!HU000007018T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 007 018 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 734701 (22) A bejelentés napja: 04. 05. 25. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 040734701 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1633861 A1 04. 12. 02. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1633861 B1 09. 11. 04. (51) Int. Cl.: C12N 9/00 (06.01) B01D 9/00 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04104191 PCT/FI 04/000318 (30) Elsõbbségi adatok: 030786 03. 05. 26. FI 040271 04. 02.. FI (72) Feltalálók: SALMINEN, Tiina, FI-300 Koski Tl. (FI); AIRENNE, Tomi, FI-7 Turku (FI); JOHNSON, Mark, FI-100 Turku (FI); KIDRON, Heidi, FI-100 Turku (FI); NYMALM-REJSTRÖM, Yvonne, FI-540 Turku (FI); SÖDERHOLM, Annu, FI-000 Helsinki (FI); SMITH, David, FI-21100 Naantali (FI); PIHLAVISTO, Marjo, FI-780 Kaarina (FI); VIITANEN, Lenita, FI-3 Turku (FI); PENTIKÄINEN, Olli, FI-214 Lieto (FI); NYRÖNEN, Tommi, FI-00180 Helsinki (FI) (73) Jogosult: Biotie Therapies Corp., 5 Turku (FI) (74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54) Kristályos VAP-1 és alkalmazásai (57) Kivonat A találmány tárgyát eljárások képezik tisztított emberi vaszkuláris adhéziós fehérje (VAP¹1) kristályosítására, röntgendiffrakciós vizsgálatára, térszerkezetének meghatározására, a VAP¹1 szemikarbazidérzékeny monoamino-oxidáz (SSAO) aktivitását gátló vegyületek kiválasztására és vizsgálatára. HU 007 018 T2 A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
A találmány leírása A találmány mûszaki területe A jelen találmány kristályos emberi 1. számú vaszkuláris adhéziós fehérjével (vascular adhesion protein- 1, VAP¹1), különösen a kristályos emberi VAP¹1 szerkezeti információjának ligandum- és inhibitorazonosításban, ¹tervezésben és ¹termelésben, valamint ilyen ligandumok és/vagy inhibitorok in silico és in vitro vizsgálati módszereiben történõ alkalmazásával kapcsolatos. A találmány mûszaki háttere Az élettani immunológiai felügyelet (surveillance) a limfociták folyamatos, a vér és a különbözõ limfoid szervek közötti járõrözésén alapul. Egészséges nem limfoid szövetben a limfociták nincsenek jelen vagy csak nagyon alacsony szinten vannak jelen, míg számos gyulladásos állapotban a limfociták felgyûlnek a különféle érintett szövetekben és szervekben. A limfociták vérbõl való kilépését szabályozó fontos molekulák egyike az 1. számú vaszkuláris adhéziós fehérje (VAP¹1), melyet az US5 580 780 számú amerikai szabadalmi leírás hozott nyilvánosságra. A VAP¹1 homodimer, 170 180 kda molekulatömegû endoteliális glikoprotein. A VAP¹1 az emberi limfociták venulákhoz kötõdését, adhézióját közvetíti emberi szöveti metszeteken. A VAP¹1 gazdagon glikozilált, és a szénhidrátcsoportok fontosak az adhéziós funkció szempontjából (Salmi és mtsi. 1996). A VAP¹1 adhéziós mûködésének gátlása csökkenti a gyulladt szövetet infiltráló sejtek számát, ami a gyulladás megszûnését elõsegíti. A VAP¹1 ennek megfelelõen gyulladásellenes gyógyszerek fejlesztésének célpontja. Az emberi vaszkuláris adhéziós fehérje¹1 (VAP¹1) membránkötött multifunkcionális glikoprotein, adhéziós és enzimatikus tulajdonságokkal. A VAP¹1 klónozása nem várt módon ahhoz a felismeréshez vezetett, hogy a szemikarbazidérzékeny monoamino-oxidázokhoz (SSAO; EC 1.4.3.6) tartozik (WO 98/53049 számú nemzetközi szabadalmi közzétételi irat). A VAP¹1 2¹es típusú integrális membránfehérje, egy nagy, katalitikusan aktív, extracelluláris doménnel. Ennek megfelelõen a VAP¹1 ektoenzim. A leukocita-endotél kölcsönhatás szempontjából sem az SSAO-activitás, sem annak élettani szubsztrátjainak szerepe nincs jól jellemezve. A VAP¹1 volt ezen enzimcsoport elsõ, molekuláris szinten definiált tagja az emlõsökben, és a sejtes SSAO-aktivitás 90%-áért felelõs. Figyelemre méltó módon az SSAO¹k a jól jellemzett A és B monoamino-oxidázoktól sejten belüli elhelyezkedés, szubsztrátok, kofaktorok, inhibitorok és fehérjeszekvencia szempontjából is különböznek. Bár az SSAO-reakció biokémiai szempontból az 1950¹es évek óta ismert, ezen enzimek élettani funkciója tisztázatlan maradt. Az SSAO élettani szubsztrátjai nem ismertek. Két potenciális jelölt, a metil-amin és az amino-aceton emberben a köztes anyagcsere folyamán képzõdik, és az SSAO¹k in vitro és in vivo egyaránt képesek ezeket deaminálni. 5 10 25 30 35 40 45 50 55 60 A VAP¹1 SSAO-aktivitása egyes javaslatok szerint közvetlenül szerepet játszana a leukociták endotélsejtekhez történõ adhéziójában egy új mechanizmus útján, ami a leukocita felszínén kifejezett VAP-1¹en megjelenõ aminszubsztráttal való közvetlen kölcsönhatást foglal magában (Salmi és mtsi. 01). Ezen közlemény leírja a VAP¹1 SSAO-aktivitásának közvetlen részvételét a leukociták endotélhez történõ adhéziójának folyamatában. Ennek megfelelõen a VAP¹1 SSAO-aktivitásának inhibitorai várhatóan csökkentik a leukociták adhézióját a gyulladt területeken, ily módon csökkentve a leukociták kilépését a gyulladt területre, ezáltal enyhítve magát a gyulladásos folyamatot. Emberi klinikai szövetmintákon a VAP¹1 expressziója a gyulladt területeken fokozott. Ezen megnövekedett VAP-1-szint fokozott H 2 O 2 -termeléshez vezethet, a VAP¹1- SSAO extracelluláris doménjének a vérben jelen lévõ monoaminokra kifejtett aktivitásának eredményeképpen. Az endoteliális sejt közvetlen környezetében ezen H 2 O 2 -termelés további sejtszintû eseményeket válthat ki. A H 2 O 2 ismert jelátvivõ molekula, mely más adhéziós molekulák expresszióját képes fokozni, és az így megnövekedett adhéziósmolekula-expresszió fokozott leukocitabevándorláshoz vezethet a VAP-1¹et expresszáló területre. A VAP¹1 SSAO-reakció más termékeinek is lehet biológiai hatása, mely szintén a gyulladásos folyamat erõsödéséhez vezethet. Ily módon a VAP¹1 SSAO-aktivitás termékei a gyulladásos folyamat eszkalálódásához vezethetnek, amit specifikus SSAO-inhibitorokkal le lehet állítani. A VAP¹1 SSAO számos más patológiás állapotban is szerepet játszhat, melyek a VAP¹1 SSAO keringõ aminszubsztrátjainak emelkedett szintjével járnak. Ezen szubsztrátok oxidatív deaminációja a toxikus aldehidek és oxigéngyökök szintjének növekedéséhez vezethet az endotélsejt közvetlen környezetében, ami a sejteket károsíthatja, érfalkárosodáshoz vezetve. A metil-amin és az amino-aceton emelkedett szintjét találták I¹es és II¹es típusú diabéteszes betegekben, és egyes javaslatok szerint a késõi stádiumú diabéteszben megfigyelhetõ érbetegségek, így a retinopátia, neuropátia és nefropátia kezelhetõk lennének a SSAOaktivitás specifikus inhibitoraival. A VAP¹1 SSAO-aktivitást moduláló specifikus VAP¹1 SSAO-inhibitorok kifejlesztése alkalmazható lehet akut és krónikus gyulladásos állapotok vagy betegségek kezelésére, mint a krónikus ízületi gyulladás, a bél gyulladásos megbetegedései, a bõrgyulladások, valamint a szénhidrát-anyagcserével kapcsolatos betegségek, beleértve a diabéteszt és a diabéteszbõl eredõ szövõdményeket, így az érbetegségeket. Emellett a zsírsejtek differenciálódásával és mûködésével, valamint a simaizomsejtek mûködésével kapcsolatos eltérések (különösen az érelmeszesedés) és különféle érbetegségek is alkalmasak lehetnek a VAP¹1 SSAO-inhibitorokkal történõ kezelésre. A WO 03/006003 számú nemzetközi szabadalmi közzétételi irat karbociklusos hidrazinvegyületeket és azok szemikarbazidérzékeny monoamino-oxidázok, 2
köztük az emberi 1. számú vaszkuláris adhéziós fehérje (VAP¹1) gátlására történõ alkalmazását ismerteti. A réztartalmú amino-oxidázok (cupric amino oxidases, CAO; EC 1.4.3.6) az amino-oxidázok funkcionálisan szerteágazó családjába tartoznak (Dawkes és mtsi. 01). Szemikarbazidérzékeny amino-oxidázokként is ismertek, minthogy enzimaktivitásukat egy karbonilreaktív vegyület, a szemikarbazid gátolja. Ezen enzimek primer aminok megfelelõ aldehidekké történõ oxidatív deaminációját katalizálják egy réz-függõ reakcióban, melynek során oxigén fogy, és hidrogén-peroxid, valamint ammónia szabadul fel. Az összes CAO jellemzõ tulajdonsága egy topakinon (TPQ), a 2,4,5-trihidroxi-fenil-alanin-kinon alkalmazása redox-kofaktorként. A CAO-kat számos különféle szervezetbõl izolálták, többek közt baktériumokból, gombákból, növényekbõl és emlõsökbõl. A növényekben a CAO¹k például a sebgyógyulásban vesznek részt, míg a prokariótákban a CAO¹k lehetõvé teszik különféle aminok felhasználását nitrogén- és szénforrásként. A magasabb eukarióták esetében nagyon keveset tudunk a CAO¹k biológiai szerepérõl, a biogén és más aminok anyagcseréjében játszott szerepükön kívül. Shepard és mtsi. 02-ben meglepõ szelektivitásés inaktivációsráta-különbségekrõl számoltak be, inhibitorokat tesztelve hat ismert réztartalmú amino-oxidázon. CAO¹k kristályszerkezetét négy fajban határozták meg eddig: Escherichia coli (ECAO; pl. a Protein Data Bank, loac PDB-kód) (Parsons és mtsi. 1995), Pisum sativum (PSAO; 1ksi PDB-kód) (Kumar és mtsi. 1996), Hansenula polymorpha (HPAO; pl. la2v PDBkód) (Li és mtsi. 1998) és Arthobacter globiformis (AGAO; pl. lav4 PDB-kód) (Wilce és mtsi. 1997). Ezen homodimer struktúrák mindegyike hasonló általános doménszerkezettel rendelkezik, mely D1 D4 doménokra osztható, melyek közül a D1 domén csak az E. coli-ban van meg. A D2 és D3 doménok egyenként kb. 100 aminosavból állnak, és / típusú szerkezetet mutatnak, míg a legnagyobb, C¹terminális domén, a D4 kb. 400 aminosavból áll, és egy egyedi ¹szendvics-feltekeredést mutat, ami a dimerizációhoz szükséges. Az aktív centrum, mely a D4 doménban van, erõsen konzervált a CAO-családon belül. Az aktív centrum mélyen a fehérje belsejében van, és egy hosszú csatornán keresztül érhetõ el, melynek fala fõleg a D3 és D4 doménok aminosavmaradékaiból áll. A D3 domén aminosavmaradékai kevésbé konzerváltak, mint az aktív centrum, ami arra utal, hogy az aktív centrumhoz vezetõ üreg nagy fontosságú a CAO¹k szubsztrátspecificitásának meghatározása szempontjából. Bár az ismert CAO-fehérjék szerkezete nagyon hasonló, az aminosavszekvenciák azonossága mindössze 25 35%¹os. A VAP¹1 evolúciós kapcsolata a CAO-család ismert szerkezeteivel még nincs jellemezve, de a VAP¹1 N¹terminusán a transzmembrán domén jelenléte komoly eltérésre utal az oldható CAO-kkal szemben. A jelen találmány az emberi VAP¹1 kristályosítását és röntgenanalízisét ismerteti. Ez az elsõ kristályosított emlõs-vap¹1. 5 10 25 30 35 40 45 50 55 60 A találmány rövid leírása A jelen találmány kristályos, emberi 1. számú vaszkuláris adhéziós fehérjével (VAP¹1) kapcsolatos. A jelen találmány eljárásokat és módszereket szolgáltat a tisztított VAP¹1 kristályosítására, az így nyert VAP-1-kristályok analízisére, a kristályok paramétereinek és röntgendiffrakciós adatainak kinyerésére, az igénypontok szerint. A jelen találmány továbbá kristályos VAP-1¹et tartalmazó készítményekkel kapcsolatos. A jelen találmány továbbá szerkezeti információt szolgáltat a kristályos emberi VAP-1¹re vonatkozóan, közelebbrõl az emberi VAP¹1 aktívcentrum-üregére vonatkozóan, ahol a nevezett üreg mintegy Å 10 Å széles a felszínen, és mintegy Å mély, és az emberi VAP¹1 egyik monomerjébõl a 86 87, 97, 168 173, 176 177, 180, 184, 5 212, 216, 227, 232 234, 236 239, 344, 388 390, 393 397, 4 419, 421, 421 426, 467 470, 647 651 és 758 761 számú aminosavakat, a másik monomerbõl a 443 449 és 451 számú aminosavakat tartalmazza. Közelebbrõl az aktív centrum tartalmazza továbbá a Leu469 aminosavat egy, az aktív centrum alján elhelyezkedõ keskeny, mintegy 4,5 4,5 Å méretû üreg tetején, melyet az Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 és Tyr473 aminosavmaradékok határolnak. A jelen találmány egy számítógép által olvasható hordozót alkalmaz, mely az emberi VAP¹1 fehérje atomi koordinátáit ill. röntgendiffrakciós adatait tárolja, mely hordozó képes az emberi VAP¹1 fehérje valamely fragmensét tartalmazó molekula kristályának háromdimenziós reprezentációjának megjelenítésére, ha egy megfelelõ gép beolvassa, és egy molekuláris szerkezetek meghatározására szolgáló számítógépes program feldolgozza. A jelen találmány továbbá egy, ligandumok és inhibitorok de novo tervezésére szolgáló in silico vizsgálatot is szolgáltat, mely vizsgálat tartalmazza (i) a VAP¹1 aktív centrumában található aminosav-oldalláncokkal kölcsönhatásra képes funkcionális csoportok vagy kis molekulájú fragmensek azonosítását, és (ii) ezek összekapcsolását egyetlen vegyületté. A jelen találmány továbbá egy in silico tesztet szolgáltat ismert vegyületek és vegyületkönyvtárak átvizsgálására a VAP-1-aktivitást gátló képességük szempontjából. Az ábrák rövid leírása A továbbiakban a találmány nagyobb részletességgel kerül ismertetésre az elõnyös megvalósításokon keresztül, valamint utalásokkal a mellékelt ábrákra, melyek közül az 1. ábra A része egy hexagonális VAP-1-kristályt, a B része egy tipikus diffrakciós mintázatot mutat; a 2. ábra az emberi VAP¹1 kristályszerkezet dimer voltát mutatja, ahol a szénhidrátegységek térkitöltõ modellként kerültek ábrázolásra, és a Tpg471 mindkét monomerben a D4¹doménban elhelyezkedõ gömbként került ábrázolásra; 3
a 3. ábra a dimer VAP¹1 kristályszerkezet egyik monomerjét mutatja; a 4. ábra VAP-1-inhibitor-vegyületek VAP-1-struktúrához való kötõdésének módját mutatja. A nézõpont a felszíntõl mutat az aktív centrum felé. A találmány részletes leírása A jelen találmány az emberi VAP¹1 kristályait szolgáltatja. A jelen találmány szerinti kristályok növesztésére valamely teljes hosszúságú, az N¹terminális transzmembránrégiót is tartalmazó fehérjét tisztítani kell, a teljes fehérjetartalom 80%-áig, elõnyösen a teljes fehérjetartalom 90%-áig, legelõnyösebben a teljes fehérjetartalom 95%-áig. Expressziós és tisztítási célokból a teljes hosszúságú VAP-1-kódoló szekvencia (SEQ ID NO. 1) kerül alkalmazásra. A tisztítási eljárást fontos úgy megválasztani, hogy a tisztított fehérje megtartsa CAO-aktivitását, melyet benzil-amin-szubsztrát alkalmazásával lehet meghatározni. Nagyszámú vektor-gazda rendszer ismeretes a szakmában, melyek alkalmazhatók a fehérje rekombináns termelésére kristályosítás céljából. A lehetséges vektorok közé tartoznak, de nem kizárólag, a plazmidok és módosított vírusok, de a vektorrendszernek kompatibilisnek kell lennie az alkalmazott gazdasejttel. Minthogy az emberi VAP¹1 gazdagon glikozilált, az eukarióta gazdasejtek, így az élesztõk vagy az állati sejtek az elõnyösek. A legelõnyösebb gazdasejtek az aranyhörcsög [Chinese Hamster Ovary (CHO)] sejtjei, melyek teljes mértékig képesek a glikozilálásra. A jelen találmány szerinti kristályok elõállítására bármely, a témában jártas szakember által ismert kristályosítási technika alkalmazható, beleértve nem kizárólagos módon a szakaszos kristályosítást, a gõzdiffúziót és a mikrodialízist. Mikro- vagy makromódszer alkalmazható a kristályok beoltására szükség esetén, ha a röntgenminõségû kristályok elõállításához szükséges. A jelen találmány szerinti kristályok a P6 5 22 szimmetria-tércsoportban képzõdhetnek, két molekulával az aszimmetrikus egységben, az egység dimenziói a=b=225,9 Å, c=218,7 Å, = =90, =1 (lásd a 2. példát alább). Mindazonáltal a jelen találmány tárgyát képezik bármely tércsoportban kristályosodó kristályok, beleértve, de nem korlátozva, a P6 5 22¹re. A kristályok diffrakciója 4 Źnél jobb felbontást eredményez, elõnyösen 3 Źt, legelõnyösebben 2,8 Źnél jobbat. A jelen találmány szerinti kristályokról diffrakciós adatok gyûjtéséhez a kristályokat fagyás elleni védõszerekkel, így glicerinnel lehet védeni, és azonnali lefagyasztást lehet végezni nitrogénáramban. A röntgendiffrakciós adatokat az XDS programmal (Kabsch és mtsi. 1993) lehet feldolgozni, de a témában jártas szakember által ismert bármely eljárás alkalmas lehet a röntgendiffrakciós adatok feldolgozására. Az emberi VAP¹1 atomi szerkezetének meghatározásához a jelen találmány szerint molekuláris helyettesítés, modellépítés és finomítás lehet szükséges. 5 10 25 30 35 40 45 50 55 60 A VAP¹1 szerkezetének meghatározásához a molekuláris helyettesítés alkalmazhatja a szakterületen ismert CAO¹k ismert szerkezetét, vagy bármely más CAO-szerkezetet, melyet a fentiek szerint vagy a 3. példában alább leírtak szerint határoztak meg. A témában jártas szakember által ismert bármely eljárás alkalmazható lehet a jelen találmány szerinti fehérje háromdimenziós szerkezetének meghatározásához molekuláris helyettesítés útján. Például a CCP4i programcsomag AMORE modulja alkalmazható az emberi VAP¹1 szerkezetének meghatározására az itt leírt atomi koordinátákból. Az atomi koordináták valamely, számítógéppel olvasható hordozón lehetnek átadva. Ilyen tárolóeszköz elõnyösen a véletlen elérésû memória (RAM), a csak olvasható memória (pl. a CD¹ROM) vagy a hajlékony lemez. A tárolóeszköz lehet egy helyileg elérhetõ számítógépen, vagy lehet távolról elérhetõ az interneten keresztül. A háromdimenziós szerkezet kezdeti modellje felépíthetõ az O program (Jones és mtsi. 1991) alkalmazásával, majd finomítható például a CCP4i programcsomag REFMAC-programjával. A jelen találmány szerinti finomított VAP¹1 háromdimenziós szerkezetet az atomi koordináták és az 1. táblázatban megadott szerkezetmeghatározási statisztika reprezentálja. A VAP¹1 dimer finomított röntgenszerkezete az A55 A761 aminosavmaradékokból áll azzal, hogy az A1 A54, A2 A4 és A762 A763 aminosavak nincsenek modellezve az A monomerben; és a B57 B761 aminosavakból azzal, hogy a B1 B56, B3, B742 B746 és B762 B763 aminosavak nincsenek modellezve a B monomerben. Az A471 és B471 aminosavmaradékok topakinonok (Tpq471), melyek az eredeti tirozinmaradék poszttranszlációs módosításával keletkeznek, és részt vesznek a katalitikus reakcióban. Mindkét monomerben van egy-egy rézion az aktív centrumokban. A jelen találmány szerinti háromdimenziós szerkezetbõl nyert információ megmutatja, hogy az emberi VAP¹1 aktív centruma (a szubsztrát kötõhelye) magában foglal (1) három hisztidint (His5, His522 és His684) és a koordináló réziont, (2) egy katalitikus aniont, az Asp386¹ot, valamint (3) a Tyr372¹t és az Asn470¹et, melyek a Tpq471 pozicionálásában vesznek részt, és (4) az aktív centrum kapuját, a Tyr384¹et. A Tpq471 a VAP¹1 röntgenszerkezetében a rézen (inaktív) konformációban van. A VAP¹1 szerkezet háromdimenziós ábrázolásait a 2. és 3. ábra mutatja. A VAP¹1 aktív centruma mélyen el van temetve, a Tpq471 kb. 22 Źre van a molekula felszínétõl. Az aktív centrum ürege mintegy Å 10 Å széles a felszínen és kb. Å mély. A VAP¹1 röntgenszerkezetben az üreg alján a Leu469, mely a Tpq471 tetején helyezkedik el, elzárja a bejáratot az aktív centrumhoz. Az üreg egyik fala a kisebb D2 és D3 doménok aminosavmaradékaiból áll, tartalmazva pl. a 86 87, 97, 168 173, 176 177, 180, 184, 5 212, 216, 227, 232 234 és 236 239 számú aminosavakat, valamint a 443 449 és 451 számú oldalláncokat a hosszú ¹hajtû-karból, mely 4
5 10 25 30 35 40 45 50 55 60 a másik monomerbõl áll ki. A csatorna másik fala a katalitikus D4 domén aminosavmaradékaiból áll, tartalmazva pl. a 344, 388 390, 393 397, 4 419, 421, 421 426, 467 470, 647 651, 758 761 számúakat. Az aktív centrum csatornájának bejáratánál az Asn232- höz kötött N¹glikán egy cukoregysége látható a röntgenszerkezetben. A Leu469 alatt a kb. 7 Å hosszú aktívcentrum-üreg sokkal szûkebb, mint a felszínen, és csaknem teljesen kör alakú, mintegy 4,5 4,5 Å. A csatorna ezen szakaszát az Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 és Tyr473 aminosavak határolják. A VAP¹1 röntgenszerkezete nem várt módon az aktív centrum üregének egyedi szerkezetét tárja fel. Az üreg rendkívül széles és nyitott az ECAO, HPAO, PSAO és AGAO szerkezetek szûk csatornáihoz képest. Ebbõl következõen a VAP¹1 aktív centruma sokkal nagyobb ligandum- és inhibitorstruktúrákat képes befogadni, mint az ECAO, HPAO, PSAO és AGAO aktívcentrum-üregei. A VAP¹1 Leu469 maradékának megfelelõ aminosav glicin (ECAO, HPAO és AGAO) vagy alanin (PSAO) és, ennek megfelelõen, ezek nem tudják elzárni az ECAO, HPAO, PSAO és AGAO szerkezetek aktív centrumait. Ezen egyedi szerkezet ismerete szükséges az emberi VAP-1¹re ható farmakofor (a hatásért felelõs molekularész) ill. az üreget kitöltõ ligandum- és inhibitorstruktúrák tervezéséhez. Ezen ismeretek alkalmazhatók az emberi VAP-1¹re ható farmakoforok, azaz a biológiai aktivitáshoz szükséges kémiai tulajdonságokat és háromdimenziós korlátokat mutató kémiai tulajdonságok definiálására. A farmakofor elõnyösen felszíni aktív csoportokkal rendelkezik, így hidrogénhíd-donorokkal és ¹akceptorokkal, töltött csoportokkal vagy hidrofób oldalláncokkal. Az ilyen tulajdonságokat a biológiai aktivitáshoz mért fontosságuk alapján lehet a farmakoformodellbe beépíteni. Farmakoforokat elérhetõ számítógépes software, mint a CATALYST vagy a CERIUS alkalmazásával vagy ismert vegyületek ismert konformációján alapuló manuális modellezéssel lehet meghatározni. A farmakofor alkalmazható in silico vegyületkönyvtárak szûrésére, elérhetõ számítógépes software alkalmazásával, amint az alább részletesen leírásra kerül. A találmány egy megvalósításában a molekulamodellezõ technikák de novo vegyülettervezésre kerülnek alkalmazásra. A de novo vegyülettervezés olyan eljárást jelöl, melyben a cél-makromolekulák, így a VAP¹1 kötõfelszínei vagy aktív centrumai meghatározásra kerülnek, és a nevezett kötõfelszínekkel vagy aktív centrumokkal kölcsönhatásba lépõ vegyületek racionális tervezésének alapjául szolgálnak. A jelen találmány szerinti molekulamodellezõ lépések az emberi VAP¹1 és az aktívcentrum-modellek atomi koordinátáit használják fel. Egy elõnyös megvalósításban a de novo gyógyszertervezés magában foglalja azon funkcionális csoportok vagy kis molekulájú fragmensek azonosítását, melyek az emberi VAP¹1 kötõfelszínén az aktív helyekkel képesek kölcsönhatásba lépni, valamint ezen csoportok vagy fragmensek összekötését egyetlen vegyületté. Miután az emberi VAP¹1 specifikus aktív helyeivel kölcsönhatásba lépõ csoportok vagy kis molekulájú fragmensek azonosítása megtörtént, ezeket egyetlen vegyületbe lehet kötni megfelelõ nagyságú és geometriájú áthidaló fragmensekkel, hogy a vegyület az aktív centrumba illeszkedjen. Bár a megfelelõ funkciós csoportok és fragmensek összekötését manuálisan is el lehet végezni, elõnyösebb a megfelelõ software használata, így a QUANTA vagy SYBYL programoké. További, a szakterületen ismert programok pl. a HOOK, mely több funkcionális csoportot köt össze egy adatbázisból vett molekuláris templátokkal, és a CAVEAT, mely korlátozott akrilmolekulákhoz kötõegységeket tervez. A de novo vegyülettervezés további számítógép-alapú megközelítését jelentik a LUDI, SPROUT és LEAP-FROG programok. A jelen találmány lehetõvé teszi molekulatervezõ technikák alkalmazását kémiai entitások és vegyületek tervezése, azonosítása és szintézise céljából, beleértve gátló vegyületekét, melyek képesek az emberi VAP¹1 aktív centrumába kötõdni. Az emberi VAP¹1 atomi koordinátáit számítógépes modellezéssel egybekötve lehet alkalmazni valamely dokkolóprogram, mint pl. a GOLD, GRAM, DOCK, HOOK vagy az AUTODOCK használatával az emberi VAP¹1 potenciális inhibitorainak azonosítására. Ezen eljárás magában foglalhatja a potenciális inhibitorok számítógépes illesztését a VAP¹1 aktív centrumához annak megítélése céljából, hogy a potenciális inhibitor alakja és kémiai szerkezete mennyire illeszkedik az aktív centrumhoz. A dokkolóprogrammal modellezett potenciális inhibitorok példái az alább leírt (I) képletnek felelhetnek meg. A jelen találmány továbbá magában foglal egy in silico eljárást az emberi VAP¹1 aktív centrumával kölcsönható vegyületek azonosítására, mely a következõ lépéseket tartalmazza: (a) az emberi VAP¹1 ligandkötõ doménjának atomi koordinátáinak elõállítása valamely számítógépen, valamely tárolóeszközön, és (b) a számítógép segítségével molekulamodellezõ technikák alkalmazását a koordinátaadatokon. A fent leírt szerkezeti modell továbbá alkalmazásra került egy, a Sybyl v.6.9 programmal felépített és energiaminimalizált molekulakönyvtár tesztelésére a molekulák VAP-1-inhibitorként várható alkalmassága szempontjából. Az in silico szûrést megelõzõen a VAP¹1 röntgenszerkezete módosításra került a CAO¹k réztõl, aktív konformációjának utánzása céljából, amint azt a 4. példa leírja. A jelen találmány egy további megvalósításában az in silico eljárás az emberi VAP¹1 enzimaktivitását specifikusan gátló vegyületek azonosítására kerül alkalmazásra, és a következõ lépésekkel van jellemezve: egy vegyület azonosítása a nevezett molekulamodellezõ technikákkal, a nevezett vegyület érintkeztetése emberi VAP-1-gyel, és a kölcsönhatás észlelése. A VAP¹1 háromdimenziós szerkezeti információja és ezen szerkezeti információval kapcsolatos atomi koordináták alkalmazhatóak racionális gyógyszertervezésre, egy, a VAP-1-hez kötõdõ és annak enzimaktivitását gátló vegyületek azonosítását lehetõvé tévõ eljá- 5
rással. Ezen, valamely SSAO-aktivitással rendelkezõ enzim potenciális inhibitorainak azonosítására szolgáló eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: (a) A VAP¹1 háromdimenziós szerkezetének az I. táblázatban megadott atomi koordinátáinak alkalmazása; (b) ezen háromdimenziós szerkezet alkalmazása a fenti potenciális inhibitor tervezésére és kiválasztására; (c) a fenti potenciális inhibitor szintézise; (d) a fenti potenciális inhibitor összehozása a fenti enzimmel; és (e) a fenti inhibitor SSAO-aktivitást gátló képességének meghatározása. A jelen in silico eljárás alkalmazható az emberi VAP¹1 enzimaktivitását gátló vegyületek, vagy a VAP¹1 aktív centrumával kölcsönhatásba lépõ vegyületek azonosítására. A jelen találmány szerinti eljárással azonosítható potenciális VAP-1-inhibitorok az (1) képlettel ábrázolhatók, ahol R 1 hidrogén, rövidebb alkil- vagy tetszõlegesen szubsztituált fenil- vagy heteroarilcsoport; R 2 hidrogén vagy rövid alkil, vagy R 1 és R 2 telített heterociklusos gyûrût alkothatnak a nitrogénatommal, melyhez kötõdnek; R 3 R 5 egymástól függetlenül hidrogént, rövid alkilt, aralkilt, tetszõlegesen szubsztituált fenil- vagy heteroarilcsoportot jelöl; R 2 és R 3 telített heterociklusos gyûrût alkothatnak az atomokkal, melyekhez kötõdnek; vagy R 3 és R 5 telített szénciklusos gyûrût alkothatnak a szénatomokkal, melyekhez kötõdnek; R 6 naftil¹, fenil¹, szubsztituált fenil- vagy heteroarilcsoport; R 7 hidrogén, rövid alkil vagy aralkil; n=1, 2 vagy 3; és X=O, S, SO, SO 2 vagy NR 2. A jelen találmány szerinti eljárások és modellek alkalmazásával más típusú vegyületek is azonosíthatók. A témában jártas szakember az itt leírt atomi koordináták és farmakofor alapján azonosíthat olyan vegyületeket, melyek az emberi VAP¹1 fehérje aktív centrumával kölcsönhatnak. Általában az ilyen potenciális gátló vegyületek egy karbonilcsoport-reaktív ágenssel, így aminnal vagy hidrazinnal jellemezhetõk, mint a fenti példa is mutatja, de más, keskeny kinyúló résszel rendelkezõ struktúrák, melyek az aktív centrum üregének 4,5 4,5 Å alsó részébe illeszkednek és az aktív centrum alján elhelyezkedõ TPQ-hoz kötõdni képesek, egyenrangú potenciális inhibitorok. A jelen találmány szerinti vegyületek kinyúló része a vegyület mintegy (I) 5 10 25 30 35 40 45 50 55 60 7 Å hosszú, viszonylag hidrofób középsõ részéhez kötõdnek, mely egyrészt kötõelem, mely lehetõvé teszi, hogy a kinyúló rész elérje az aktív centrumot, másrészt kölcsönhatásba lép az üreget határoló Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 és Tyr473 aminosavakkal. Végül a jelen találmány szerinti vegyületek egy nagyobb térfogatú részt is tartalmaznak, mely kitölti a széles üreget és kölcsönhatásba lép az aktív centrum üregének falában pl. a 86 87, 97, 168 173, 176 177, 180, 184, 5 212, 216, 227, 232 234, 236 239, 344, 388 390, 393 397, 4 419, 421, 421 426, 467 470, 647 651, 758 761, 443 449 és 451 számú aminosavakkal. A jelen találmány továbbá az azonosított vegyületek várt aktivitásának igazolására szolgáló vizsgálatokat és eljárásokat is szolgáltat. A jelen vizsgálóeljárásokkal azonosított vegyületek akut és krónikus gyulladásos állapotok és betegségek, így krónikus ízületi gyulladás, gyulladásos bélbetegségek, bõrgyulladások és sclerosis multiplex, valamint a szénhidrát-anyagcserével kapcsolatos betegségek (beleértve a diabéteszt és a diabéteszbõl eredõ szövõdményeket, pl. érbetegségeket, így a retinopátiát, nefropátiát és neuropátiát) kezelésére szolgáló gyógyszerek készítésére is alkalmazhatók. Emellett az ilyen inhibitorok alkalmazhatók lehetnek a zsírsejt-differenciálódás és ¹mûködés zavaraiban, valamint a simaizomsejtek mûködésének zavaraiban, különösen érelmeszesedésben, és különféle érbetegségekben. A jelen találmányt a következõ példák illusztrálják. 1. példa: Az emberi VAP¹1 termelése és tisztítása A teljes hosszúságú fehérjét, az N¹terminális transzmembrán régióval együtt, glikozilálásra képes CHO sejtekben expresszáltattuk Smith és mtsi. (1998) leírása alapján. A kapott sejteket lízispufferben (0 mm NaCl, 10 mm Tris ph=7,2, 1,5 mm MgCl 2, 1% NP40) lizáltuk. A tisztított sejtlizátumot használtuk a HVAP¹1 tisztítására egy monoklonális ellenanyag-affinitási oszlopon az ÄKTA tisztítórendszer (Amersham Biotech) alkalmazásával. A fehérjét homogenitásig tisztítottuk (>95%) az affinitási kromatográfiával, és tisztítás után a VAP¹1 fehérje (90- és 170 180 kda csíkok) jelenlétét ezüstfestett SDS-gélelektroforézissel igazoltuk, amint azt Smith és mtsi. leírták 1998-ban. A tisztított fehérje megtartotta CAO-aktivitását, amint azt benzil-amin-szubsztrát alkalmazásával igazoltuk. Az amino-oxidáz-aktivitást spektrofotometriás módszerrel mértük, amint azt Holt és mtsi. 1997-ben leírták, 0 l térfogatban, 1 mm benzil-amin-szubsztrát jelenlétében. A fényelnyelés változását 490 nm¹en mértük egy Victor tálcás fotométeren (PerkinElmer Life Sciences). Az emberi VAP¹1 kódoló régiójának nukleotidsorrendje a SEQ ID NO 1¹ben kerül leírásra, a megfelelõ aminosavsorrend (763 aminosav) pedig a SEQ ID NO 2¹ben. 2. példa: Kristályosítás és elõzetes elemzés A hvap¹1 kristályosítási körülményeit szobahõmérsékleten teszteltük egy Wizard I véletlen ritkamátrix 6
kristályosító rácson (Emerald BioStructures, Inc., USA), valamint gõzdiffúziós módszerrel is. Kisméretû hexagonális kristályokat kaptunk 1,0 M K¹Na-tartarát, 100 mm imidazol (ph=8,0) és 0 mm NaCl használatával, több hónapos inkubáció után. A függõ cseppek 2 l fehérjemintát (1,0 mg/ml) tartalmaztak 10 mm kálium-foszfátpufferben (ph=7,2) és 2 l kristályosító oldatot. Optimalizálás után a legjobb kristályokat 1,0 M K¹Na-tartarát, 100 mm imidazol (ph=7,8) és 0 250 mm NaCl kristályosító oldattal kaptuk. A kristályok néhány nap alatt képzõdtek, és kb. 0, 0, 0,1 mm nagyságúra nõttek (1. ábra). Egy kristályt egy kapillárisban rögzítettünk és elõzetes röntgenelemzést végeztünk saját laboratóriumunkban egy forgóanódos sugárforrással (Cu K -sugárzás, 50 kv, 0 ma) és egy MAR345 képérzékelõvel, A kristály azonban csak 8 Å felbontást adott, így a szimmetriacsoport nem volt meghatározható. A további röntgenelemzést és adatgyûjtést szinkrotronsugárzással végeztük az X11 sugárforrással (EMBUDESY Hamburg, Germany), mely egy MAR Research CCD detektorral van felszerelve. Az adatgyûjtéshez a kristályokat fagyás ellen % (v/v) glicerinnel védtük, és azonnal fagyasztottuk egy 100 K nitrogénáramban. A különbözõ kristályokról nyert diffrakciós adatokat a CDS programmal dolgoztuk fel. Az oldószertartalmat és a Matthews-együtthatót 90 kda monomer-molekulatömeggel számolva a CCP4 programcsomaggal számítottuk. A legszebb hexagonális kristályokat 1,0 M K¹Natartarát, 100 mm imidazol (ph=7,8) és 0 250 mm NaCl alkalmazásával nyertük. A kristályok jellemzõen 0, 0, 0,1 mm nagyságot értek el (1A. ábra), az elemi cella dimenziója a, b=225,9 Å, c=218,7 Å, =90 és =1. A diffrakciós adatok statisztikája szerint (1. táblázat) a VAP¹1 kristályok diffrakciós limitje 3,2 Å volt, bár egyes képeken 3,0 Źnél jobb felbontásnak megfelelõ visszaverõdés volt megfigyelhetõ (1B. ábra). A kristályok a P6 5 22 szimmetriacsoporthoz tartoznak. Feltételezve, hogy egy aszimmetrikus egységhez egy dimer (180 kda) tartozik, a Matthewsegyüttható 4,5 Å 3 /Da és az oldószertartalom 72%. A kristályparamétereket és a diffrakciós statisztikát az 1. táblázat foglalja össze. 1. táblázat Kristály és diffrakciósadat-statisztika Szimmetriacsoport P6 5 22 8 Elemi cella hossza (Å) a=b=225,9, c=218,7 Elemi cella szögei ( ), =90, =1 Matthews-együttható (Å 3 Da 1 ) 4,5 a Oldószerszázalék 72,3 a Elemi cella térfogata (Å 3 ) 9 665 176 Molekula/aszimmetrikus egység 2 a Egyedi visszaverõdések 52 367 (4 588) Megfigyelt visszaverõdések 739 050 (61 793) 5 10 25 30 35 40 45 50 55 60 Használt hullámhossz (Å) 0,811 Felbontástartomány (Å) 3, (3,30 3,) Teljesség (%) 95,9 (97,2) R merge (%) 19,6 (46,4) Átlagos l/ 13,2 (6,0) Redundancia 14,1 (13,5) A zárójelezett értékek a legjobb felbontású héjakra vonatkoznak. a A részleteket lásd a szövegben. 3. példa: Szerkezetmeghatározás A VAP¹1 szerkezetét a CCP4i programcsomag (Collaborative Computational Project, 1994) AMORE (Navaza, 1994) moduljával oldottuk fel, molekuláris helyettesítés használatával. Ez a módszer megerõsítette, hogy a VAP-1-kristályok szimmetriacsoportja P6 5 22, aszimmetrikus egységenként egy biológiai egységgel, egy dimerrel. A molekuláris helyettesítésben a következõ dimer polialaninláncokat vizsgáltuk: Escherichia coli CAO (93 7 számú aminosavmaradékok; PDBkód: 1OAC), Pisum sativum CAO (7 634 számú aminosavmaradékok; PDB-kód: 1KS1), Hansenula polymorpha CAO (22 655 számú aminosavmaradékok; PDB-kód: 1A2V) és Arthobacter globiformis CAO (9 623 számú aminosavmaradékok; PDB-kód: 1AV4). Ezek közül a P. sativum-szerkezet adta a legjobb korrelációs együtthatót (44,1%) és Rfaktort (53,4%), és ezt használtuk keresési modellként. Az elektronsûrûségi térképeket a CCP4i programcsomag FFT moduljával számítottuk, és eléggé megjósolhatónak bizonyultak a VAP¹1 polipeptid követéséhez, bár a modellépítés kezdetén csak számos fragmensben. A modellt manuálisan építettük a CCP4i programcsomag O nevû programjával, a REFMAC 5.1.24 (Murshudov és mtsi. 1997) modullal finomítottuk. Az oldalláncokat lépésenként adtuk a szerkezethez számos finomítási cikluson keresztül. A végleges modellben csak a következõ aminosavakat nem tudtuk követni, ezeket nem vettük bele a végleges modellbe: A1 A54, A2 A4, A762 A763, B1 B56, B3, B742 B746 és B762 B763. A topakinonmaradék koordinátáit a Hetero-compound Information Centre, Uppsala intézménytõl kaptuk (Kleywegt és Jones, 1998), a szótárát a PRODRG programmal generáltuk (van Aalten és mtsi. 1996). A végleges VAP¹1 modell sztereokémiai minõségét a PROCHECK programmal (Laskowski és mtsi. 1993) ellenõriztük. A modellbe foglalt 1401 aminosav közül 84,0% a Ramachandran-ábra legelõnyösebb helyzetében található (Ramachandran és Sasisekharan, 1968), és csak 0,5% van a nehezen megengedhetõ vagy tiltott régiókban. A szerkezetmeghatározási statisztikát az 1. táblázat foglalja össze. Az emberi VAP¹1 kristályszerkezetének atomi koordinátáit (és a szerkezeti faktorokat) a PDB-ben helyeztük el 1 PU4 és 1US1 elérési kódok alatt. Az emberi VAP¹1 kristályos formája homodimer, minden alegység tartalmazza a D2, D3 és D4 doméno- 7
kat. A VAP-1-szerkezet sematikus ábrázolása a 2. ábrán látható. A kristályban látható D2, D3 és D4 doménok rendre a kb. 55 169, 170 300 és 301 761 számú aminosavmaradékokat tartalmazzák (rendre SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 és SEQ ID NO: 5). Az emberi VAP¹1 szerkezetét a többi ismert amino-oxidáz-szerkezethez a legtöbb különbség a D2 és D3 doménokban található, bár a D4 domén szintén mutat eltéréseket. 5 Vegyület 7. Szerkezet 4. példa: In silico módszer a potenciális inhibitorok szûrésére Ezen példa bemutatja, hogyan vizsgáltunk in silico egy aril-oxi-metil-szubsztituált hidrazin-alkohol-vegyületeket tartalmazó könyvtárat a 3. példa szerinti VAP-1- szerkezet kötõüregébe való dokkolás útján. A vizsgált vegyületek a következõ képletnek felelnek meg: 10 2. 8. 5. ahol R 1 hidrogén, rövidebb alkil- vagy tetszõlegesen szubsztituált fenil- vagy heteroarilcsoport; R 2 hidrogén vagy rövid alkil, vagy R 1 és R 2 telített heterociklusos gyûrût alkothatnak a nitrogénatommal, melyhez kötõdnek; R 3 R 5 egymástól függetlenül hidrogént, rövid alkilt, aralkilt, tetszõlegesen szubsztituált fenil- vagy heteroarilcsoportot jelöl; R 2 és R 3 telített heterociklusos gyûrût alkothatnak az atomokkal, melyekhez kötõdnek; vagy R 3 és R 5 telített szénciklusos gyûrût alkothatnak a szénatomokkal, melyekhez kötõdnek; R 6 naftil¹, fenil¹, szubsztituált fenil- vagy heteroarilcsoport; R 7 hidrogén, rövid alkil vagy aralkil; n=1, 2 vagy 3; és X=O, S, SO, SO 2 vagy NR 2. A szintetizált és/vagy modellezett és in silico vizsgált vegyületekre példákat a 2. táblázatban mutatunk be. 25 30 35 40 45 10. 13. 17. 3. 2. táblázat 12. Vegyület Szerkezet 50 1. 16. 55 4. 6. 60 8
Vegyület 11. 14. 9. 19.. 2. táblázat (folytatás) Szerkezet A röntgenszerkezet módosítása és liganddokkolás A VAP¹1 röntgenszerkezetét módosítottuk, hogy a CAO¹k réztõl, aktív konformációját utánozza, az alábbiak szerint. Elõször is a topakinont módosítottuk az aktív imino-kinon-formára az ECAO-szerkezet alapján [PDBkód:1D6Z (Wilmot és mtsi. 1999)]. Másodszor, a VAP-1- szerkezet aktívcentrum-üregét módosítottuk a dokkolási kísérletek elõtt a rotamerek (Phe389, Tyr394, Asp386 és Leu469) kiválasztásával, a Bodil modellezõ programcsomag használatával (http://www.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/johnson/bodil.html), ami az aktív centrum iminokinonját könnyebben elérhetõvé tette a ligandumok számára. A VAP-1-szerkezethez a hidrogénatomokat a Reduce v.2. programmal (Word és mtsi. 1999) adtuk hozzá, bármifajta oldallánc-igazítás nélkül. A potenciális ligandumok R¹ és S¹enantiomerjeit a Sybyl v.6.9 programmal (Tripos Associates, St. Louis, USA) állítottuk elõ és energiaminimalizáltuk. A ligandumokat kovalensen kötöttük az imino-kinon-maradékhoz, és manuálisan dokkoltuk a kötõüregbe. A ligandumok kötési módja A 4. ábra mutatja a vizsgált ligandumok egy példáját. A 3. ábra a Bodil modellezõ programcsomaggal készült, és a BTT-71 (9. számú vegyület) S¹enantiomerjének kötési módját mutatja. Azért a BTT- 71 S¹enantiomerjét választottuk az ábrához példaképpen, mert a dokkolási szimulációk szerint a VAP-1- szerkezettel a legkiterjedtebb kölcsönhatásokra képes. 5 10 25 30 35 40 45 50 55 60 A VAP-1-szerkezet alapján azok a ligandumok, melyekben az X nem oxigénatom, hanem kénatom, jobban kölcsönhatásba lépnek a VAP-1-gyel, mert a VAP¹1 kölcsönható felszíne hidrofób. A kénatomot tartalmazó ligandumok hidrofób része a hidrofób aminosavmaradékokhoz (Leu468, Leu469, Phe389 és Met211) simul. A ligandum para-metoxilcsoportjának oxigénatomja hidrogénkötési távolságra van a Thr212 oldalláncoxigénjétõl, míg a ligandum meta-metoxil-csoportjának oxigénje hidrogénkötési távolságra van a Tyr394 oldalláncának hidroxilcsoportjától. A Phe389 olyan pozícióban van, ahol könnyen kölcsönhatásba tud lépni a ligandumok aromás gyûrûjével. A para- és meta-metoxil-csoportok metilcsoportjai rendre a Tyr448 és Tyr176 aminosavakkal állnak kölcsönhatásban. Az S¹enantiomerek hidroxilcsoportjai optimális hidrogénkötést tudnak képezni az Asp386-tal, míg az R¹enantiomerekben a hidrogénkötések távolsága és geometriája nem optimális. 5. példa: Az azonosított potenciális inhibitorok VAP-1-gátló hatásának igazolására szolgáló in vitro mérések A VAP¹1 SSAO-aktivitását kapcsolt kolorimetriás módszerrel mértük, lényegében a monoamino-oxidázokra és rokon enzimekre leírtak szerint. Aranyhörcsögovárium-sejtekben (CHO) expresszált rekombináns emberi VAP¹1 SSAO¹t használtunk VAP¹1 SSAO-ként az aktivitásmérésekhez. A natív CHO-sejtek elhanyagolható SSAO-aktivitást mutatnak. Ezek a sejtek és tenyésztésük korábban leírásra kerültek (Smith D J és mtsi. 1998). Sejtlizátumot kb. 3,6 10 8 sejt 25 ml lízispufferben (0 mm NaCl, 10 mm Tris-bázis ph=7,2, 1,5 mm MgCl 2, 1% NP40) történõ felszuszpendálásával és éjszaka 4 C¹on forgóasztalon inkubálásával készítettünk. A lizátumot szobahõmérsékleten 18 000 g¹n 5 percig centrifugálva derítettük és a felülúszót közvetlenül használtuk a vizsgálathoz. A VAP¹1 SSAO-mérést 96 lyukú mikrotitertálcában végeztük a következõképpen. Minden egyes lyukba meghatározott mennyiségû inhibitort adtunk. Az inhibitor mennyisége vizsgálatonként változott, de általában 1nMés50 M végkoncentráció között volt. A kontrollokban nem volt inhibitor. Az inhibitor :1 össztérfogatban volt vízben. Ezután a következõ reagenseket adtuk: kálium-foszfát-puffer ph=7,6 0,2 M a teljes 0 l reakció-térfogatra, 45 l frissen készített kromogénoldat, mely 1 mm 2,4-diklór-fenolt, 500 M 4¹amino-antipirint és 4 U/ml torma-perioxidázt tartalmaz, valamint a CHO sejtlizátum akkora adagját, mely 0,6 A 490 -változást okoz óránként. Ez a mérés lineáris tartományán belül volt. A tálcákat 30 percig 37 C¹on inkubáltuk, a háttérelnyelést 490 nm¹en egy Wallac Victor II tálcás számlálón mértük. Az enzimreakciót l 10 mm benzil-aminnal indítottuk (végkoncentráció=1 mm), és a tálcát 1 h hosszat inkubáltuk 37 C¹on. A VAP¹1 SSAO-aktivitást tükrözõ fényelnyelés-növekedést 490 nm¹en mértük. A gátlást százalékos gát- 9
lásként fejeztük ki a kontrollhoz viszonyítva, a háttérelnyelésre korrigálva, és a GraphPad Prism programmal IC50 értékeket számítva. 5 10 25 6. példa: A VAP¹1 SSAO-aktivitás összehasonlítása a teljes patkány-maoaktivitással Patkány-MAO¹t patkánymájból készítettünk 1 g májszövet többszöri öblítésével 14 ml KCl-EDTA-oldatban a vér teljes eltávolítása céljából. Ezután 1 g májmintát 4 ml jéghideg kálium-foszfát-pufferben (0,1 M, ph=7,4) homogenizáltunk egy Ultra-Turrax homogenizátorral (beállítás: 11 000 rpm, 4 10 sec). 500 g¹n 10 percig 4 C¹on centrifugálva a felülúszót gondosan leszívtuk, és 12 300 g¹n percig 4 C¹on centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, és a leülepedett mitokondriumokat 4 ml friss foszfátpufferben felvettük, az elõbbiek szerint megint centrifugáltuk. A mitokondriumokat 4 ml foszfátpufferben felvettük, és Ultra-Turrax homogenizátorral (beállítás: 11 000 rpm, 2 10 sec) homogenizáltuk. A mitokondriumkészítményt adagokban 70 C¹on tároltuk. A teljes MAO-aktivitást a VAP¹1 SSAO-hoz hasonló módszerrel határoztuk meg azzal, hogy a 2,4-diklórfenol helyett 1 mm vanillinsavat használtunk. Minden egyes lyukba meghatározott mennyiségû inhibitort adtunk. Az inhibitor mennyisége vizsgálatonként változott, de általában 10 nm és 800 mm végkoncentráció között volt. A kontrollokban nem volt inhibitor. Az inhibitor :1 össztérfogatban volt vízben. Ezután a következõ reagenseket adtuk: 0,2 M kálium-foszfát-puffer ph=7,6 a teljes 300 l reakció-térfogatra, 50 l frissen készített kromogénoldat a fentiek szerint, valamint 50 l MAO-készítmény. A tálcákat 30 percig 37 C¹on inkubáltuk, a háttérelnyelést 490 nm¹en egy Wallac Victor II tálcás számlálón mértük. Az enzimreakciót l 5 mm tiraminnal (végkoncentráció 0,5 mm) indítottuk, és a tálcát 1 h hosszat 37 C¹on inkubáltuk. A MAO-aktivitást tükrözõ fényelnyelés-növekedést 490 nm¹en mértük. A gátlást százalékos gátlásként fejeztük ki a kontrollhoz viszonyítva, a háttérelnyelésre korrigálva, és a GraphPad Prism programmal IC50 értékeket számítva. A MAO-gátlás pozitív kontrolljaiként clorgyline és pargyline MAO¹A és B¹inhibitorokat adtunk 0,5 M koncentrációban egyes lyukakba. A 3. táblázat szerinti vegyületek VAP¹1 SSAO-aktivitást gátló képessége és specificitása a patkány- MAO-hoz képest a 2. táblázatban látható. Az eredmények azt mutatják, hogy a vegyületek az emberi VAP¹1 SSAO-aktivitás specifikus inhibitorai. A vegyületek ennek megfelelõen várhatóan terápiás alkalmazhatósággal rendelkeznek olyan betegségek és állapotok kezelésében, melyekben az emberi adhéziós molekula, a VAP¹1 SSAO-aktivitása szerepet játszik. 3. táblázat A vizsgált vegyületek potenciája és specificitása Vegyület VAP¹1 SSAO-gátló aktivitás IC50 M Teljes MAO-gátló aktivitás IC50 M Szelektivitás a VAP¹1 SSAO¹ra a MAO-hoz képest 1. (BTT-66) 0,37 13 35 4. 0,43 10 23 7. 0,44 6,0 14 10. 0,55 6,0 11 13. 0,64 3,3 5 16. 0,35 7,4 21 2. 0,52 8,7 17 5. 0,52 4,0 8 8. 0,65 10 11. 0,27 11 41 (BTT-67) 14. 0,37 3,4 9 17. 0,43 6,1 14 3. 0,26 3,3 13 6. 0,09 3,3 37 9. 0,21 41 195 (BTT-71) 12. 0,33 37 112 (BTT-72). (BTT-72), S¹enantiomer 0,34 32 94 10
3. táblázat (folytatás) Vegyület VAP¹1 SSAO-gátló aktivitás IC50 M Teljes MAO-gátló aktivitás IC50 M Szelektivitás a VAP¹1 SSAO¹ra a MAO-hoz képest 18. 0,39 21 62 (BTr-72), R¹enantiomer 19. 0, 8,8 45 (BTT-73). 0,34 9,6 28 Hivatkozások jegyzéke Collaborative Computational Project, Number 4. (1994). Acta Cryst, D50, 760 763. Dawkes, H. C. & Phillips, S. E. (01). Curr Opin Struct Biol, 11, 666 673. Holt, A., Sharman, D. F., Baker, G. B. & Palcic, M. M. (1997). Anal Biochem, 244, 384 392. Kabsch, W. (1993). Journal of Applied Crystallography, 26, 795 800. Kumar, V., Dooley, D. M., Freeman, H. C., Guss, J. M., Harvey, L., McGuirl, M. A., Wilce, M. C. & Zubak, V. M. (1996). Structure, 4, 943 955. Li, R., Klinman, J. P. & Mathews, F. S. (1998)., Structure, 6, 293 307. Parsons, M. R., Convery, M. A., Wilmot, C. M., Yadav, K. D., Blakeley, V., Corner, A. S., Phillips, S. E., McPherson, M. J. & Knowles, P. F. (1995). Structure, 3, 1171 1184. Salmi, M. & Jalkanen, S. (1996). J Exp Med, 183, 569 579. Salmi, M. & Jalkanen, S. (01). Trends Immunol, 22, 211 216. Smith, D. J., Salmi, M., Bono, P., Hellman, J., Leu, T. & Jalkanen, S. (1998). J Exp Med, 188, 17 27. Wilce, M. C., Dooley, D. M., Freeman, H. C., Guss, J. M., Matsunami, H., Mclntire, W. S., Ruggiero, C. E., Tanizawa, 25 30 35 K. & Yamaguchi, H. (1997). Biochemistry, 36, 16 116 16 133. Jones, T. A., Zou, J. Y., Cowan, S. W., and Kjeldgaard (1991). Acta Crystallogr A 47 (Pt2),_110 119. Kleywegt, G. J., and Jones, T. A. (1998). Acta Cryst D 54, 1119 1131. Laskowski, R. A., Macarthur, M. W., Moss, D. S., and Thornton, J. M. (1993). Journal of Applied Crystallography 26, 283 291. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., and Dodson, E. J. (1997). Acta Crystallogr D 53, 240 255. Navaza, J. (1994). Amore an Automated Package for Molecular Replacement. Acta Cryst A 50, 7 163. Ramachandran, G. N., and Sasisekharan, V. (1968). Adv Protein Chem 23, 283 438. Shepard, E. M., Smith, J., Bradley, O. E., Kuchar, J. A., Lawrence, M. S. and Dooley, D. M. (02). Eurl J. Biochem. 269, 3645 3658. van Aalten, D. M., Bywater, R., Findlay, J. B., Hendlich, M., Hooft, R. W., and Vriend, G. (1996). J Comput Aided Mol Des 10, 255 262. Wilmot, C. M., Hajdu, J., McPherson, M. J., Knowles, P. F., and Phillips, S. E. (1999). Science 286_(5445), 1724 8. Word, J. M., Lovell, S. C., Richardson, J. S., and Richardson, D. C. (1999) J Mol Biol 285, 1735 47. Szekvencialista <110> Biotie Therapies Oyj <1> Crystalline mammalian VAP¹1 and uses thereof <130> VAP-Cryst <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2292 <212> DNA <213> Homo sapiens 11
HU 007 018 T2 <400> 1 atgaaccaga agacaatcct cgtgctcctc attctggccg tcatcaccat ctttgccttg 60 gtttgtgtcc tgctggtggg caggggtgga gatgggggtg aacccagcca gcttccccat 1 tgcccctctg tatctcccag tgcccagcct tggacacacc ctggccagag ccagctgttt 180 gcagacctga gccgagagga gctgacggct gtgatgcgct ttctgaccca gcggctgggg 240 ccagggctgg tggatgcagc ccaggcccgg ccctcggaca actgtgtctt ctcagtggag 300 ttgcagctgc ctcccaaggc tgcagccctg gctcacttgg acagggggag ccccccacct 360 gcccgggagg cactggccat cgtcttcttt ggcaggcaac cccagcccaa cgtgagtgag 4 ctggtggtgg ggccactgcc tcacccctcc tacatgcggg acgtgactgt ggagcgtcat 480 ggaggccccc tgccctatca ccgacgcccc gtgctgttcc aagagtacct ggacatagac 540 cagatgatct tcaacagaga gctgccccag gcttctgggc ttctccacca ctgttgcttc 600 tacaagcacc ggggacggaa cctggtgaca atgaccacgg ctccccgtgg tctgcaatca 660 ggggaccggg ccacctggtt tggcctctac tacaacatct cgggcgctgg gttcttcctg 7 caccacgtgg gcttggagct gctagtgaac cacaaggccc ttgaccctgc ccgctggact 780 atccagaagg tgttctatca aggccgctac tacgacagcc tggcccagct ggaggcccag 840 tttgaggccg gcctggtgaa tgtggtgctg atcccagaca atggcacagg tgggtcctgg 900 tccctgaagt cccctgtgcc cccgggtcca gctccccctc tacagttcta tccccaaggc 960 ccccgcttca gtgtccaggg aagtcgagtg gcctcctcac tgtggacttt ctcctttggc 10 ctcggagcat tcagtggccc aaggatcttt gacgttcgct tccaaggaga aagactagtt 1080 tatgagataa gcctccaaga ggccttggcc atctatggtg gaaattcccc agcagcaatg 1140 acgacccgct atgtggatgg aggctttggc atgggcaagt acaccacgcc cctgacccgt 10 ggggtggact gcccctactt ggccacctac gtggactggc acttcctttt ggagtcccag 1260 gcccccaaga caatacgtga tgccttttgt gtgtttgaac agaaccaggg cctccccctg 13 cggcgacacc actcagatct ctactcgcac tactttgggg gtcttgcgga aacggtgctg 1380 gtcgtcagat ctatgtccac cttgctcaac tatgactatg tgtgggatac ggtcttccac 1440 cccagtgggg ccatagaaat acgattctat gccacgggct acatcagctc ggcattcctc 00 tttggtgcta ctgggaagta cgggaaccaa gtgtcagagc acaccctggg cacggtccac 60 acccacagcg cccacttcaa ggtggatctg gatgtagcag gactggagaa ctgggtctgg 16 gccgaggata tggtctttgt ccccatggct gtgccctgga gccctgagca ccagctgcag 1680 aggctgcagg tgacccggaa gctgctggag atggaggagc aggccgcctt cctcgtggga 1740 agcgccaccc ctcgctacct gtacctggcc agcaaccaca gcaacaagtg gggtcacccc 1800 cggggctacc gcatccagat gctcagcttt gctggagagc cgctgcccca aaacagctcc 1860 atggcgagag gcttcagctg ggagaggtac cagctggctg tgacccagcg gaaggaggag 19 gagcccagta gcagcagcgt tttcaatcag aatgaccctt gggcccccac tgtggatttc 1980 agtgacttca tcaacaatga gaccattgct ggaaaggatt tggtggcctg ggtgacagct 40 ggttttctgc atatcccaca tgcagaggac attcctaaca cagtgactgt ggggaacggc 2100 gtgggcttct tcctccgacc ctataacttc tttgacgaag acccctcctt ctactctgcc 2160 gactccatct acttccgagg ggaccaggat gctggggcct gcgaggtcaa ccccctagct 22 tgcctgcccc aggctgctgc ctgtgccccc gacctccctg ccttctccca cgggggcttc 2280 tctcacaact ag 2292 <210> 2 <211> 763 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Gln Lys Thr Ile Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Thr 1 5 10 Ile Phe Ala Leu Val Cys Val Leu Leu Val Gly Arg Gly Gly Asp Gly 25 30 Gly Glu Pro Ser Gln Leu Pro His Cys Pro Ser Val Ser Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Pro Trp Thr His Pro Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser 50 55 60 12
HU 007 018 T2 Arg Glu Glu Leu Thr Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly 65 70 75 80 Pro Gly Leu Val Asp Ala Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val 85 90 95 Phe Ser Val Glu Leu Gln Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His 100 105 110 Leu Asp Arg Gly Ser Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val 1 1 125 Phe Phe Gly Arg Gln Pro Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly 130 135 140 Pro Leu Pro His Pro Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His 145 0 5 160 Gly Gly Pro Leu Pro Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr 165 170 175 Leu Asp Ile Asp Gln Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser 180 185 190 Gly Leu Leu His His Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu 195 0 5 Val Thr Met Thr Thr Ala Pro Arg Gly Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala 210 2 2 Thr Trp Phe Gly Leu Tyr Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu 225 230 235 240 His His Val Gly Leu Glu Leu Leu Val Asn His Lys Ala Leu Asp Pro 245 250 255 Ala Arg Trp Thr Ile Gln Lys Val Phe Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp 260 265 270 Ser Leu Ala Gln Leu Glu Ala Gln Phe Glu Ala Gly Leu Val Asn Val 275 280 285 Val Leu Ile Pro Asp Asn Gly Thr Gly Gly Ser Trp Ser Leu Lys Ser 290 295 300 Pro Val Pro Pro Gly Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe Tyr Pro Gln Gly 305 310 3 3 Pro Arg Phe Ser Val Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser Ser Leu Trp Thr 325 330 335 Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg Ile Phe Asp Val 340 345 350 Arg Phe Gln Gly Glu Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser Leu Gln Glu Ala 355 360 365 Leu Ala Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Pro Ala Ala Met Thr Thr Arg Tyr 370 375 380 13
HU 007 018 T2 Val Asp Gly Gly Phe Gly Met Gly Lys Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Arg 385 390 395 400 Gly Val Asp Cys Pro Tyr Leu Ala Thr Tyr Val Asp Trp His Phe Leu 405 410 4 Leu Glu Ser Gln Ala Pro Lys Thr Ile Arg Asp Ala Phe Cys Val Phe 4 425 430 Glu Gln Asn Gln Gly Leu Pro Leu Arg Arg His His Ser Asp Leu Tyr 435 440 445 Ser His Tyr Phe Gly Gly Leu Ala Glu Thr Val Leu Val Val Arg Ser 450 455 460 Met Ser Thr Leu Leu Asn Tyr Asp Tyr Val Trp Asp Thr Val Phe His 465 470 475 480 Pro Ser Gly Ala Ile Glu Ile Arg Phe Tyr Ala Thr Gly Tyr Ile Ser 485 490 495 Ser Ala Phe Leu Phe Gly Ala Thr Gly Lys Tyr Gly Asn Gln Val Ser 500 505 510 Glu His Thr Leu Gly Thr Val His Thr His Ser Ala His Phe Lys Val 5 5 525 Asp Leu Asp Val Ala Gly Leu Glu Asn Trp Val Trp Ala Glu Asp Met 530 535 540 Val Phe Val Pro Met Ala Val Pro Trp Ser Pro Glu His Gln Leu Gln 545 550 555 560 Arg Leu Gln Val Thr Arg Lys Leu Leu Glu Met Glu Glu Gln Ala Ala 565 570 575 Phe Leu Val Gly Ser Ala Thr Pro Arg Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser Asn 580 585 590 His Ser Asn Lys Trp Gly His Pro Arg Gly Tyr Arg Ile Gln Met Leu 595 600 605 Ser Phe Ala Gly Glu Pro Leu Pro Gln Asn Ser Ser Met Ala Arg Gly 610 6 6 Phe Ser Trp Glu Arg Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln Arg Lys Glu Glu 625 630 635 640 Glu Pro Ser Ser Ser Ser Val Phe Asn Gln Asn Asp Pro Trp Ala Pro 645 650 655 Thr Val Asp Phe Ser Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr Ile Ala Gly Lys 660 665 670 Asp Leu Val Ala Trp Val Thr Ala Gly Phe Leu His Ile Pro His Ala 675 680 685 Glu Asp Ile Pro Asn Thr Val Thr Val Gly Asn Gly Val Gly Phe Phe 690 695 700 14
HU 007 018 T2 Leu Arg Pro Tyr Asn Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser Phe Tyr Ser Ala 705 710 7 7 Asp Ser Ile Tyr Phe Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly Ala Cys Glu Val 725 730 735 Asn Pro Leu Ala Cys Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Ala Pro Asp Leu 740 745 750 Pro Ala Phe Ser His Gly Gly Phe Ser His Asn 755 760 <210> 3 <211> 1 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser Arg Glu Glu Leu Thr Ala 1 5 10 Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly Pro Gly Leu Val Asp Ala 25 30 Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val Phe Ser Val Glu Leu Gln 35 40 45 Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His Leu Asp Arg Gly Ser Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val Phe Phe Gly Arg Gln Pro 80 Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly Pro Leu Pro His Pro Ser 85 90 95 Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His Gly Gly Pro Leu Pro Tyr 100 105 110 His Arg Arg 1 <210> 4 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr Leu Asp Ile Asp Gln Met Ile Phe Asn 1 5 10 Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Leu His His Cys Cys Phe Tyr 25 30 Lys His Arg Gly Arg Asn Leu Val Thr Met Thr Thr Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala Thr Trp Phe Gly Leu Tyr Tyr Asn Ile 50 55 60
HU 007 018 T2 Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu His His Val Gly Leu Glu Leu Leu Val 65 70 75 80 Asn His Lys Ala Leu Asp Pro Ala Arg Trp Thr Ile Gln Lys Val Phe 85 90 95 Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Gln Leu Glu Ala Gln Phe 100 105 110 Glu Ala Gly Leu Val Asn Val Val Leu Ile Pro Asp Asn Gly Thr Gly 1 1 125 Gly Ser Trp 130 <210> 5 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Leu Lys Ser Pro Val Pro Pro Gly Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe 1 5 10 Tyr Pro Gln Gly Pro Arg Phe Ser Val Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser 25 30 Ser Leu Trp Thr Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg 35 40 45 Ile Phe Asp Val Arg Phe Gln Gly Glu Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser 50 55 60 Leu Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Pro Ala Ala Met 65 70 75 80 Thr Thr Arg Tyr Val Asp Gly Gly Phe Gly Met Gly Lys Tyr Thr Thr 85 90 95 Pro Leu Thr Arg Gly Val Asp Cys Pro Tyr Leu Ala Thr Tyr Val Asp 100 105 110 Trp His Phe Leu Leu Glu Ser Gln Ala Pro Lys Thr Ile Arg Asp Ala 1 1 125 Phe Cys Val Phe Glu Gln Asn Gln Gly Leu Pro Leu Arg Arg His His 130 135 140 Ser Asp Leu Tyr Ser His Tyr Phe Gly Gly Leu Ala Glu Thr Val Leu 145 0 5 160 Val Val Arg Ser Met Ser Thr Leu Leu Asn Tyr Asp Tyr Val Trp Asp 165 170 175 Thr Val Phe His Pro Ser Gly Ala Ile Glu Ile Arg Phe Tyr Ala Thr 180 185 190 Gly Tyr Ile Ser Ser Ala Phe Leu Phe Gly Ala Thr Gly Lys Tyr Gly 195 0 5 16
Asn Gln Val Ser Glu His Thr Leu Gly Thr Val His Thr His Ser Ala 210 2 2 His Phe Lys Val Asp Leu Asp Val Ala Gly Leu Glu Asn Trp Val Trp 225 230 235 240 Ala Glu Asp Met Val Phe Val Pro Met Ala Val Pro Trp Ser Pro Glu 245 250 255 His Gln Leu Gln Arg Leu Gln Val Thr Arg Lys Leu Leu Glu Met Glu 260 265 270 Glu Gln Ala Ala Phe Leu Val Gly Ser Ala Thr Pro Arg Tyr Leu Tyr 275 280 285 Leu Ala Ser Asn His Ser Asn Lys Trp Gly His Pro Arg Gly Tyr Arg 290 295 300 Ile Gln Met Leu Ser Phe Ala Gly Glu Pro Leu Pro Gln Asn Ser Ser 305 310 3 3 Met Ala Arg Gly Phe Ser Trp Glu Arg Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln 325 330 335 Arg Lys Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser Ser Val Phe Asn Gln Asn Asp 340 345 350 Pro Trp Ala Pro Thr Val Asp Phe Ser Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr 355 360 365 Ile Ala Gly Lys Asp Leu Val Ala Trp Val Thr Ala Gly Phe Leu His 370 375 380 Ile Pro His Ala Glu Asp Ile Pro Asn Thr Val Thr Val Gly Asn Gly 385 390 395 400 Val Gly Phe Phe Leu Arg Pro Tyr Asn Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser 405 410 4 Phe Tyr Ser Ala Asp Ser Ile Tyr Phe Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly 4 425 430 Ala Cys Glu Val Asn Pro Leu Ala Cys Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys 435 440 445 Ala Pro Asp Leu Pro Ala Phe Ser His Gly Gly Phe Ser 450 455 460 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Kristályos, 1. számú emberi vaszkuláris adhéziós fehérje (VAP¹1), amely kristály a P6522 szimmetriacsoportba tartozó, az aszimmetrikus egységben két molekulát tartalmazó kristályként van definiálva, elemi cellájának mérete a=b=225,9 Å, c=218,7 Å, = =90, =1. 2. Az 1. igénypont szerinti kristályos VAP-1, mely D2, D3 és D4 doménokat tartalmaz, rendre a SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 és SEQ ID NO. 5 szerinti aminosavsorrendekkel jellemezve. 50 55 60 3. A 2. igénypont szerinti VAP¹1 fehérje, mely egy aktívcentrum-üreget tartalmaz, mely üreg kb. Å kb. 10 Å széles a felszínen, és kb. Å mély. 4. A 3. igénypont szerinti kristályos VAP¹1 fehérje, ahol az aktívcentrum-üreg az emberi VAP¹1 egyik monomerjébõl a SEQ ID NO. 2 szerinti 86 87, 97, 168 173, 176 177, 180, 184, 5 212, 216, 227, 232 234, 236 239, 344, 388 390, 393 397, 4 419, 421, 421 426, 467 470, 647 651 és 758 761 számú aminosavakat, a másik monomerjébõl a SEQ ID NO. 2 szerinti 443 449 és 451 számú aminosavakat tartalmazza. 17
5. A 4. igénypont szerinti kristályos VAP¹1 fehérje, ahol az aktív centrum a Leu469 aminosavat is tartalmazza egy, az üreg alján elhelyezkedõ keskeny, kb. 4,5 Å 4,5 Å üreg tetején. 6. Az 5. igénypont szerinti kristályos VAP¹1 fehérje, ahol az aktív centrum üregének alsó részét az AIa370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 és Tyr473 aminosavak határolják. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti kristályos VAP¹1 fehérjét tartalmazó készítmény. 8. Az emberi VAP¹1 kristályosítására szolgáló eljárás, mely tartalmazza a következõ lépéseket: a) 1 mg/ml emberi VAP¹1 fehérjét tartalmazó 10 mm kálium-foszfát-pufferoldat (ph=7,2) elõállítása, b) 1,0 M K¹Na-tartarátot és 0 250 mm NaCl¹ot mint kicsapó ágenst tartalmazó 100 mm imidazolpuffer (ph=7,8), mint kristályosító oldat elõállítása, c) a vizes oldat egy térfogatának és a kristályosító oldat egy térfogatának összekeverésével kevert oldat elõállítása; és d) a kevert oldat legalább egy részének kristályosítása gõzdiffúzióval. 9. Eljárás az emberi VAP¹1 fehérjével kölcsönhatásba lépõ vegyület azonosítására, mely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: a) a fehérje atomi koordinátáinak elõállítása számítógép által olvasható hordozón, mely hordozó az emberi VAP¹1 fehérje háromdimenziós szerkezetét definiáló atomi koordinátákat/röntgendiffrakciós adatokat tárolja, és megfelelõ géppel beolvasva és molekuláris szerkezetek meghatározására szolgáló számítógépes programmal feldolgozva képes az emberi VAP¹1 fehérje egy fragmensét tartalmazó molekula kristályának háromdimenziós ábrázolására, ahol az adatok az emberi VAP¹1 fehérje aktív centrumának üregét definiálják, és az aktívcentrum-üreg kb. Å kb. 10 Å széles a felszínen, kb. Å mély és a Leu469 aminosavat is tartalmazza egy, 5 10 25 30 35 az üreg alján elhelyezkedõ keskeny, kb. 4,5 Å 4,5 Å üreg tetején, és b) számítógép alkalmazásával molekuláris modellezõ technikák alkalmazása az atomi koordinátákra. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol az aktívcentrum-üreg tartalmazza az emberi VAP¹1 egyik monomerjébõl a 86 87, 97, 168 173, 176 177, 180, 184, 5 212, 216, 227, 232 234, 236 239, 344, 388 390, 393 397, 4 419, 421, 421 426, 467 470, 647 651 és 758 761 számú aminosavakat, és a másik monomerjébõl a 443 449 és 451 számú aminosavakat. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, ahol az aktív centrum üregének alsó részét az Ala370, Tyr384, Asp386, Asn470, Tpq471 és Tyr473 aminosavak határolják. 12. A 9 11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a molekuláris modellezõ technikák tartalmaznak de novo vegyülettervezést. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a de novo vegyülettervezés tartalmazza (i) a VAP¹1 aktív centrumában lévõ oldalláncokkal kölcsönhatásba lépni képes funkcionális csoportok vagy kis molekulájú fragmensek azonosítását és (ii) ezek összekapcsolását egyetlen vegyületté. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a molekuláris modellezõ technikák a VAP¹1 valamely farmakoforját alkalmazzák.. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol a molekulamodellezõ technikák automatikus dokkoló algoritmusokat alkalmaznak. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, mely a következõ további lépéseket is tartalmazza: (c) a molekuláris modellezõ technikákkal azonosított vegyület elõállítása és (d) a vegyület érintkeztetése az VAP-1-gyel és a vegyületnek a VAP¹1 SSAO-aktivitását gátló hatásának észlelése. 18
HU 007 018 T2 Int. Cl.: C12N 9/00 19
HU 007 018 T2 Int. Cl.: C12N 9/00