A KRÓNIKUS URTICARIA PATOGENETIKAI TÉNYEZOI

A KRÓNIKUS URTICARIA PATOGENETIKAI TÉNYEZOI Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Hidvégi Bernadett Az Elméleti és Klinikai Immunológia címu program keretében Készült a Semmelweis Egyetem Központi Immunológiai Laboratóriumában Témavezeto: Dr. Gergely Péter egyetemi tanár Budapest, 2003. 1

A KRÓNIKUS URTICARIA PATOGENETIKAI TÉNYEZOI Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Hidvégi Bernadett Az Elméleti és Klinikai Immunológia címu program keretében Készült a Semmelweis Egyetem Központi Immunológiai Laboratóriumában Témavezeto: Dr. Gergely Péter egyetemi tanár Budapest, 2003. 2

ÖSSZEFOGLALÁS A krónikus urticaria hat héten túl naponta, vagy majdnem mindennap jelentkezo urticaria forma. Az egyes csalánkiütések életideje a 24 órát nem haladja meg, a fizikai faktorok kizárhatók. A populáció 0,1 %-át érinti. Polietiológiás kórkép, melynek hátterében ételintolerancia, infekció állhat; ill. a nagy affinitású IgE receptor (Fc? RI), vagy IgE elleni autoantitestek patogenetikai szerepe merült fel. Az infekciók közül az utóbbi idoben egyre több adat szól a Helicobacter pylori (Hp) kóroki szerepe mellett. Munkám során az OBNI Allergológiai Ambulancián megjeleno és a Semmelweis Egyetem Bor- és Nemikórtani Klinikán hospitalizációra került krónikus urticariában szenvedo betegek klinikai adatait gyujtöttem össze, különös tekintettel az autoimmun eredetu és a Helicobacter pylori infekcióhoz társult esetekre. Elsosorban azt vizsgáltam, hogy klinikai és immunológiai jellemzoit tekintve megkülönböztetheto-e az autoimmun és a nem-autoimmun alcsoport. Az autoimmun alcsoportot meghatározozó anti-fc? RI specifikus antitestek kimutatását Western blot módszerrel, és autológ szérum borteszttel (ASZT) végeztem, majd vizsgáltam a celluláris, illetve humorális immunreaktivitás eltéréseit az egyes alcsoportokban. Vizsgáltam továbbá, hogy a van-e patogenetikai kapcsolat a Helicobacter pylori, mint antigén és a krónikus urticaria között, és ha igen, ennek mi a mechanizmusa. Az ASZT a vizsgált betegcsoport 76 %-ában volt pozitív, betegeink 34 %-ában tudtunk Western blot módszerrel IgG típusú 3

anti-fc? RI? -specifikus autoantitestet kimutatni. Az autoimmun krónikus urticaria csoportba sorolt, immunoblot vizsgálattal autoantitest pozitív betegek szérumai, in vivo hisztam-felszabadító hatásúak voltak. A két betegcsoport klinikai jellemzoit összehasonlítva az autoimmun és nem-autoimmun mechanizmusú csoport nem különböztetheto meg. A cellularis immunreaktivitást vizsgálva, a krónikus urticariás betegek phytohaemagglutinin (PHA) stimuláció hatására, egészségeseknél fokozottabb lymphocyta reaktivitást, emelkedett szérum sil-2r és triptáz koncentrációt mutattak, amely fokozott T-sejt és hízósejt aktivitásra utal. A T-sejt aktivitás mértéke a mért sil-2r szint alapján nem különbözött az autoimmun és nem-autoimmun alcsoportokban, de a szérum triptáz koncentráció nagyobb értékeket mutatott az autoimmun alcsoportban, amely azt jelzi, hogy az autoimmun típusú urticariában a betegség súlyosabb formában zajlik. A sil-2r és a triptáz értékek korrelációja azt jelzi, hogy a T-sejt és hízósejt aktiváció egymás függvénye, és ez a kapcsolat a legszorosabb mértéku az autoimmun alcsoportban volt. A Hp antigénekkel végzett vizsgálatok során, a krónikus urticariás betegek lymphocytái szignifikáns proliferatív választ mutattak, szemben az egészséges kontrollokkal. A proliferatív válasz mértéke nagyobb volt a Hp-szeropozitív urticariásokban, szemben a szeronegatívokkal, de a különbség nem volt szignifikáns. Kísérleteinkben a krónikus urticariás betegekben észlelt alapvetoen fokozott T-sejt reaktivitást a Hp antigének tovább növelték, ami bizonyítékul szolgál amellett, hogy a Hp trigger faktora a krónikus urticariának. 4

BEVEZETÉS A krónikus urticaria hat héten túl naponta, vagy majdnem mindennap jelentkezo urticaria forma. Az egyes csalánkiütések életideje a 24 órát nem haladja meg, fizikai faktorok kizárhatók. A populáció 0,1 %-át érinti. Polietiológiás kórkép, melynek hátterében ételintolerancia, infekció állhat. Az utóbbi idoben egyre több klinikai vizsgálat eredménye szólt a Helicobacter pylori (Hp) kóroki szerepe mellett. Ismert, hogy a baktérium által keltett gyulladás következtében megnövekedett vaszkularis permeabilitás nagyobb táplálkozási allergén expozícióhoz vezet. Másrészrol az évtizedekig perzisztáló infekció extraintesztinalis manifesztációk patológiai alapját teremti meg, a proinflammatorikus cytokinek folyamatos keringésbe áramlásával. A Hp-val fertozött gyomor mucosát és a krónikus urticariás betegek borlézióinak infiltrátumát egyaránt döntoen mononuklearis sejtek alkotják, így a krónikus urticariás betegek perifériás mononukleáris sejtjei Hp antigének kiváltotta proliferációjának vizsgálata választ adhat a klinikai vizsgálatok alapján felmerülo patogenetikai kapcsolatra. Az elmúlt 10-20 év krónikus urticaria kutatásának egyik fo vonalát képviseli a nagy affinitású IgE receptor (Fc? RI) elleni antitestek patogenetikai szerepének vizsgálata. Az Fc? RI? -specifikus autoantitest, sejtfunkciót stimuláló hatású, tehát urticariásokban fokozott hisztamin felszabaduláshoz vezet, melynek in vivo és in vitro bizonyítékai vannak, tehát krónikus urticariában patogén 5

autoantitesteknek tekintheto. Különbözo módszerekkel vizsgálva az Fc? RI? -specifikus autoantitestek elofordulását egyes szerzok 29-46 %-osnak találták. Az autoantitest meghatározására irányuló vizsgálatok, újabb terápiás lehetoségek reményét keltették az autoimmun alcsoportban. CÉLKITUZÉSEK 1. Az OBNI Allergológiai Ambulancián és a Semmelweis Egyetem Bor- és Nemikórtani Klinikán kezelt krónikus urticariában szenvedo betegek klinikai adatainak összegyujtése 2. Alcsoportképzés. Az autoimmun és nem-autoimmun alcsoport meghatározása autológ szérum borteszttel és Western blot módszerrel. Klinikai jellemzok, cellularis és humoralis immunreaktivitás összehasonlítása az egyes alcsoportokban 3. A Helicobacter pylori, mint antigén és a krónikus urticaria közötti patogenetikai kapcsolat vizsgálata BETEGEK ÉS MÓDSZER Betegek 50 krónikus urticariás beteget vizsgáltunk meg (11 férfi és 39 no, átlagéletkor 54.3, 20-71évig terjedo) akiknél az urticaria fennállása 2-240 hónapig terjedo, az idotartamok átlaga 24.2 hónap. Minden esetben rutin laboratóriumi vizsgálatokat, immunszerológiai vizsgálatokat (szérum IgE szint, antinuklearis antitest, anti- 6

thyreoglobulin ill. antimikroszomalis antitest, összkomplement, C3, C4) végeztünk. A gyomorpanaszokat említo ill. a jellegzetesen gasztrointesztinalisként értékelt éjszakai-reggeli megjelenésu urticaria eseteiben a betegeknél gasztroszkópia történt és minden beteg esetében elvégeztük az ureáz kilégzési tesztet. Részletesebb immunológiai vizsgálatok? ASZT, Fc? RI? -specifikus antitest, Hp specifikus IgG antitest, sil-2r és szérum triptáz koncentráció (50 esetben), szérum neopterin (18 esetben) mérések történtek. Lymphocita transzformációs vizsgáltra 24 beteg heparinos vérmintája került. A 24 betegbol 13 Hp szeropozitív, 11 szeronegatív volt. A szeropozitív betegeknél a Hp fertozést gasztroszkópiával (5 beteg) vagy ureáz kilégzési teszttel (8 beteg) is megerosítettük A fent részletezett vizsgálatokon kívül, ezen betegcsoportban a bakterialis fókuszok jelenlétét (fogászati, gégészeti, urogenitalis) is kizártuk. Lymphociták proliferációjának vizsgálata A betegekbol és kontrollokból származó heparinizált vérmintákból Ficollon perifé riás mononuklearis sejteket szeparáltunk. A mononuklearis sejteket különbözo koncentrációjú hoinaktivált Hp antigének (8x10 5, 8x10 6, 8x10 7 baktérium/lyuk) és/vagy mitogének, PHA és PWM jelenlétében vagy hiányában tenyésztettük. A Hp antigének összetétele a kísérlet során állandó volt. A DNS szintézis mértékének meghatározására további 8 óráig a sejtekhez 0.4? Ci 3 H-thymidint adtunk. A thymidin beépülés mértékét szcintillációs számlálóval mértük. Az eredményeket átlagos 7

percenkénti beütésszámban cpm (count per minute)/kultúra? SD (standard deviáció) fejeztük ki. Autológ szérum teszt (ASZT) Az alkar csalánkiütésektol mentes borébe 50?l higítatlan szérumot fecskendeztünk be intrakutan. Negatív kontrollként azonos mennyiségu fiziológiás sóoldatot használtunk. A keletkezett csalánkiütés nagyságát a maximális átméro és az erre meroleges átméro átlagaként adtuk meg a beadás utáni 30. percben mérve. A próbát pozitívként értékeltük, ha a szérum indukálta csalánkiütés legalább 1.5 mm-rel nagyobb volt a kontrollnál. Fc? RI? -specifikus autoantitestek kimutatása Western blot módszerrel Antigénként tisztított rekombináns technikával eloállított humán szérum albuminhoz kovalensen kötött szolubilis Fc? RI? -t használtunk. A tisztított protein 35 kd-os csík formájában jelent meg a gélen. A rekombináns Fc? RI? -t illetve a BSA kontrollt 10-13% -os gradiens poliakrilamid gélen futtattuk. A géleket PVDF membránra blottoltuk. Az Fc? RI? -tartalmú PVDF membránokat a betegek szérumaival, illetve pozitív kontrollként használt kimérikus IgE vel, illetve ismert pozitív beteg kontrollal inkubáltuk. Negatív kontrollként IgG 2a monoklonalis antitestet használtunk, mint izotípus kontrollt. A membránhoz kötodo autoantitesteket torma peroxidázzal jelzett nyúl anti-humán IgG és IgE felhasználásával ECL 8

rendszerben tettük láthatóvá, és Kodak X-Omat típusú filmre exponáltuk. Szérum triptáz szint mérése A szérum triptáz-szintet UniCap Tryptase Fluoroenzyme-immunoassay módszerrel mértük. Szérum sil-2r, neopterin, össz-ige és Hp-specifikus IgG antitestek koncentrációjának mérése A szolubilis IL-2R, a szérum neopterin, szérum össz IgE szintet, és a Hp specifikus IgG antitesteket kereskedelmi forgalomba lévo ELISA kitekkel mértük, a gyártó leírásának megfeleloen. Statisztikai analízis A csoportok és alcsoportok között statisztikailag szignifikáns különbségeket ANOVA/MANOVA teszttel és Student- Newman-Keuls post tes zttel számoltuk. A korreláció számításához Spearman Rank tesztet használtunk. EREDMÉNYEK és MEGBESZÉLÉS Krónikus urticariás betegek perifériás mononukleáris sejtjeinek proliferációs válasza Hp és mitogén stimuláció hatására A teljes hoinaktivált Hp antigénpreparátumra a krónikus urticariás betegek perifériás mononuklearis sejtjei proliferatív választ adtak, szemben az egészséges kontrollokkal. A különbség a Hp két 9

koncentrációja (8x10 6 és 8x10 5 baktérium/lyuk) esetén is szignifikáns volt (p=0,0045, p=0,01). Az urticariás betegek PHA stimulációra egészségeseknél nagyobb proliferatív választ mutattak, de a különbség nem volt szignifikáns. A Hp antigének mitogének kiváltotta blasztosodásra kifejtett hatását vizsgálva, a proliferatív válasz dózis -dependens gátlását tapasztaltuk, mind urticariásokban, mind egészségesekben. A sejtek viabilitása nem csökkent a kísérlet során. A betegcsoporton belül a szeropozitív urticariások erosebb proliferatív válaszra mutattak tendenciát mind a Hp, mind a mitogén stimuláció után a szeronegatív urticariásokhoz képest. Vizsgálataink alapján feltételezzük, hogy krónikus urticariás betegekben a Hp-antigének kiváltotta nagyobb proliferatív válasz a krónikus urticariában alapvetoen fokozott lymphocyta reaktivitás következménye és nem a Hp-specifikus memória T-sejtek aktivációja okozza. Mindezek alapján úgy tunik, hogy a Hp urticaria patogenezisében betöltött szerepe arra korlátozódik, hogy triggereli a krónikus urticaria alapveto immunológiai sajátosságát, a fokozott lymphocyta reaktivitást. Elképzelheto, hogy az autoreaktív T sejtek és a Hp specifikus T sejtek keresztreagálnak, a szeronegatív urticariások Hp antigénekre létrejövo fokozott válaszkészségét okozva. Eredményeink bizonyítékul szolgálnak amellett, hogy a Hp trigger faktora a krónikus urticariának. 10

A celluláris (sil-2r, neopterin, triptáz) és humorális (össz-ige, Hp-specifikus IgG antitestek) immunreaktivitás vizsgálata krónikus urticariában. Az autoimmun/nem-autoimmun alcsoportok összehasonlítása Egy másik kísérleti rendszerben a celluláris és humorális immunreakciók különbségeit vizsgáltuk krónikus urticariás betegekben, majd az autoimmun és nem-autoimmun alcsoportokban. A monocyta-makrophag rendszer aktivitásának meghatározására szérum neopterin, a T-sejt aktivitás mé résére sil-2r, a mastocyta aktiváció jellemzésére szérum triptáz koncentrációt mértünk. A triptáz neutrális proteáz, szelektíven koncentrálódik a mastocytákban és a hisztaminnal együtt a degranulációval szabadul fel, komplement-aktiváción keresztül leukocyta infiltrációt indukál. A szérum neopterin a celluláris aktiváció markere. Aktivált monocyták és macrophagok termelik CD4 pozitív T-sejtek termelte IFN-? hatására A sil-2r proteolitikus fragmentje a membránon lévo IL-2R molekulának, amely a T-sejt aktivációt jelezve számos gyulladásos és autoimmun betegségben fokozott mértékben expresszálódik. Vizsgálataink során a krónikus urticariás betegeknek szignifikánsan nagyobb volt a sil-2r és triptáz koncentrációja, mint az egészséges kontrolloknak (p=0,000257, p=0,000166). A szérum IgE és neopterin szintekben, akárcsak a Hp specifikus IgG antitest koncentrációban nem volt szignifikáns különbség. A sil-2r és triptáz értékek között szignifikáns korrelációt mutattunk ki (Spearman rho=0,53, p=0,00007) 11

A betegek 76 %-a (38/50) mutatott in vivo hisztaminfelszabadító aktivitást ASZT-tel vizsgálva. A betegek 34 %-ában (17/50), de az egészséges kontrollok egyikében sem (0/9) tudtunk Western blot módszerrel IgG típusú anti-fc? RI? -specifikus autoantitestet kimutatni. Az autoimmun krónikus urticaria csoportba sorolt, immunoblot vizsgálattal autoantitest pozitív betegek (17/50), ASZT-je is pozitív volt. Az autoimmun alcsoportban a szérum össz-ige koncentráció szignifikánsan alacsonyabb volt, szemben a nemautoimmun csoporttal (p=0,000836), de nem mértünk szignifikáns különbségeket a két alcsoportban a sil-2r, neopterin és Hp specifikus IgG antitest koncentrációkban. Az autoimmun alcsoportban tendencia mutatkozott magasabb szérum triptáz értékekre. A szérum triptáz és a sil-2r koncentrációk közötti legerosebb korrelációt is az autoimmun alcsoportban tudtuk kimutatni (Spearman rho=0,69, p=0,0022) Ha a betegeket az ASZT-re adott válasz alapján osztályoztuk, az ASZT pozitív csoportban szignifikánsan magasabb triptáz értékeket mértünk, mint a borteszt negatív urticariásokban (p=0,0107). Kísérleteink alapján igazolódott, hogy a fokozott cellularis aktivitás nem függvénye az autoreaktív T-sejtek jelenlétének vagy hiányának hiszen a sil-2r (aktivált T-sejtek markere) szint nem tért el az Fc? RI? antitest pozitív illetve negatív csoportban. Azonban a sil-2r szint szoros korrelációt mutatott a triptáz (mastocytaspecifikus faktor) aktivitással, vagyis krónikus urticariás betegekben 12

a T-sejt és hízósejt aktiváció egymás függvénye, és ez a kapcsolat a legszorosabb mértéku az autoimmun alcsoportban volt. Az autoimmun és nem autoimmun alcsoport a klinikai jellemzok alapján nem különböztetheto meg. Bár az autoantitest meghatározásra, alcsoportképzésre a mindennapi klinikai gyakorlatban törekedni kell, függetlenül attól, hogy az autoantitestes/nem-autoantitestes csoport kialakításának egyelore terápiás konzekvenciái nincsenek. Legújabb, több laboratóriumi módszert összehasonlító tanulmány konklúziója értelmében, az autoantitest meghatározására alkalmazott vizsgálat a helyi laboratóriumi lehetoségek függvénye, nincs olyan módszer, amely egyértelmuen javasolható. Vizsgálataink alapján, az ASZT jó globalis aktivitási marker, a Klinikánk beteganyagában észlelt 76 %- os pozitivitás egybevág hospitalizált betegeink súlyos urticariájával. Vizsgálatainkban, a szérum triptáz értékkel meghatározott mastocyta aktivitás nagyobb értéket mutatott az autoimmun alcsoportban, amely azt jelzi, hogy az autoimmun típusú urticariában a betegség súlyosabb formában zajlik. A SAJÁT EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 1. A vizsgált betegek 34 %-ában (autoimmun krónikus urticaria) tudtunk Western blot módszerrel IgG típusú anti-fc? RI? - specifikus autoantitestet kimutatni, in vivo hisztaminfelszabadító aktivitással. Az autoimmun és nem-autoimmun alcsoport klinikai jellemzok alapján nem különböztetheto meg. 13

2. A krónikus urticariás betegek PHA stimulációra egészségeseknél fokozottabb lymphocyta reaktivitást mutattak, a fokozott T-sejt aktivitást alátámasztotta az emelkedett szérum sil-2r koncentráció is. Ez utóbbi koncentrációjában azonban nem volt különbség az autoimmun és a nem-autoimmun urticariások között, tehát a T-sejt aktiváció mértéke nem az autoantitestek jelenlétének a függvénye. 3. A hízósejt aktiváció jeleként a szérum triptáz koncentráció szignifikánsan magasabb értékeket mutatott krónikus urticariás betegekben, egészséges kontrollokhoz viszonyítva. Az aktiváció kifejezettebb volt az autoimmun alcsoportban, amely bizonyítékul szolgál amellett, hogy az autoimmun típusú urticariában a betegség súlyosabb formában zajlik. 4. A sil-2r és a triptáz értékek korrelációja azt jelzi, hogy a T-sejt és hízósejt aktivitás egymás függvénye, és ez a kapcsolat a legszorosabb az autoimmun alcsoportban. 5. Kísérleteinkben a hovel inaktivált Hp antigének nem aktiválták egészséges kontrollok perifériás mononuklearis sejtjeit függetlenül szerológiai státuszuktól, ezzel szemben a krónikus urticariás betegek lymphocytái, különösen a Hp-szeropozitívak esetében, szignifikáns proliferatív választ mutattak. Az alapvetoen fokozott T-sejt reaktivitást a Hp antigének tovább növelték, ami a Hp trigger szerepe mellett szól. 14