CYP2C19 polimorfizmusok szerepe a clopidogrel rezisztencia vizsgálatában iszkémiás stroke-on átesett betegekben Bádogos Ágnes DE-ÁOK V. évfolyam Témavezető: Dr. Bagoly Zsuzsa Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Laboratóriumi Medicina Intézet, Klinikai Laboratóriumi Kutató Tanszék
A clopidogrel hatása és alkalmazási területe Alkalmazási terület: A clopidogrel széles körűen alkalmazott szer a kardiovaszkuláris események szekunder prevenciójára, önmagában vagy aszpirinnel kombinálva. Hatásmechanizmus: A clopidogrel a P2Y12 ADP receptor irreverzibilis gátlószere. A receptor gátlása következtében a thrombocyták aggregációja elmarad. A clopidogrel molekulamodellje Magyarországon jelenleg több, mint 35.000 beteg részesül clopidogrel terápiában. A gyógyszert szedők kb. 10-40%-a nem ad megfelelő választ a kezelésre (clopidogrel rezisztencia), melynek hátterében elsősorban az aktív metabolit képződésének elmaradása áll.
A clopidogrel prodrug átalakulása aktív vegyületté COOCH 3 S N Cl Észterázok Inaktív metabolit (a bevett clopidogrel 85%-a) Clopidogrel CYP 1A2 CYP 2B6 CYP 2C19 Metabolizmus a májban O O N C O S Cl 2-oxo vegyület CH 3 CYP 3A4(5) CYP 2C9 CYP 2B6 CYP 2C19 Metabolizmus a májban O HOOC N * HS Cl Aktív metabolit OCH 3
A clopidogrel hatásának vizsgálatára szolgáló módszerek funkcionális tesztek 1/ Lumiaggregometria ADP-indukálta thrombocyta aggregáció 2/ Áramlási citometria Vazodilátor asszociált stimulált foszfoprotein (VASP) foszforiláció vizsgálata 3/ Betegágy melletti meghatározás (Point-of-care) VerifyNow TM P2Y12 4/ Genetikai vizsgálatok CYP polimorfizmusok vizsgálata a módszerek egy részét az aszpirin terápia befolyásolja nincs elfogadott gold-standard módszer a legtöbb módszer esetén jó, de nem túl szoros a korreláció
Célkitűzés Megvizsgálni a CYP2C19 *2, *3 (funkcióvesztő) illetve *17 (fokozott metabolizmussal járó) allélek szerepét a clopidogrel terápia hatékonyságára nézve olyan iszkémiás stroke-on átesett betegekben, akik a clopidogrelt legalább egy hónapja monoterápiaként (aszpirin nélkül) szedték.
Betegek és módszerek I. 111 iszkémiás stroke-on átesett, clopidogrel monoterápián lévő beteg 140 gyógyszert nem szedő, egészséges kontroll A vizsgálat a DE-KK Neurológiai Klinikával kollaborációban zajlott.
Betegek és módszerek II. CYP2C19 *2,*3 funkcióvesztő allélek vizsgálata CYP2C19 *17 fokozott metabolizmussal járó allél vizsgálata Módszer: valós idejű PCR alapú, FRET-el kombinált olvadáspontanalízisen alapuló detektálás (Roche LightCycler 480 készülék)
Betegek és módszerek III. Funkcionális módszerek a clopidogrel hatás vizsgálatára 1. P2Y12 specifikus ADP indukálta thrombocyta aggregáció PGE1[ADP40] clopidogrel reszponder kontroll, clopidogrel non-reszponder Eredmény értékelése: maximális aggregáció alapján Non-reszponder: >1% max. aggr.
Betegek és módszerek III. Funkcionális módszerek a clopidogrel hatás vizsgálatára 1. P2Y12 specifikus ADP indukálta thrombocyta aggregáció PGE1[ADP40] 2. VASP foszforiláció vizsgálata áramlási citometriával PGE1 Clopidogrel ADP clopidogrel reszponder IP P2Y12 kontroll, clopidogrel non-reszponder Gs ATP AC Gi camp VASP PKA VASP-P Eredmény értékelése: maximális aggregáció alapján Non-reszponder: >1% max. aggr. Eredmény értékelése: PRI (%)alapján Non-reszponder: >50% PRI
Betegek és módszerek III. Funkcionális módszerek a clopidogrel hatás vizsgálatára 1. P2Y12 specifikus ADP indukálta thrombocyta aggregáció PGE1[ADP40] 2. VASP foszforiláció vizsgálata áramlási citometriával PGE1 Clopidogrel ADP 3. VerifyNow P2Y12 teszt clopidogrel reszponder IP P2Y12 kontroll, clopidogrel non-reszponder Gs ATP AC VASP Gi camp PKA VASP-P Eredmény értékelése: PRU alapján Non-reszponder: >220 PRU Eredmény értékelése: maximális aggregáció alapján Non-reszponder: >1% max. aggr. Eredmény értékelése: PRI (%)alapján Non-reszponder: >50% PRI
Statisztikai módszerek: Betegek és módszerek IV. normalitás vizsgálat: Kolgomorov-Smirnov teszt és Shapiro-Wilk próba ANOVA/ Student t próba Kruskal-Wallis/Mann Whitney U teszt χ 2 próba/ Fischer exakt teszt Szoftver: GraphPad Prism
Eredmények I. Allélfrekvenciák összehasonlítása Vizsgált allél Kaukázusi populáció (CEU)allélfrekvencia Kontroll populáció allélfrekvencia Beteg populáció allélfrekvencia Szignifikancia (CEU-hoz viszonyítva) CYP2C19*2 0,155 0,130 *0,122 *p=0.388 CYP2C19*3 0,014 0,000 *0,004 *p=0.968 CYP2C19*17 0,067 *0,282 *0,252 *p<0.001 A CYP2C19 *2 és *3 allélek esetén a betegpopulációban számolt allélfrekvenciák nem tértek el jelentősen a kaukázusi populációétól. A CYP2C19 *17 esetén a kaukázusi populációhoz képest szignifikánsan magasabb allélfrekvenciákat találtunk a stroke-on átesett betegekben és az egészséges kontrollokban egyaránt. = HAPMAP adatbázis alapján
Eredmények II: A CYP2C19 *2 hordozása és a clopidogrel hatástalansága közötti összefüggés PGE1[ADP40] teszt VASP foszforiláció VerifyNow P2Y12 teszt NR (%) 56,8 73,7 75 73,9 53,4 73,7 75 73,9 51,2 68,4 75 69,6 A CYP2C19*2 allél esetén gén-dózis-hatás összefüggés volt megfigyelhető az allél jelenléte és a clopidogrel hatástalansága között. A CYP2C19*3 allél rendkívül ritka, egyetlen beteg esetén tudtuk kimutatni, az allél hordozása clopidogrel rezisztenciával társult.
Eredmények III: A CYP2C19 *17 allél hordozása növeli a clopidogrel hatékonyságát PGE1[ADP40] teszt VASP foszforiláció VerifyNow P2Y12 teszt NR (%) 63,5 52,8 60 54,3 63,5 44,4 60 47,8 59,7 47,2 50 47,8 A CYP2C19 *17 allél hordozása fokozott clopidogrel hatással társult *1/*1 genotípushoz képest.
Eredmények IV: A CYP2C19*2 allél hatása a *17 allél hiányában PGE1[ADP40] teszt VASP foszforiláció VerifyNow P2Y12 teszt NR (%) 58,3 83,3 75 81,3 58,3 83,3 75 81,3 53,2 83,3 75 81,3 A CYP2C19 *2 hordozása a *17 allél nélkül jelentősen csökkentette a clopidogrel hatását, a *2 allél jelenléte önmagában a non-responderek arányát mintegy 25%-al növelte a vizsgált betegpopulációban.
Eredmények V: CYP2C19*2 allél hatásának összehasonlítása a CYP2C19*2 és *17 együttes előfordulásával PGE1[ADP40] teszt VASP foszforiláció VerifyNow P2Y12 teszt NR (%) 81,3 50 81,3 50 81,3 33,3 A *2 allélt hordozó egyénekben a *17 allél társulása hatékonyan ellensúlyozta a gyengébb clopidogrel hatást, a clopidogrel non-responderek arányát jelentősen csökkentve.
Konklúzió A CYP2C19 *2, *3 és *17 kiemelt fontosságúak az egyes gyógyszerek metabolizmusában, a clopidogrel metabolizmusában is. Vizsgálatainkban a *2, *3 allélek hordozása a clopidogrel hatástalanságával volt összefüggésben, míg a *17 allél hordozása fokozott gyógyszerhatás kialakulásához vezetett. A *2 és *17 allélek együttes jelenléte fokozta a clopidogrel hatását a *2 allél hordozásához képest, tehát javította a *2 allél jelenléte miatt fennálló csökkent hatást. A *17 allél az általunk vizsgált populációban gyakoribb volt, mint a kaukázusi populációban, mely elvileg jobb clopidogrel hatást feltételez. Eredményeink felhívják a clopidogrel hatás tesztelésének fontosságára a figyelmet, kihangsúlyozva a hatástalanság hátterében rejlő genetikai okok vizsgálatának lehetőségét.
Köszönet DE-ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet Klinikai Laboratóriumi Kutató Tanszék Dr. Bagoly Zsuzsa Prof. Dr. Muszbek László Sarkady Ferenc Gindele Réka Szabó Edina DE-ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet Prof. Dr. Kappelmayer János Kissné Sziráki Valéria Minden betegnek és kontrollnak a véradásért DE-ÁOK Neurológiai Klinika Prof. Dr. Csiba László Dr. Magyar Tünde Dombi Brigitta Szent Imre Kórház, Budapest Dr. Pongrácz Endre Neurológia Járóbeteg Szakrendelő Hajdúszoboszló Dr. Sóvágó Judit
Önállóan elvégzett munkák: Függelék CYP2C19 polimorfizmusok mérése valós idejű PCR alapú, FRET-el kombinált olvadáspont-analízisen alapuló detektálással 111 beteg és 140 kontroll esetén 30 beteg ill. kontroll esetén a clopidogrel hatás funkcionális tesztjeinek elvégzése: PGE1[ADP40] thrombocyta aggregáció, VerifyNow P2Y12 teszt Segítséggel elvégzett munkák: DNS izolálás, koncentráció ill. tisztaság meghatározása spektrofotométerrel 30 beteg ill. kontroll esetén a VASP foszforiláció mérése Eredmények értékelése, statisztikai számítások