Fizikai módszerek az élettudományi kutatásban: mikroszkópia, tömegspektrometria Orvosi fizika ik és statisztika ti tik II. Varjú Katalin 2012. április 16. 1
Mikroszkópos módszerek sztereo-mikroszkóp használata műtét közben mikroszkóp szövettani, bakteriológiai alkalmazása cél: apró részletek láthatóvá tó á tétele: nagyítás feloldóképesség és kontraszt növelése 2
Méret, feloldóképesség a kép mérete, illetve a részletek feloldhatósága ldh a látószögtől től függ h D D minél közelebb hozzuk, annál nagyobbnak tűnikű DE a közelpontnál közelebb már nem tudunk róla éles képet alkotni gyűjtőlencsével l előállíthatunk t nagyított tt képet 3
Egyszerű nagyító (lupe) a tárgy max. látószöge tg T a a látszólagos kép látószöge tg K k T t a szögnagyítás N tg tg T a 1 1 a t T f k közelpont ha a kép a tisztánlátás távolságában van 1 1 a N a 11 f a f 4
tárgy az objektív fókusztávolságán kívül tárgylencse objektív Mikroszkóp szemlencse okulár látszólagos, nagyított, fordított állású végső kép tubushossz (fókuszpontok k távolsága) valódi, nagyított, fordított állású közbülső kép, az okulár fókusza közelében 5
Mikroszkóp szögnagyítása tubushossz tisztánlátás táv. N d f 1 a f 2 objektív f.t. nagyítás, feloldóképesség ldóké é okulár f.t. nagyítás 6
Feloldóképesség (felbontóképesség) Damjanovich Fidy-Szöllősi 7
Optikai rács mikroszkóp tárgyaként -1. rend k 0. rend 2. rend 1. rend t 8
Képalkotás h a diffraktált ha diff ktált nyaláb láb nem jut j t az objektívre, bj ktí akkor kk a képről ké ől hiányoznak a részletek (nincs feloldva) k sin k sin d feloldási határ: távolságú tá l á ú pontok t k feloldása, k=1 k n sin NA kör alakú keresztmetszet t 0,61 n sin 0,61 NA 9
NA hatása a feloldóképességre minél nagyobb a NA, annál több rend fér az objektívre (részlet-gazdagabb kép) NA n sin 10
Feloldóképesség diffrakciós értelmezése minden pont az apertúrán való elhajlás miatt gyűrűrendszerré képeződik le minél nagyobb a NA, annál kisebb egyetlen pont diffrakciós képe 11
Numerikus apertúra növelése: immerziós objektív 12
Nagyítás és feloldóképesség Nagyítás: az objektív és az okulár nagyításának szorzata Feloldóképesség: az objektív NA-ja határozza meg Ha az okulárral a nagyítást túlságosan nagyra választjuk, amihez nem társul megfelelő feloldóképesség: üres nagyítás nem társul megfelelő feloldóképesség: üres nagyítás 13
Nagyítás és feloldóképesség tubushossz N d f 1 objektív f.t. a f 2 tisztánlátás táv. okulár f.t. ft NA n sin közeg törésmutató objektív átmérő sin D 2 f 1 objektív f.t. 14
üres nagyítás íá nagyítás feloldóképesség növelésével 15
Lencsék leképezési hibái színi hiba (kromatikus aberráció) gömbi hiba (szférikus aberráció) 16
Lencsék leképezési hibái asztigmatizmus párna-hordó torzítás: görbült képsíkok kóma-hiba 17
Objektív korrekció Objective Spherical Chromatic Field Type Aberration Aberration Curvature Achromat 1 Color 2 Colors No Plan Achromat 1 Color 2 Colors Yes Fluorite 2-3 Colors 2-3 Colors No Plan Fluorite 3-4 Colors 2-4 Colors Yes Plan Apochromat 3-4 Colors 4-5 Colors Yes 18
$6399 63,99 $ 23 480 19
Alkotóelemek Megvilágítás (lámpa, tükör) (7) Írisz / kondenzor lencse (8) Objektív (3) Okulár (1) Objektív revolver (2) Minta asztal (9) Fókusz állító csavar (4 durva 5 finom) 20
Objektívek Magnification Color Code 1/2x No Color Assigned 1x Black 125 1.25x Black 1.5x Black 2x Brown 2.5x Brown 4x Red 5x Red 10x Yellow 16x Green 20x Green 25x Turquoise 32x Turquoise 40x Light Blue 50x Light Blue 60x Cobalt Blue 63x Cobalt Blue 100x White 150x White 250x White Immersion Media Color Code Oil Black Glycerol Orange Water White Special Red 21
Okulárok szem törőhibájának korrekciója okulár-mikrométer (hitelesítés) pointer 22
Binokuláris- vs. sztereo-mikroszkóp a két okulár csak kényelmi funkció valódi 3D képet ad 23
Megvilágítás homogén megvilágítás minimális szórt fény (kontrasztot csökkenti) ált.: világos látóterű fehér fény, átmenő megvilágítás az eltérő optikai tulajdonságú részek más intenzitású területekként mutatkoznak meg festett minták: a festék tulajdonságai szerint különböző alkotóelemek válnak láthatóvá 24
Kritikus (Nelson) megvilágítás a fényforrás (izzószál) leképeződik a mintára homogén minta Köhler megvilágítás kritikus megvilágítás 25
Köhler megvilágítás g 1) az izzószál nem a mintára képeződik le 2) a kollektor fényrekesz a mintára képeződik le, így a minta átvilágított területe szabályozható 26
Köhler megvilágítás 27
Speciális mikroszkópok 28
Darkfield- / sötét látóteres- / ultramikroszkóp oldalfényt lfé kapott láthatatlan t tl részecskék világítanak fényszórás 29
Darkfield- / sötét látóteres- / ultramikroszkóp 30
Floureszcencia mikroszkópia megvilágítás hatására á fényt bocsát ki natív vagy szelektíven kötődő fluoreszcens festékek alkalmazása gerjesztés rövidebb hullámhossz gerjesztés specifikus hullámhosszal a gerjesztő fény kiküszöbölése 31
Polarizáció, kettős törés a kettősen törő (anizotróp, pl: sejtmembrán, mb harántcsíkolt izom, idegsejtek mielinhüvelye) anyagban a törésmutató függ a polarizáció síkjától a két komponens szétválik, és az analizátor után interferenciájukat figyelhetjük meg 32
Polarizációs mikroszkóp csont harántcsíkolt izom 33
Kontraszt eredete amplitudó-moduláció fázis-moduláció 34
Fáziskontraszt fázis szemmel, kamerával nem detektálható tó fázisrács: a komponensek abszorpciója nem nagyon különbözik, csak a törésmutatója kontraszt növelése átlátszó mintákban fixálás, festés nélkül működik, így időbeli folyamatok vizsgálhatók folyamatok vizsgálhatók 35
Fáziskontraszt-mikroszkóp diffraktált nyaláb (±1. rend) direkt nyaláb (0. rend) 36
fázismaszk nélkül közvetlen nyaláb diffraktált nyaláb eredő az eredő és a közvetlen nyaláb intenzitása megegyezik fázismaszkkal közvetlen nyaláb diffraktált nyaláb eredő az eredő és a közvetlen nyaláb intenzitása eltér! 37
fázismaszk változtatásával t tá á l a kontraszt t változik 38
Fáziskontraszt felvételek Bronchiogenic Carcinoma nyelv Coronary Atherosclerosis 39
Pásztázó mikroszkópos módszerek morfológiai i részletek feloldásának ldá á növelése atomi méretekben pontosság tized Å lézerek elterjedésével egyre gyakoribb az anyag felszínével kölcsönhatás: valamilyen mérhető fizikai paraméter pásztázás elve: fordított piezoelektromos hatás 40
Scanning probe *AFM, [[atomic force microscopy]] *BEEM, [[ballistic electron emission microscopy]] *EFM, [[electrostatic force microscope]] *ESTM [[electrochemical scanning tunneling microscope]] *FMM, [[force modulation microscopy]] *KPFM, [[kelvin probe force microscope]] *MFM, [[magnetic force microscopy]] *MRFM, [[magnetic resonance force microscopy]] *NSOM, [[near-field scanning optical microscopy]] *PFM, [[Piezo Force Microscopy]] *PSTM, [[photon scanning tunneling microscopy]] *PTMS, [[photothermal microspectroscopy]] *SAP, [[scanning atom probe]] *SCM, [[scanning capacitance microscopy]] *SECM SECM, [[scanning electrochemical microscopy]] *SEM, [[scanning electron microscopy]] *SGM, [[scanning gate microscopy]] *SICM, [[scanning ion-conductance microscopy]] *SPSM [[spin polarized scanning tunneling microscopy]] *SThM, [[scanning thermal microscopy]] *STM, [[scanning tunneling microscopy]] *SVM SVM, [[scanning voltage microscopy]] *SHPM, [[scanning Hall probe microscopy]] *SSM, [[Scanning SQUID microscope]] 41
AFM (Atomerő-mikroszkópia) atomi méretre kihegyezett tű a felszíntől igen kis távolságra gyenge felfüggesztés: követi a topográfiai viszonyokat a V alakú lemezről visszavert lézerfényt detektálja (a tű és a felszín közötti taszítóerő a Pauli-elv következménye) 42
Modern fénymikroszkópiai eljárások 43
Konfokális mikroszkóp optikailag élesen elválasztható rétegből kapunk képet a minta felszeletelése nélkül, a más mélységből származó fényt az apertúra kizárja ~ μm ~300 nm 44
Konfokális síkban apertúra nélkül Konfokális felvétel 20-40 μm pollenszemcse 3D rekonstruált tárgy konfokális szeletek 45
DIC (differential interference contrast) mouthparts of a blowfly/surface defects in a ferro-silicate alloy 46
Pásztázó közeltér mikroszkóp (SNOM) pontszerű ű megvilágítás, a diffrakciós ió határnál közelebb (közeli mező, diffrakció még nem lép fel) a feloldást az apertúra mérete és nem a hullámhossz határozza meg 47
Az optikai csipesz a részecskén a fény szóródik, ódik a részecske meglökődik a fénynyomás a részecskét a nyaláb közepén tartja DNS kicsavarása mesterséges megtermékenyítés 48
Röntgen diffrakció röntgen-sugár: g kis hullámhossz nagy felbontás DNS nyers diffrakciós kép rekonstruált tárgy bleomycin-dns kötés 49
Elektronmikroszkópia elektron: hullámtermészet h p 100 kv gyorsítófeszültség: g 0,004 nm feloldóképesség: 1Å elektron-nyaláb kölcsönhatásai a vizsgált mintával optikai lencsék helyett elektron-optika 50
SEM (Scanning Electron Microscope) pontról-pontra történő gerjesztés szórt és másodlagos elektronok detektálása 51
TEM (Transmission Electron Microscope) vékony minta (10-100 nm): az elektronok többsége átjut rajta rendezett struktúra: e- nyaláb elhajlása (elektrondiffrakciós eljárás) leképezés esetén: különböző mértékű elnyelés, amplitudó-kontraszt t t 52
szívizom (TEM) trachea epithelium (SEM) 53
szem nagyító konfokális fény mikroszkóp elektron mikroszkóp fény mikroszkóp kó 54
Mikroszkópos módszerek feloldóképessége 55
56
Tömegspektrometria gp gáz fázisú ionok tömegének meghatározása (0,5 300 kda 8,3 10-22 g 5 10-19 g) részecskék szétválasztása tömeg/töltés arány szerint, mágneses tér segítségével 57
Mágneses tér hatása mozgó töltött részecskére F B q v B mágneses indukció töltés sebesség a részecskére ható erő ő a sebességére é merőleges, ezért a részecske körpályán mozog, melynek sugara: 58
Motion of a Charged Particle in a Uniform Magnetic Field The magnetic force acting on a charged particle moving in a magnetic field is perpendicular to the velocity of the particle. Now consider the special case of a positively charged particle moving in a uniform magnetic field with the initial velocity vector of the particle perpendicular to the field. The particle moves in a circle because the magnetic force F B is perpendicular to v and B and has a constant magnitude qvb. The rotation is counterclockwise for a positive charge. 59
Tömegspektrométer gp részei: ionforrás (vizsgálandó anyag gáz halmazállapotba) analizátor (ionok gyorsítása, mágneses térrel szétválasztása a tömeg/töltés arány szerint) detektor klasszikus kvadrupol-tömeganalizáló 60
Vizsgára készüléshez ajánlott: Damjanovich Fidy Szöllősi: Orvosi biofizika ik (3. kiadás) VI/2. A molekuláris és sejtdiagnosztika fizikai módszerei X/2-3, 5-7. Az élettudományi kutatómunka fizikai módszerei Előadás (intézeti honlap, CooSpace) Optika tankönyvek Internet n t 61
62
copic Section through one year old ash tree (Fraxinus) wood, drawing made by Van Leeuwe Replica of microscope by Van Leeuwenhoek 63
64
Végtelen tubushossz 65
66
67