nevezik [227]. A DiE csak az elobb említett mikroszatellitákat érinti, és jellemzo vonása, hogy a kérdéses mikroszatellita növekedése az egymást követo generációkban a kórkép korábbi életkorban és súlyosabb formában való megnyilvánulásához vezet (anticipáció) [267]. A MSI a mikroszatellitákat általánosan érinti, és nem jellemzo rá az anticipáció, kérdéses azonban, hogy a MMR enzimek hiánya képes-e MSI mellett DiE-t is eredményezni. Huntington-kórban és MMR-defektusra visszavezetheto colorectalis tumorokban szenvedo betegek különbözo mikroszatellitalókuszainak vizsgálata azzal az eredménnyel zárult, hogy a két kórkép patomechanizmusa valószínuleg eltér egymástól [91]. MMR-defektív és ép MMR rendszerrel rendelkezo sejtekben a CAG és CCG trinukleotid mikroszatelliták mesterséges destabilizálására irányuló kísérletek megerosítették ezt a feltételezést. A CAG és CCG mikroszatelliták hossza exogén kémiai mutagének hatására a muködo MMR-rendszertol függetlenül változott, ami arra utalt, hogy ez a fajta instabilitás nem a MMR rendszer zavarán alapszik [75]. A MSI hátterében a mismatch repair gének hibás muködése ugyan bizonyítottnak tunik, azonban míg egyes tumorokban, mint például a HNPCC-ben az esetek 90%-ában kimutatható a MSI [192], addig az ismert MMR gének mutációi csak körülbelül 50%-ban bizonyíthatók; sporadikus tumorok esetében ez az arányszám még kisebb [89, 155]. Felteheto, hogy egyes esetekben a mismatch repair gének nem mutációk vagy deléciók hatására inaktiválódnak, hanem epigenetikai módosulással, a promoter szakasz hipermetilációján keresztül [130]. - 24 -
VII. DNS METILÁCIÓ VII.1. A metilált DNS szekvenciák szervezodése a genomban A DNS metilációja egyike azon epigenetikus módosulásoknak, melynek eredményeképpen a gének expressziós mintázata anélkül változik, hogy eltérések keletkeznének a bázissorrendjükben [253]. Eukariótákban a DNS metilációja egy metilcsoport kapcsolódását jelenti a citozin pirimidingyurujének 5. szénatomjához [13]. A reakciót a DNS-metiltranszferáz enzimek katalizálják (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b) az 5 - CG-3 dinukleotidoknál (CpG dinukleotidok) [23]. Muködésük alapvetoen szükséges az egyedfejlodéshez [204]. Gerincesekben a CpG dinukleotidok 70-80%-a fiziológiásan metilált [3]. Ezek a metilált régiók alapvetoen a késon replikálódó DNS-ben fordulnak elo, nukleoszomális konfigurációjuk és hisztonösszetételük folytán transzkripciós faktorok számára hozzáférhetetlenek [271]. Ezzel szemben a genomban léteznek átlagosan 100 kilobázisonként ismétlodo, 0.5-5 kilobázisnyi szakaszok, ún CpG szigetek, melyekben a CpG dinukleotidok halmozottan fordulnak elo (C+G > 50%) és nem metiláltak. A CpG szigeteknél a kromatin erosen acetilált, nem tartalmaz H1 hiszton fehérjéket és nem rendelkezik nukleoszomális felépítéssel. Valószínu, hogy ez a nyitott kromatin konfiguráció lehetové teszi a transzkripciós faktorokkal való interakciót [49, 271]. VII.2. DNS metiláció és transzkripció gátlás Irodalmi adatok szerint az összes humán gén fele tartalmaz CpG szigeteket a promoter régióban [3]. Ezeknek a géneknek több mint fele szövettípustól függetlenül expresszálódó, ún. fenntartó jellegu ( housekeeping ) gén, 40%-uk azonban szövetspecifikus gén. Ép szöveti viszonyok között a promoter régiók CpG szigetei nem metiláltak, függetlenül az adott gén transzkripciós aktivitásától. Ez alól kivételt képeznek az inaktív X kromoszóma át nem íródó génjei [12]. A CpG szigetekkel nem rendelkezo - 25 -
szövetspecifikus gének promoterei változó mértékben metiláltak, a metiláció foka általában fordítottan arányos az adott gén aktivitásával [22, 37]. A promoter DNS metilációja in vitro transzfekciós kísérletekben képes megakadályozni különbözo gének átíródását [223]. Egyes esetekben ezt in vivo végzett tanulmányok is alátámasztották: csirke AEV sejteket demetiláló ágenssel, 5-aza-2 - deoxycitidinnel (5-azaC) kezelve a sejtekben jelenlevo virális gének demetilálódtak, és így aktiválódtak [101]. Bár a DNS metiláció transzkripciót gátló hatásának pontos mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, három különbözo mechanizmus feltételezheto. Egyes transzkripciós faktorokról kimutatták, hogy képtelenek promoter szakaszokhoz kapcsolódni, ha azok metilált CpG dinukleotidokat tartalmaznak [268]. Egy másik feltételezett mechanizmus szerint a promoterek metilált CpG dinukleotidjaihoz metilcitozin-köto fehérjék kapcsolódnak (MeCP-1, Me CP-2), melyek megakadályozzák a transzkripciós faktorok kötodését a promoter szakaszokhoz [27, 200]. Ugyanakkor az is elképzelheto, hogy az erosen metilált DNS olyan kromatinstruktúrát vesz fel, ami lehetetlenné teszi a transzkripció iniciációját [230]. Ezt a feltételezést transzfekciós kísérletekkel igazolták: gazdasejtekbe bevitt idegen, nem metilált DNS a gazdasejt genomjának nyitott, DNáz-I emésztésre érzékeny kromatinjába integrálódik, míg metilált DNS szakasz bevitele esetén az idegen DNS a gazdasejt kondenzált kromatin-régióiban mutatható ki, ami DNáz-I emésztésre nem érzékeny [138, 142]. VII.3. A mismatch repair gének DNS metiláció általi inaktivációja tumoros szövetekben A DNS metiláció zavarait tumoros szövetekben régóta az onkogenezis egyik lehetséges alternatív útjaként tartják számon. Számos me gfigyelés utalt arra, hogy daganatos sejtekben megemelkedik a DNS-metiltranszferáz enzimek aktivitása, genomiális szinten az össz-metiláció csökken, ugyanakkor a CpG szigetek hipermetilálódnak [13, 253]. Ennek megfeleloen több adat is utal arra, hogy rosszindulatú daganatos szövetekbe n több tumorszuppresszor gén inaktiválódik a promoter szakasz CpG szigeteinek kóros hipermetilációja miatt. A Rb gén mellett a VHL, p16, p15 gének promoter-hipermetiláció - 26 -
miatti inaktiválódását is leírták retinoblastomában [100, 239], világos sejtes vesecarcinomában [118], különbözo szolid tumorokban [119] és hematológiai kórképekben: akut és krónikus myeloid leukémiában (AML, CML), akut lymphoid leukémiában (ALL), B-sejtes NHL-ban, MM-ban [41, 44, 63]. A szakirodalomban mutátor gének -nek is nevezett hmlh1 és hmsh2 mismatch repair gének promoter-hipermetiláció okozta inaktiválódását több daganatos betegségben is megfigyelték. Mindkét gén promoter szakaszán található CpG sziget, melynek kóros metilációja transzkripciós inaktivitást eredményez [55, 70]. A hmlh1 gén epigenetikus inaktiválódását leírták colorectalis tumorokban [5, 96, 120, 197, 226], endometriális carcinomában [69, 70], gyomor carcinomában [78, 147, 240], AML-ben [247], emlorákban [195], kis sejtes tüdorákban [290], cholangiocarcinomában [166], valamint a fej-nyaki régió laphámrákjaiban [167]. Megfigyelések szerint azokban a tumoros szövetekben, melyekben a hmlh1 gén promotere hipermetilálódott, nagyfokú MSI-t lehetett detektálni, ugyanakkor a hmlh1 génrol készült mrns illetve fehérje nem, vagy csak igen csökkent mértékben volt kimutatható [79, 135]. A hmlh1 gén promoter-hipermetiláció okozta inaktiválódása és a MSI közti összefüggést az is bizonyítja, hogy ha daganatos sejteket 5-azaC-nal kezeltek, nemcsak normalizálódott a hmlh1 fehérje szintje, de az funkcionálisan is aktív volt, biokémiai próbákon mismatch repair aktivitást mutatott [120]. - 27 -