!HU000007T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 7 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 026690 (22) A bejelentés napja: 03. 11.. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 0026690 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1424399 A1 04. 06. 02. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1424399 B1 09. 02. 11. (1) Int. Cl.: C12P 19/36 (06.01) A23L 1/48 (06.01) A61K 31/00 (06.01) A61K 31/7084 (06.01) () Elsõbbségi adatok: 2499 02. 11. 26. DE (72) Feltalálók: Gupta, Antje, Dr., 67 Wiesbaden (DE); Zimmer, Anke, 6 Wiesbaden (DE) (73) Jogosult: IEP GmbH, 63 Wiesbaden (DE) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) Eljárás NAD és NADP enzimatikus redukciójára (7) Kivonat NAD vagy NADP enzimatikus redukciója, amely során vizet és legalább egy alkálifém-formiátot inkubálnak formiát-dehidrogenázzal (FDH) (I), eltávolítják a képzõdött alkáli-karbonátot (II) 0, tömeg% mennyiségig, és izolálják az NAD(P)H¹t mint terméket. Független igénypont vonatkozik egy készítményre (A), amely a nem illó alkotórészekre vonatkoztatva 80 9 tömeg% NAD(P)H¹t és 0, tömeg% (II)¹t tartalmaz. HU 00 7 T2 A leírás terjedelme 6 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 00 7 T2 2 A találmány tárgyát képezi eljárás redukált nikotinamidadenin-dinukleotid (a továbbiakban NADH) vagy redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (a továbbiakban NADPH) enzimatikus elõállítására nikotinamid-adenin-dinukleotid (a továbbiakban NAD) vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (a továbbiakban NADP) formiát-dehidrogenáz által katalizált redukciója útján, és a találmány tárgyát képezi egy stabil NADHvagy NADPH-készítmény. Az NADH¹t vagy NADPH¹t ez idáig túlnyomórészt az enzimes analitika és az orvosi diagnosztika területén alkalmazták, ahol különbözõ oxidoreduktázenzimvizsgálatokban alkalmazzák. Mióta felfedezték, hogy az NADH pozitív terápiás hatást mutat fáradtság, Jet lag (idõzóna-betegség) kezelésében és elõsegíti az olyan betegségek, mint Alzheimer¹, Parkinson-kór és depresszió kezelését, az NADH¹t széles körben alkalmazzák táplálékkiegészítõ szerként (US.444.03). Ennek következményeképpen egyre nõ az igény NADH¹ra. Az NADH¹t eddig sör- vagy sütõélesztõbõl kivont NAD-bõl és azt követõen NADH¹vá történõ redukcióval állítják elõ. NAD-nek NADH¹vá történõ redukciójára számos enzimatikus eljárás ismert [Chenault, H. és munkatársai, Applied Biochemistry and Biotechnology, 14, 147 197 (1987)]. Elõnyösen alkohol-dehidrogenázt, formiát-dehidrogenázt, glükóz-dehidrogenázt és glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt alkalmaznak. Az NADH elõállítása tömegméretekben lényegében alkohol-dehidrogenázzal és etanollal történik. Ehhez az etanolt nagy feleslegben alkalmazzák, és a keletkezõ illékony acetaldehidet folyamatosan elvezetik. Ennek az eljárásnak az elõnye a kedvezõ árú etanol és a nagy mennyiségben rendelkezésre álló alkohol-dehidrogenáz Saccharomyces cerevisiae-bõl. Az eljárás hátránya az NAD nem teljes átalakulása NADH¹vá és a szintézis során keletkezõ, toxikus acetaldehid. Az NADPH elõállítása például enzimatikusan történhet NADH-ból NADH-kinázzal (DE 42 01 9 A1). Ismert az NADH-nak formiát-dehidrogenázzal történõ enzimatikus elõállítása is. Ilyenkor rendszerint nátrium-formiátot vagy ammónium-formiátot alkalmaznak. Az NAD-nek formiát-dehidrogenázzal történõ redukciója során szén-dioxid keletkezik, amely savas ph¹értékektõl a semleges ph¹értékig a reakciókeverékbõl elillan. A képzõdõ NADH és az alkalmazott formiát-dehidrogenáz stabilizálásához azonban a 7, 8, ph¹értékek lényegesen kedvezõbbek. A ph¹értéket egy alkalmas bázissal, például ammóniummal, NaOH-dal vagy KOH-dal történõ titrálással állandó értéken tartják. Ekkor az alkalmazott nátrium-formiátból vagy ammóniumformiátból a megfelelõ nátrium- vagy ammónium-karbonát képzõdik. Ezeknek a karbonátsóknak bár megvan az a nagy elõnyük, hogy stabilizálják az NADH¹t ugyanakkor hátrányuk, hogy az NADH-tól nagyon rosszul választhatók el, és nagy mennyiségben az NADH szárításánál víz és etanol megkötésével problémát okozhatnak. A NADH production from NAD+ using Formate Dehydrogenase System with Cells of a Methanol-Utilizing 1 2 3 4 0 60 Bacterium címû cikkben [Izumi, Y. és munkatársai., Journal of Fermentation Technology, Tokyo, Japan, 61 (2), 13 142 (1983)] leírnak egy eljárást NAD enzimatikus redukciójára formiát-dehidrogenázzal, kálium-foszfát-pufferrel és nátrium-formiáttal reakciókeverékben. Alkálifém-karbonát képzõdését nem említik. Az alkalmazott Na¹karbonát-puffer ph¹értéke 9,2 és,7 közötti érték. A CO2 Reduction to Formate by NADH Catalysed by Formate Dehydrogenase from Pseudomonas oxalaticus címû cikkben Ruschig, U. és munkatársai [EUR. J. BIOCHEM, 70, 32 3 (1976)] leírják CO 2 közvetlen redukcióját formiáttá NADH termelõdése mellett. A redukálószer regenerálására szolgáló rendszert nem említenek. Egy formiát-dehidrogenázt, CO 2 ¹ot, HCO 2 ¹t, NAD¹t, NADH¹t tartalmazó rendszer egyensúlyi koncentrációt ér el, amely termodinamikai megfontolások alapján megjósolható. A reakció azonban megfordítható az egyensúly eltolásával. A találmány az eljárási körülmények és az eljárási lépések módosításával az említett hátrányok kiküszöbölését célozza meg. A találmány szerint ezt a feladatot NAD-nek vagy NADP-nek vizes, formiát-dehidrogenázzal és legalább egy alkálifém-formiáttal történõ enzimatikus redukciójával kívánjuk megoldani, ahol az NADH vagy NADPH izolálása elõtt a képzõdött alkálifém-karbonátot 0, tömeg% mennyiségig az oldatból eltávolítjuk. A találmány szerinti eljárásban a képzõdõ szén-dioxid nagy része például kalciumionok révén kicsapódik, és a szén-dioxid körülbelül 0, %¹a az alkalmazott alkálifémsó által például nátrium-karbonát formájában a reakciókeverékben marad. A nátrium-karbonát révén a képzõdött NADH vagy NADPH a teljes elõállítási eljárás során optimálisan stabilizált állapotban marad, ugyanakkor jól szárítható. A nátrium-karbonát itt nem zavar, mivel élelmiszer-kiegészítõként és stabilizátorként is alkalmazzák. A találmány tárgyát képezi eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP) enzimatikus redukciójára, amely azzal jellemezhetõ, hogy (a) NAD¹t vagy NADP¹t formiát-dehidrogenázzal és vízzel (b) és legalább egy alkálifém-formiáttal inkubálunk, (c) a képzõdött alkálifém-karbonátot vagy ammóniumkarbonátot egy alkáliföldfémsóval történõ kicsapással 0, tömeg% mennyiségig az oldatból eltávolítjuk, és (d) a képzõdött redukált nikotinamid-adenin-dinukleotidot (NADH) vagy nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfátot (NADP) izoláljuk. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás NAD vagy NADP enzimatikus redukciójára, amely azzal jellemezhetõ, hogy (a) NAD¹t vagy NADP¹t, formiát-dehidrogenázt és vizet (b) egy keverékkel, amely legalább egy alkálifém-formiátot és legalább egy alkáliföldfém-formiátot tartalmaz, inkubálunk, és (c) a képzõdött NADH¹t vagy NADPH¹t izoláljuk. 2
1 HU 00 7 T2 2 A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás NAD vagy NADP enzimatikus redukciójára, amely azzal jellemezhetõ, hogy (a) NAD¹t vagy NADP¹t, formiát-dehidrogenázt és vizet (b) egy nátrium-formiátot és kalcium-formiátot tartalmazó keverékkel inkubálunk, és (c) a képzõdött NADH¹t vagy NADPH¹t izoláljuk. Az alkálifém-formiát kifejezésen hangyasav vízoldható sóit értjük, mint lítium¹, nátrium¹, kálium¹, rubídium- vagy cézium-formiátot. Alkálifém-formiátként ammónium-formiát is alkalmazható. Az alkáliföldfémformiát kifejezésen hangyasav sóit értjük, mint berillium¹, magnézium¹, kalcium¹, stroncium- vagy báriumformiátot. A találmány szerinti eljárás például egy üvegbõl vagy fémbõl készült, zárt reakcióedényben végrehajtható. A komponenseket, az NAD¹t vagy NADP¹t, az alkálifém-formiátot, az alkáliföldfém-formiátot, a formiátdehidrogenázt és a vizet egyenként a reakcióedénybe visszük, és például nitrogén- vagy levegõlégkörben kevertetjük. Az NAD¹t szilárd formában vagy elõnyösen vízben oldva alkalmazzuk. Az NAD sör- vagy sütõélesztõbõl extrakcióval nyerhetõ. A szintézis kiindulási keverékében az NAD vagy NADP koncentrációja 1% és % közötti, elõnyösen % és 2% közötti. Ezek a százalékos értékek az NADH vagy NADPH végkoncentrációjára vonatkoznak a szintézis végén az NAD vagy NADP teljes hozzáadását követõen. Az NAD-nek teljes mértékben NADH¹vá alakulásához, illetve az NADP-nek teljes mértékben NADPH¹vá alakulásához a formiátnak alkálifém-formiátként legalább ekvimoláris mennyiségben, elõnyösen azonban az alkalmazott NAD-hez vagy NADP-hez képest feleslegben kell lenni. A formiát akár hússzoros moláris feleslegben is alkalmazható, elõnyösen 2 -szeres moláris feleslegben. A képzõdött alkálifém-karbonát eltávolítása az oldatból 0, tömeg% mennyiségig egy szerves vagy szervetlen alkáliföldfémsóval, például kalcium-kloriddal, kalcium-oxaláttal, kalcium-acetáttal, kalcium-maleáttal, magnézium-oxaláttal, magnézium-acetáttal vagy magnézium-maleáttal történõ kicsapással végezhetõ el. A képzõdött alkálifém-karbonát eltávolítása azonban az alkáliföldfém-formiátnak az alkálifém-formiáttal egy idõben történõ hozzáadásával, vagy az NADH vagy az NADPH izolálása elõtt is elvégezhetõ. Az alkáliföldfém-formiát aránya az NAD-hez vagy az NADP-hez 0,4 0,9 mol alkáliföldfém-formiát 1 mol NAD-hez vagy NADP-hez képest, elõnyösen 0, 0,7 mol közötti mennyiség. Alkalmas NAD-függõ formiát-dehidrogenázok például Pseudomonas sp. 1, Candida boidinii vagy Candida methylica törzsekbõl származnak [Gene 162, 99 4 (199)]. Alkalmas NADP-függõ formiát-dehidrogenázok szintén ismertek [Seelbach, K. és munkatársai, A novel efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase Tetrahedron Letters 37, 1377 1380 (1996) vagy Tishkov és munkatársai., Pilot-scale production and isolation of 1 2 3 4 0 60 recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase J. Biotechnol. Bioeng. 64, 187 193 (1999)]. Az alkalmazandó enzimmennyiség körülbelül 00 U és 1 000 000 U között lehet a reakciókeverékben alkalmazott NAD vagy NADP egy kilogrammjára számolva, elõnyösen 000 0 000 U/kg között. Egy Unit (U) enzimegység annak az enzimmennyiségnek felel meg, amely 1 mol NAD vagy NADP egy perc (min) alatt történõ átalakításához szükséges. A reakció alatt a reakcióoldat ph¹ját 7 és 9 közötti, állandó értéken tartjuk, elõnyösen 7, és 8, között. Ezt egy alkalmas lúg vagy sav hozzáadásával érjük el, elõnyösen ammóniumionok hozzáadásával. A hõmérséklet például C és 70 C közötti érték, elõnyösen C és 3 C között. A reakcióidõ perctõl óráig terjed, elõnyösen 0 perc (min) és 0 perc (min), elõnyösebben 1 perc és perc között. Végül a reakciókeveréket feldolgozzuk. Az oldhatatlan részektõl, mint például kalcium-karbonát, centrifugálással vagy szûréssel történõ elválasztást követõen az alkalmazott formiát-dehidrogenázt ultraszûréssel távolítjuk el. Az ultraszûrés az alkáli-karbonát kicsapása elõtt is történhet. Az ultraszûréssel kapott anyagot például etanollal kicsapjuk. A karbonát oldható része, mint például nátrium-karbonát ekkor a kapott NADH-val vagy NADPH-val együtt szilárd anyagként kicsapódik. A reakciókeverékben az NADH vagy az NADPH magas koncentrációja miatt semmilyen további koncentrálási lépésre nincs szükség a termék kicsapása elõtt. Az elválasztott formiát-dehidrogenáz újra felhasználható. Az etanollal történõ kicsapást követõen a kapott terméket mossuk, és csökkentett nyomáson szárítjuk. A találmány tárgyát képezi továbbá egy készítmény, amely (a) NADH¹t vagy NADPH¹t tartalmaz 80 9 tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva és alkálifém-karbonátot 0, tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva. A találmány tárgyát képezi továbbá egy készítmény, amely (a) NADH¹t vagy NADPH¹t tartalmaz 80 9 tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva (b) alkálifém-karbonátot 0, tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva, és (c) vizet 3 7 tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva. Az alkálifém-karbonát kifejezésen szénsav sóit értjük, mint például lítium¹, nátrium¹, kálium¹, rubídiumvagy cézium-karbonátot vagy hidrogén-karbonátot. A készítmény még további illó vagy nem illó alkotórészeket is tartalmazhat, amennyiben az NADH és az alkálifém-karbonát mennyisége a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva nem haladja meg vagy nem éri el a megadott határértékeket. Az NADH vagy NADPH mennyisége mindenkor a találmány szerinti készítmény nem illó alkotórészeire 3
1 HU 00 7 T2 2 vonatkozik, és elõnyösen 8 tömeg% és 9 tömeg% közötti, elõnyösebben 89 tömeg% és 91 tömeg% közötti mennyiség. Az alkálifém-karbonát mennyisége mindenkor a találmány szerinti készítmény nem illó alkotórészeire vonatkozik, és elõnyösen 1 tömeg% és 3 tömeg% közötti, elõnyösebben 1, tömeg% és 2, tömeg% közötti mennyiség. A víz mennyisége mindenkor a találmány szerinti készítmény nem illó alkotórészeire vonatkozik, és elõnyösen 3 tömeg% és 8 tömeg% közötti, elõnyösebben tömeg% és 6 tömeg% közötti mennyiség. A találmány szerinti készítmény elõállítása például oly módon történik, hogy NAD¹t vagy NADP¹t, formiátdehidrogenázt és vizet nátrium-formiátból és kalciumformiátból álló keverékkel inkubálunk, és a képzõdött, redukált NADH¹t vagy NADPH¹t izoláljuk. Az NADH vagy NADPH izolálásakor az oldhatatlan részeket, például kalcium-karbonátot centrifugálással vagy szûréssel elválasztjuk, az alkalmazott formiát-dehidrogenázt ultraszûréssel választjuk el, és az NADH¹t vagy NADPH¹t az ultraszûrletbõl például etanollal kicsapjuk. A kapott kicsapási terméket mossuk, végül szárítjuk. A találmány szerinti készítmény stabil marad a tárolás során, és bomlástermékek, mint például ADP-ribóz, ADP, AMP vagy NAD keletkezése nagymértékben gátolva van. A találmány szerinti készítmény, amely vizet tartalmaz 3 7 tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva, különösen alkalmas az anyagnak tablettákká történõ préselésére. A találmányt a következõ példákkal szemléltetjük: 1. példa NADH szintézise nátrium-formiáttal és kalciumformiáttal A keverék tartalma: g NAD (0,22 mol) 0 ml vízben oldva 17 g (HCOO) 2 Ca (0,132 mol) keverõedénybe g (HCOO)Na (0,3 mol) keverõedénybe 000 U formiát-dehidrogenáz keverõedénybe Végtérfogat 70 ml Szobahõmérsékleten, percen keresztül, ph¹ellenõrzés és NH 3 -mal történõ megfelelõ titrálás mellett végzett keverést követõen a reakcióoldatot feldolgoztuk. A kitermelés NADH¹ra nézve 1 g NADH-dinátrium¹só (az elméleti érték 70%¹a). A kalcium-karbonátot centrifugálással eltávolítottuk, és a formiát-dehidrogenázt ultraszûréssel távolítottuk el. Az ultraszûrést követõen 600 ml ultraszûrletet kaptunk, amelyet 6,9 l etanollal csaptunk ki. A kapott csapadékot csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított termék a következõ termékjellemzõket mutatta: Alkotórész Tartalom Formiát/acetát 1% Etanol 2,% Víz % 1 2 3 4 0 60 Na 2 CO 3 2% Tisztaság 97,% (2,% ADP-ribóz a végtermékbõl) NADH-tartalom körülbelül 89 91% Az ilyen módon elõállított NADH tartalmaz továbbá 1 2% Na 2 CO 3 ¹ot, amely a teljes eljárási folyamat során stabilizálószerként hat. Így egy olyan terméket kapunk, amely mentes NADH bomlástermékeitõl, jól szárítható, és így a minõsége optimális jellemzõket mutat táplálékkiegészítõ szerként történõ alkalmazásra való kiszerelésre és préselésre. 2. példa NADH szintézise nátrium-formiáttal és kalciumformiáttal A keverék tartalma: 0 g NAD (0,074 mol) 0 ml vízben oldva 7 g (HCOO) 2 Ca (0,04 mol) keverõedénybe 7 g (HCOO)Na (0,1 mol) keverõedénybe 0 U formiát-dehidrogenáz keverõedénybe Végtérfogat ml Szobahõmérsékleten, 80 percen keresztül, ph¹ellenõrzés és NaOH-dal történõ megfelelõ titrálás mellett végzett keverést követõen a reakcióoldatot feldolgoztuk. A kitermelés NADH¹ra nézve g NADH-dinátrium¹só (az elméleti érték 70%¹a). A kalcium-karbonátot centrifugálással eltávolítottuk, és a formiát-dehidrogenázt ultraszûréssel távolítottuk el. Az ultraszûrés követõen 0 ml ultraszûrletet kaptunk, amelyet 2,3 l etanollal csaptunk ki. A kapott csapadékot csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított termék a következõ termékjellemzõket mutatta: Alkotórész Tartalom Formiát/acetát 1,% Etanol 2,4% Víz 6% Na 2 CO 3 0,1% Tisztaság 97,% (2,% ADP-ribóz a végtermékbõl) NADH-tartalom körülbelül 89 91%. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) vagy nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP) enzimes redukciójára azzal jellemezve, hogy (a) NAD¹t vagy NADP¹t, formiát-dehidrogenázzal és vízzel (b) és legalább egy alkálifém-formiáttal vagy ammónium-formiáttal inkubáljuk, (c) a képzõdött alkálifém-karbonátot vagy ammóniumkarbonátot alkáliföldfémsóval történõ kicsapással eltávolítjuk az oldatból, mennyiségét ezáltal 0, tömeg%¹ra csökkentve, és 4
1 HU 00 7 T2 2 (d) a keletkezett, redukált nikotinamid-adenin-dinukleotidot (NADH) vagy nikotinamid-adenin-dinukleotidfoszfátot (NADPH) izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (a) NAD¹t vagy NADP¹t, formiát-dehidrogenázt és vizet (b) legalább egy alkálifém-formiátból vagy ammóniumformiátból és legalább egy alkáliföldfém-formiátból álló keverékkel inkubáljuk, és (c) a képzõdött NADH¹t vagy NADPH¹t izoláljuk. 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkálifém-formiátként lítium¹, nátrium¹, kálium¹, rubídium- vagy cézium-formiátot alkalmazunk. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy alkáliföldfém-formiátként berillium¹, magnézium¹, kalcium¹, stroncium- vagy báriumformiátot alkalmazunk.. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy NAD¹t vagy NADP¹t, formiátdehidrogenázt és vizet egy, nátrium-formiátból és kalcium-formiátból álló keverékkel inkubáljuk, és a redukált NADH¹t vagy NADPH¹t izoláljuk. 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az NAD¹t vagy NADP¹t a szintéziselegyben 1 tömeg% koncentrációban alkalmazzuk. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az NAD¹t vagy NADP¹t a szintéziselegyben 2 tömeg% koncentrációban alkalmazzuk. 8. Az 1 7. igénypontok közül egy vagy több szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkálifém-formiátot legalább ekvimoláris mennyiségben, elõnyösen az alkalmazott NAD-hez vagy NADP-hez képest feleslegben alkalmazzuk. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkálifém-formiátot az alkalmazott NAD-hez vagy NADP-hez képest maximum hússzoros moláris feleslegben alkalmazzuk.. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkálifém-formiátot az alkalmazott NAD-hez vagy NADP-hez képest 2 -szeres moláris feleslegben alkalmazzuk. 11. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a képzõdött alkálifém-karbonát eltávolítását kalcium-kloriddal, kalcium-oxaláttal, kalcium-acetáttal, kalcium-maleáttal, magnézium-oxaláttal, magnézium-acetáttal vagy magnézium-maleáttal történõ kicsapással végezzük el. 12. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkáliföldfém-formiát aránya az NAD-hez vagy az NADP-hez képest 0,4 0,9 mol alkáliföldfém-formiát 1 mol NAD-hez vagy NADP-hez képest. 1 2 3 4 0 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkáliföldfém-formiát aránya az NAD-hez vagy az NADP-hez képest 0, 0,7 mol alkáliföldfémformiát 1 mol NAD-hez vagy NADP-hez képest. 14. Az 1 13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott enzimmennyiség 00 1 000 000 U a reakcióelegyben alkalmazott NAD vagy NADP egy kg¹jára vonatkoztatva. 1. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott enzimmennyiség 000 0 000 U a reakcióelegyben alkalmazott NAD vagy NADP egy kg¹jára vonatkoztatva. 16. Az 1 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióoldat ph¹értékét 7 és 9 között állandó értéken tartjuk. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióoldat ph¹értékét 7, és 8, között állandó értéken tartjuk. 18. Az 1 17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hõmérséklet 70 C. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hõmérséklet 3 C.. Az 1 19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióidõ perctõl óráig terjedhet. 21. A. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióidõ 0 perctõl (min) 0 percig terjedhet. 22. A. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióidõ 1 perctõl percig terjedhet. 23. Készítmény, amely tartalmaz (a) NADH¹t vagy NADPH¹t 80 9 tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva, és (b) alkálifém-karbonátot 0, tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva. 24. A 23. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy vizet is tartalmaz 3 7 tömeg% mennyiségben a készítmény nem illó alkotórészeire vonatkoztatva. 2. A 23. és 24. igénypont szerinti készítmény, amely az 1 22. igénypontok bármelyike szerinti eljárással nyerhetõ, amelyben az NADH vagy NADPH izolálása során az oldhatatlan részeket centrifugálással vagy szûréssel elválasztjuk, a formiát-dehidrogenázt ultraszûréssel elválasztjuk, és az NADH¹t vagy NADPH¹t az ultraszûrletbõl kicsapjuk, mossuk és szárítjuk. 26. A 23. és 24. igénypont szerinti készítmény alkalmazása táplálékkiegészítõ szerként fáradtság, Jet lag esetén, vagy táplálékként Alzheimer¹, Parkinsonbetegségekben vagy depresszióban szenvedõ betegeknél.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest