2.1. A mérés alapelvei Legfntsabb prbléma: a gerjesztő fény és az általa kztt lumineszcenciafény elkülönítése Flureszcencia II. Mérési alapelvek, ptikai elemek, alkalmazásk I. Flureszcencia mérésénél: A gerjesztési és észlelési irányk célszerű megválasztása Hárm elrendezés 1. Az észlelés iránya merőleges a gerjesztés irányára 2. Az gerjesztés és az észlelés iránya párhuzams A minta elülső ldaláról kilépő flureszcenciát érzékeljük 3. A minta gerjesztéssel ellenkező irányú, hátsó ldaláról detektálunk!! Fényszűrők, mnkrmátrk!! II. Fszfreszcencia mérésénél A gerjesztő fény a fszfreszcenciafénytől időben elkülönüljön Az intenzitás időbeli váltzása is mérhető legyen Fszfrszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után ptikai ernyővel eltakarjuk Ekkr juthat a detektrhz az emittált fény Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik: a frgási sebességtől a nyílásk számától függ Gyakrlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű Mindig alacsny hőmérsékleten kell mérni 1
A frgó átlátszatlan henger résén a gerjesztő fény áthatl, de a fszfreszcencia a henger falán nem jut át Negyedfrdulat után a gerjesztő fény útja záródik el, a fszfreszcencia a detektrhz jut a henger másik részén 2.2. A minta Általában ldat (fehérje-, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió) A küvetta anyaga ne flureszkáljn Kvarc: a fényt plarizálja-speciális típusk Üvegküvetta (látható tartmány) Speciális üvegküvetta (l > 300 nm) Kvarcküvetta (abszrpció mérésre) Speciális kvarcküvetta (flureszcencia mérésre) Átflyó küvetta Tartóberendezések: Temperálható Több (ált. 4) minta, frgatható Gerjesztő fényfrrásk A mesterséges fényfrrásk által kibcsáttt fény lehet: 2.3. Gerjesztő fényfrrásk, ptikai szűrők, mnkrmátrk Flytns-, (magas hőmérsékletre hevített anyag) Halgéntöltésű izzószálas lámpák Nagy nymású gázkkal töltött lámpák Vnalas-, (atmk) Intenzív, mnkrmatikus fény állítható elő Alacsny nymású higanygőzzel töltött gázkisülési cső Sávs- színképű (mlekulák) 2
Optikai szűrők Szelektivitás biznys hullámhsszúságú fényre Reflexiós filterek Bevnat típusától függ a hullámhsszra való szelektivitás Abszrpciós filterek Általában üvegből készülnek Szerves vagy szervetlen összetevőket tartalmaznak Emiatt biznys hullámhsszúságú fénysugarakat átengednek, míg máskat nem Műanyag (lcsóbb, könnyebb) Dikrikus tükrök Ultraiblya (UV)-filterek: Az ultraiblya-fényt nem engedik át, de hsszabb hullámhsszúakat igen Neutrális szűrők: Transzmissziójuk széles színképtartmányban a hullámhsszúságtól független A gerjesztő fény intenzitásától függő ftkémiai, ftbilógiai flyamatk tanulmányzhatók Trikrikus prizma elvi vázlata F: különböző filter-bevnatk Interferencia-szűrők Akkr használjuk, ha a flytns színképű fényből visznylag keskeny sávt akarunk kiválasztani Vnalas színképű gerjesztő fényből meghatárztt hullámhsszúságnál fellépő vnalat kell elkülönítenünk Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ 3
Lngpass-filterek (Felüláteresztő szűrők) Magasabb hullámhsszú fénysugarakat enged át Általában éles csúcs Flureszcens mikrszkópiában: Dikrikus tükrök Emissziós filterek-ként használatsak Shrtpass filterek (Aluláteresztő szűrők) Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek Rövidebb hullámhsszú fénysugarakat enged át Dikrikus tükrök Excitációs filterek-ként használatsak Bandpass filterek (Sáv szűrők) Előző kettő kmbinációja Általában alacsnyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél A kiválaszttt intervallumn kívül teljesen blkkl minden más hullámhsszú fényt 515 30 BP filter 650 LP filter Argn lézer 4
Plarizációs filterek (Plarizátr) A beeső fény plarizációja alapján szűrnek Mnkrmátrk A: fényfrrás B: Emissziós rés C: Kllimátr D: Prizma vagy rács E: Tükör F: Excitációs rés A detektr Ftelektrnskszrzó cső (Phtmultiplier tube) Nagyn szenzitív érzékelők az ultraiblyától a közeli infravörös tartmányig 3. Mlekuláris bilógiai alkalmazásk 5
Intrinsic (belső) flurfórk armás aminsavak: triptfán, tirzin, fenilalanin Luciferin-luciferáz reakció Szentjánsbgár luciferáz Ca2+ kötés nélkül a ftprtein inaktiv. Ca2+ kötés hatására a ftprtein aktiválja a luciferin xidációját. A luciferáz katalizálja a luciferin xidációját. Inaktiv xyluciferin és fény (h ) keletkezik. A tvábbi luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik. 6
Green flurescent prtein (GFP) Aequrea victria Green flurescent prtein 27 kda Shimmura, Jhnsn, Saiga (1962) Aequrin 22 kda GFP Extrinsic (külső) flurfórk Fehérjék flureszcens jelölése A jelölők tervezhetőek Specifikusan kapcslhatók Aktivitásváltzás?? Direkt jelölés festékekkel IAEDANS IAF FITC Flureszcensen jelölt txinkkal Fallidin B-skrpiótxin A-bungartxin Makrfágk Aktin jelölve fallidin-alexa 568-cal (Pirs) Magk: DAPI (Kék) Streptcccus aureus (Zöld) 7
Jelölés specifikus antitestekkel (immunflureszcens, immunhisztkémiai jelölés) Egér embrinális fibrblaszt sejt, interfázisban Tubulin: pliklnális antitesttel jelölve DNS : kék Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert mlekula felszínéhez (epitóp) Mnklnális- és pliklnális antitestek Direkt jelölés: az antitesthez flureszcens festék van kötve Indirekt jelölés: az elődleges antitest jelöletlen, a másdlags antitest van megjelölve Metafázis Anafázis Telfázis Tubulin: pliklnális antitesttel jelölve (zöld) Gamma-tubulin: TU-30 antitest (pirs) DNS: kék 8