A daganatok korszerû molekuláris patológiai diagnosztikájáról Dr. Szentirmay Zoltán, Dr. Orosz Zsolt Országos Onkológiai Intézet, Budapest CGH: komparatív genomiális hybridizáció DI: DNS index DNS: dezoxyribonukleinsav dntp: nucleotid trifoszfát EGFR: epidermális növekedési faktor receptor FISH: fluoreszcens in situ hybridizáció GIST: gastrointestinalis stromalis tumor HNPCC: herediter nem-polyposis colorectalis carcinoma HPG: human genome project HPV: humán papillomavirus MMR: DNS hibajavító ( mismatch repair ) mrns: messenger ribonukleinsav MSI: mikroszatellita instabilitás MSI-H: kifejezett (high) mikroszatellita instabilitás MSS: mikroszatellita stabilitás PCR: polimeráz láncreakció PDGFRA: thrombocyta növekedési faktor receptor α Az orvostudomány mai fejlettsége alapján azt gondolhatnánk, hogy a molekuláris patológia fogalma mára már jól körülhatárolttá vált. Ez azonban egyáltalán nincs így. Az American Board of Pathology, az American Board of 1 Rövidítések A molekuláris patológia fogalma Medical Genetics és az American Board of Clinical Chemistry három, külön vizsgához és bizonyítványhoz kötött specialitást határozott meg a molekuláris patológia gyûjtõnév alatt (3). A Molecular Genetic Pathology magába foglalja azokat a molekuláris biológiai és molekuláris genetikai alapelveket, elméleteket és technológiákat, amelyek segítségével klinikai diagnózis adható vagy megerõsíthetõ a különféle örökletes, fertõzõ vagy daganatos betegségekrõl, továbbá a fejlõdéstani rendellenességekrõl, ezek fejlõdésmenetérõl. Ide tartozik az is, hogy tudni kell megfelelõ segítséget adni az említett betegségek klinikai ellátásához (1). A Clinical Molecular Genetics a klinikai genetikát, a genetikai tanácsadást, a cytogenetikát, a biokémiaiés molekuláris genetikát, más szóval az orvosi genetika minden ágát lefedi. Természetesen itt is ismerni kell a molekuláris genetika és a releváns betegségek alapelveit, a laboratóriumi eljárások minõségi követelményeit, és az örökletes betegségek kimutatásához szükséges laboratóriumi eljárásokat. A Molecular Diagnostics feladata a molekuláris biológia módszereinek alkalmazása a klinikai laboratóriumi diagnosztikában, beleértve az örökletes és fertõzõ betegségeket, a személyi azonosítást. Látjuk tehát, hogy a fentiek szerint széles értelemben vett molekuláris patológia lényegében három, egymást jelentõsen átfedõ disciplinát foglal magába és ezek közül a szûkebb értelemben vett molekuláris patológia, vagy másképpen a molekuláris genetikai patológia az, ami a klasszikus sebészi patológiából nõtt ki. (A továbbiakban a molekuláris patológia kifejezést ebben a szûkebb értelemben fogjuk használni.) A molekuláris patológia módszerei A sejtenkénti DNS tartalom meghatározása Egy, az idõben exponenciálisan növekvõ sejtpopulációban, amelyben a sejtosztódás véletlenszerûen, egymástól függetlenül következik be, ha minden egyes sejt DNS tartalmát megmérjük (átáramoltatásos cytométerrel vagy digitális képanalizátor segítségével), a gyakorisági hisztogramon két csúcs található. Az elsõ, nagyobb csúcs felel meg a G0,1- fázisú sejteknek, a kisebb csúcs tartalmazza a G2 (és mitózis) fázisban lévõ sejteket. A malignus transzformáció során egyre több olyan sejt alakulhat ki, amelynek DNS tartalma különbözik az ép sejtekétõl. Ez a jelenség abban nyilvánul meg, hogy a DNS hisztogram G0,1 csúcsa eltolódik a diploid, más szóval normál értéktõl (aneuploidia), illetve kettõ, vagy több szubpopuláció jelenik meg egymástól eltérõ kromoszóma számmal és ennek kifejezõdéseként eltérõ G0,1 csúcsokkal (heteroploidia). Ez a jelenség a tumor kromoszómális instabilitására vezethetõ vissza. Ismerünk azonban diploid DNS tartalommal rendelkezõ, vagyis kromoszómálisan stabil daganatokat is. A DNS tartalom mértékét a DNS indexszel (DI) fejezzük ki és ez nem más, mint a megváltozott és ép G0,1-fázisú sejtek modalis vagy átlagos DNS értékének hányadosa. A sejtenkénti DNS tartalom vizsgálata az orvostudomány legkülönbözõbb területein alkalmazható. Saját megfigyeléseink szerint a DNS cytometria segítheti benignus atypiák elkülönítését malignus folyamatoktól, daganatáttétek vagy recidívák elkülönítését második primer tumortól. Lehet független prognosz-
MOTESZ tikai marker vagy más markereket erõsítve lehetõvé teszi, hogy egy sor daganatos betegség kimenetelének lefolyásáról bizonyos valószínûséggel elõzetes információkhoz jussunk (2). Mindezen információk birtokában lehetõségünk nyílik arra, hogy a betegséggel kapcsolatos elõzõ véleményünket szükség esetén objektíven felülvizsgáljuk vagy a megváltozott körülmények hatására módosítsuk, a korábbi ismereteinket kiegészítsük és az ennek megfelelõ legjobb egyedi terápiás beavatkozást megbecsüljük. A molekuláris patológia legújabb fejlõdése azt is megengedi, hogy a DNS tartalom meghatározását egyéb módon, pl. in situ hibridizációval vagy másképpen nyert génelváltozások paramétereivel kombinálva használjuk fel a daganatok biológiai tulajdonságainak még jobb megismerésére. Nukleinsav elektroforézis Gél elektroforézis a leggyakrabban használt eljárás a kétszálú DNS fragmentumok hosszúság szerinti szétválasztására, de vannak eljárások az egyszálú DNS vagy kétszálú DNS szeparálására azok másodlagos szerkezete szerint. Agaróz vagy polyacrylamid az a két géltípus, amelyben a nukleinsavak szétválaszthatók. Agaróz gélben 100-20000 bázis hosszú DNS szálat lehet elkülöníteni. A nukleinsavak a gélben futtatása után fluoreszcens festékekkel közvetlenül láthatóvá tehetõk. Bár a gél elektroforézis eljárás több mint 100 éve ismert, az eredetileg téglalap alakú lapos gél-öntvény helyett újabban vált használatossá a kapilláris gél elektroforézis. Ennek az eljárásnak számos elõnye közül a gyorsaságot, a kis mintamenynyiséget, a nagyobb felbontóképességet, a futtatott anyag mennyiségi meghatározásának és az automatizálásnak a lehetõségét említjük. A legújabb fejlesztések annyira sokoldalú felhasználást biztosítanak, hogy Labor on a chip eljárásról és nanotechnológiáról beszélhetünk. 1. ábra. In situ hibridizáció. A célszekvencia itt mrns, amely jelen esetben a képen látható hurkokat, kétszálú szakaszokat képezi a sejtekben, ezért a hibridizáció elõtt egyszálúvá kell tenni, hogy a próba hozzáférhessen. Ha a preparátumot 95º-ra felmelegítjük, a nukleinsav kettõs spirálok szétcsavarodnak (denaturáció). A próba rövid DNS szál, ami a reakciókeverékben fölös mennyiségben van jelen, bejut a sejtbe és a hibridizációs hõmérsékleten a denaturált komplementer célszekvencia szakaszhoz kapcsolódik. A próbához valamilyen riporter molekula van kötve (jelzés), amelynek segítségével a próba-célszekvencia hibrid a sejtben láthatóvá tehetõ hasonlóan, mint egy immunhisztokémiai reakció. A jelzés rendszerint biotin vagy digoxigenin, amihez streptavidin alklalikus foszfatáz komplexet kötünk, szükség esetén biotinilált anti-digoxigenin közbeiktatása után. Végezetül alkalaikus foszfatáz enzim szubsztátot adunk a szövetmintához. Az enzimreakció során a jelzett próba környezetében oldhatatlan színes csapadék képzõdik, ami a hibridizációs reakciót láthatóvá teszi. In situ hybridizációs eljárások Az in situ eljárások közé a fénymikroszkópos és a fluoreszcens hybridizációt (FISH), valamint a komparatív genomiális hybridizációt (CGH) soroljuk. Az in situ hibridizációt specifikus DNS vagy RNS szekvenciák szövettani metszetekben történõ kimutatására használjuk. Az eljárás azon alapszik, hogy a denaturált egyszálú nukleinsavak megfelelõ körülmények között kettõs spirált képeznek egy velük komplementer másik nukleinsav szakasszal. Ha egy biotin, digoxigenin vagy fluorescens jelzéssel ellátott ismert bázissorrendû DNS vagy RNS darabot (próbát) bejuttatunk a sejtbe, akkor az a neki megfelelõ komplementer nukleinsav szekvenciát felismeri és hozzákötõdik. Ezt követõen a kialakult hibridet a próba jelzésének segítségével láthatóvá tesszük (1. ábra). A DNS és RNS láncok közötti párképzõdés specificitását a legkülönfélébb diagnosztikus feladatokban hasznosíthatjuk. Kimutatható vírus infekció, gén amplifikáció, vagy gén átrendezõdés, sõt alkalmas arra, hogy géneket lokalizáljunk kromoszóma régión belül. Az újabban kifejlesztett eljárással, a CGH segítségével egyszerre valamennyi durva kromoszóma eltérés analizálható a tumorokban. A tumorszövetbõl izolált DNS-t fluoreszcens festékkel jelöljük és ép kromoszóma preparátumokra hibridizáljuk, amelyet elõzõleg eltérõ színû fluoreszcens festékkel jelöltünk. A tumor DNS egyes szakaszainak többlete vagy hiánya eltérõ színben fluoreszkál annak megfelelõen, hogy az ép kromoszóma adott régiójához többlet tumor DNS kötõdött, vagy éppen a régiónak megfelelõ DNS szakasz hiányzik a tumorból. Polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction, PCR) A PCR egy meghatározott DNS vagy RNS szekvencia in vitro enzimatikus szintézisét és amplifikációját jelenti. Egy kópia DNS vagy néhány kópia RNS szakaszról 30-40 reakcióciklus, azaz néhány óra után akár 100 millió kópia DNS szál keletkezik. A kívánt 2
DNS célszekvencia (templát) kiválasztása rövid oligonukleotid DNS fragmentekkel, (primerekkel) történik. A nukleinsav kettõs spirál mindegyik szálához egy-egy primert kötünk. Az elsõ ciklus 1. fázisban a kétszálú templátot magas hõmérsékleten (94 ) denaturáljuk. A 2. fázis során (50-55 -on) a reakció-keverékben fölös mennyiségben lévõ primerek szigorúan a velük komplementer templát szakaszokhoz kötõdnek. A reakcióelegy hõstabil DNS polimeráz enzimet és foszforilált nukleotidokat is tartalmaz. A 3. fázisban rendszerint 70-72 -on a lekötött primerek 3 -végén megindul a DNS szintézis és a két primer által kijelölt célszekvencia megduplázódik. Az ismételt reakció ciklusokban a duplázódás újra meg újra megtörténik, miközben a keletkezett termék mennyisége exponenciálisan nõ és a reakció-sorozat végén 1-2 µg mennyiségben áll rendelkezésre (2A és 2B. ábra: 1. és 2. PCR ciklus). A PCR nagy elõnye, hogy specifikus ugyanakkor egyszerû, automatizálható és a módszer rendkívül sokféleképpen alkalmazható. Felhasználható génmutációk felderítésére és ez által örökletes betegségek vagy daganatok diagnosztikájára. Széles körben használják a vírusok és egyéb fertõzõ kórokozók azonosítására, szervátültetéseknél és a kriminológiában. Szerepe van az evolúciós kutatásokban, mert sikerült DNS mintát nyerni több száz éves csontokból, fogakból, egy 7000 éves egyiptomi múmia agyszövetébõl, sõt egy 120-135 millió éves borostyánba zárt rovarból is. Valós idejû kvantitatív PCR technológia A hagyományos PCR eljárás hátránya, hogy legalább 3 óráig tart, eredményt csak futtatás és festés után kapunk, valamint nem alkalmas a célszekvencia pontos mennyiségi meghatározásra. A PCR termék mennyiségét a valós idejû PCR-rel már a reakció alatt figyelemmel kísérhetjük. Ezt az teszi lehetõvé, hogy a primerek mellett fluoreszcensen jelölt próbákat használunk, amelyek az amplifikálandó szakaszra illeszkednek. A próbák detektálható jelet csak akkor adnak, ha a templát DNS-hez kötõdnek, így ciklusonkénti adatgyûjtéssel pontos információt kapunk a PCR termék mennyiségérõl. A fluoreszcencia mértéke csak 15-25 ciklus után éri el azt a szintet, amelyet a detektor már érzékelni tud. Ez a ciklusszámot nevezzük áttörési pontnak, amely alapján a kiindulási templát mennyiségi (kvantitatív) meghatározását végezhetjük. Minél elõbb éri el a fluoreszcencia az áttörési pontot, annál több volt a kiindulási DNS mennyisége. In situ PCR Elsõsorban a patológusokat nem elégítette ki, hogy a hagyományos PCR technikával nem lehet az amplifikált DNS szakaszokat a sejtekben lokalizálni. Kiderült, hogy a PCR-t szövettani metszetben is el lehet végezni, ami lehetõvé teszi, hogy a DNS vagy RNS fragmentumokat eredeti környezetükben megsokszorozzuk Ezt az eljárást nevezzük in situ PCR-nek és alacsony kópiaszámú gének (pl. vírusok) vagy egyfajta mrns bizonyos sejtekben történõ kimutatására használjuk. DNS szekvenálás Szekvenálás alatt a DNS bázissorrendjének meghatározását értjük. Ha a bázissorrendet meghatározzuk, azt össze tudjuk hasonlítani ismert szekvenciákkal, így diagnosztizálni tudjuk a genetikai eltéréseket. A szekvenálás eljárása, akár csak a PCR, a normál DNS replikációján alapul. Az új nukleotid-trifoszfát (dntp) úgy épül be a láncba, hogy az elõtte álló 5 -OH csoportjához kapcsolódik. Ha olyan nukleotidot építünk be, amelynek nincs 5 -OH csoportja (ddntp), a lánc hosszabbodása megáll. Az eljárás elsõ lépéseként a vizsgálandó DNS (templát) két szálát elválasztjuk egymástól, majd a szekvenálandó szakasz kezdetére illõ rövid egyszálú DNS-darabot (primer) adunk hozzá. A primer hozzákötõdik a megfelelõ DNS szakaszhoz, és a DNS polimeráz a jelen levõ nukleotidokat hozzácsatolva elkezdi folytatni a láncot, a 2A. és 2B. ábra. A polimeráz láncreakció (PCR) mechanizmusa. Az 1. ciklusban a nukleinsav kettõs spirál mindegyik szálához egy-egy megfelelõ bázis sorrendû rövid egyszálú szintetikus DNS fragmentet (primer) kötünk. A reakcióelegy hõstabil DNS polimeráz enzimet (Taq polimeráz) és foszforilált nukleozidokat is tartalmaz. A lekötött primerek 3 -végétõl kiindulva a Taq polimeráz elvégzi a komplementer DNS szálak szintézisét. A ciklus végén a primerek által kiválasztott kétszálú DNS szakasz megduplázódik. A második PCR ciklusban a már megduplázott DNS szálak újra megkétszerezõdnek. A ciklusokat többször megismételve a kiválasztott génszakasz mennyisége exponenciálisan nõ és akár 100 millió kópia DNS szál is keletkezhet. 3
MOTESZ templát bázissorrendjének megfelelõen. Ha a reakcióhoz ddntp-t is adunk, a replikáció annak beépülésekor leáll. Az eljárást többször ismételve különbözõ hosszúságú, ddntp-re végzõdõ DNS darabokat kapunk. A négyféle ddntp (A, C, G, T) egymástól eltérõ festéssel, vagy külön csõbe téve elkülöníthetjük, végül megkapjuk a kiválasztott DNS szakasz bázis sorrendjét. Daganatok génexpressziós profiljának vizsgálata Elsõsorban a daganatok, de más betegségek vizsgálatára a legújabban kifejlesztett ú.n. szöveti chip és DNA microarray technikák kerültek kifejlesztésre (7). A szöveti chip eljárás lényege, hogy egyetlen tárgylemezre számos 0,3 2 mm átmérõjû különbözõ eredetû szövetmetszet kerül elhelyezésre, amelyeket egyszerre lehet immunhisztokémiai módszerekkel vizsgálni. Az eljárás valamilyen géntermék (fehérje) különbözõ ép és kóros szövetekben történõ kifejezõdésének vizsgálatára való és elsõsorban immunhisztokémiai reagensek diagnosztikai értékének meghatározására használjuk. A DNS microarray módszer a különféle elváltozások genetikai eltéréseinek vagy expressios profiljának kimutatására szolgál, rohamosan fejlõdik, számos változata kerül közlésre. Az eredmények kiértékelése komoly molekuláris biológiai tapasztalatok mellett statisztikai eljárások alkalmazását is igényli. A technika különféle változatait ezen a helyen részletesen ismertetni nem lehet. Az eljárás lényege röviden, hogy egy szövettani tárgylemez nagyságú üveglemezre néhány tíztõl akár húszezernyi apró csepp formájában ismert DNS szakaszt vagy szintetikus oligonucleotid szekvenciát egy erre a célra kifejlesztett készülék segítségével megfelelõen pozícionálva felviszünk. A vizsgálni kívánt elváltozásból izolált és fluoreszcens jelzéssel ellátott RNS mintákat ráhibridizáljuk a DNS chipre, amelyek a nekik megfelelõ gének megfelelõ szakaszaihoz kötõdnek és a fluoreszcens jelzés miatt a bekötõdés mintája egy másik készülék segítségével leolvasható. Ilyen módon megállapítható az elváltozás ép vagy kóros génmûködése, ennek jellege, illetve az is, hogy az adott elváltozás várhatóan rezisztens vagy érzékeny-e egy tervezett (pl. cytostaticus) kezelésre. A humán genom és a rák Az élet folyamán az emberi sejt DNS készletét számos mutagén hatás éri. A rákot okozó mutációk a kódoló régióban, illetve mrns összeillesztési (splicing) donor vagy acceptor szekvenciáiban halmozódnak. A génkárosodások különbözõ típusúak lehetnek, nagy vagy kis inzertiók és deléciók, bázis szubsztitúciók, génamplifikációk, génátrendezõdések vagy epigenetikus változások, pl. a gének hiper- vagy hipomitelációja. Mindezen génkárosodások az érintett sejtek DNS készletében mindössze hajszálnyi változást okoznak, mégis kiváltják a sejtosztódás zavarát, ami újabb mutációkhoz vezethet. Az egyik ilyen szomatikus mutáció megváltoztatja egy kritikus génnek a funkcióját növekedési elõnyt biztosítva a sejtnek, amibõl egy új klón alakul ki. További mutációk releváns génekben és az érintett sejtek klonális túlnövekedésének fennmaradása azt eredményezi, hogy a korlátlanul növekvõ sejtek beszûrik a környezõ szöveteket és áttéteket képeznek. A rákkutatás és molekuláris diagnosztika egyik legfontosabb célja olyan géneket találni, amelyek daganatot okoznak, és amelyek mûködését befolyásolva a daganatok meggyógyíthatók. A daganatokban a genom összetétele olyan jelentõsen megváltozik, hogy azt a HGP adataiból levezetni nem lehet. A Cancer Genome Anatomy Project éppen azért jött létre, hogy adatokat gyûjtsön a daganatsejtek genomjának szerkezetérõl. Ezen Project keretében jelenleg 42 tumor szupresszor gént, más szóval recesszív onkogént és több, mint 100 domináns onkogént azonosítottak. A rák-gének strukturális és funkcionális különbözõsége szembetûnõ. Az ismert recesszív onkogének szekvenciái alig hasonlítanak egymáshoz, és fehérjéiknek is eltérõ biológiai funkciójuk van. Ugyanakkor rákkal összefüggõ gének közeli rokonairól (pl. p73 és p63 gének, amelyek a TP53 gén rokonai) nem ismert, hogy károsodnának tumorokban. A daganatos folyamatokra leginkább jellemzõ a sejtciklus szabályozás zavara. Kísérletes adatok bizonyítják, hogy a rák kialakulásához egyre szaporodó molekuláris események vezetnek. Valamennyi protoonkogén és tumor szupresszor gén mutációjának hatása végsõ soron egy közös biokémiai folyamatba torkollik. A gén mutációk mellett a genomban úgynevezett rekurrens kromoszómális strukturális génátrendezõdések is kialakulhatnak, amelyek daganatos betegségekkel függenek össze. Ilyen típusú elváltozások gyakoriak lymphomákban, leukaemiákban, lágyrész tumorokban és közös (kimérikus) transzkriptot eredményeznek, ami a fúziós gének terméke és a résztvevõ génekrõl íródik át a kromoszómális töréspont egyik és másik oldalán. Itt érdekes megjegyezni, hogy a carcinomákat okozó proto-onkogének igen kevés kivételtõl eltekintve mutációval vagy amplifikációval aktiválódnak onkogénekké, ezzel szemben a lágyrész sarcomák transzformáló génjei rendszerint két korábban meglévõ génbõl génátrendezõdéssel újonnan keletkezett fúziós gének. Az onkogenezis génátrendezõdéses mintája a leggyakoribb tumorféleségekben, a hám tumorokban tehát igen ritkán figyelhetõ meg. Azok a gének, amelyeket mint daganat-okozó fúziós géneket megtaláltak, egymástól normális körülmények között igen távol helyezkednek el. A fúziós gén úgy keletkezik, hogy azt felépítõ mindkét gén ismeretlen hatásra eltörik, egy részük elvész, más részük egymással összekapcsolódik. A törések mindig ugyanazon a génszakaszon következnek be és mindig ugyanazon részük kapcsolódik össze a másik gén meghatározott részével. A különféle lágyrész daganatokat elõidézõ fúziós gének annyira jellemzõek az adott tumorra, hogy kimutatásuk patológiai diagnosztikai értékû. Microsatelliták bázis-ismétlõdésekbõl álló, változó hosszúságú kis DNS 4
szakaszok, elszórtan több ezer helyen megtalálhatók a humán genomban. Ezek ismétlõdõ szekvenciákból, pl. 13 adeninbõl, jele (A)13, vagy citozin és adenin ismétlõdésébõl állnak, mint pl. a (CA)20 szekvencia. A microsatelliták hossza veleszületetten állandó és egyéni különbségeket mutat. Mikroszatellita instabilitásról (MSI) akkor beszélünk, amikor hosszuk replikációs hiba következtében megnyúlik vagy megrövidül. MSI akkor jelentkezik, amikor az egyik DNS hibajavító mechanizmus a mismatch repair (MMR) rendszer rosszul mûködik. Elégtelen MMR elõsegíti a daganatok kialakulását, mert ilyenkor gyorsan nõ a mutációk száma és ez számos, a sejt funkcióban nagyon fontos gén mûködésképtelenségét vagy aktivációját okozza. Ez a típusú elváltozás csak a károsodott sejtekben található, ezért alkalmas arra, hogy daganatokban a klonális növekedés indikátora, egyes daganatoknál pedig annak független prognosztikai faktora legyen. Krónikus fertõzõ betegségek és a rák Világszerte a fertõzõ kórokozók felelõsek a rosszindulatú daganatok mintegy 18%-ának kialakulásáért (9). A daganatos betegséggel összefüggõ kórokozók azonosítása eleinte nagyon lassan ment, mert nehéz volt a fertõzést kimutatni. További nehézséget jelentett az is, hogy a fertõzõ ágens akár évekig is rejtve maradhat a szövetekben és a fertõzöttek csak kis hányadában okoz daganatot. Az összefüggések feltárása a molekuláris biológiai módszerek bevezetésével felgyorsult, mert lehetõvé vált nagyon kis menynyiségû kórokozó kimutatása biológiai mintákban. Legalább nyolc különféle vírus család és mindössze egy baktérium valamint négy, Ázsiában, Afrikában és a Közép-Keleten elõforduló parazita hozható direkt vagy közvetett kapcsolatba meghatározott daganat-típusokkal (I. táblázat). A HPV fertõzés az összes emberi daganat 6,1%-át okozza. Ez embert 1. táblázat. Krónikus fertõzésekkel összefüggõ daganatos betegségek. A táblázatban a daganat-okozó parazitákat nem tüntettük fel, mert Magyarországon nem fordulnak elõ. (H. pylori = Helicobacter pylori; HPV = Humán papillomavirus; HBV, HCV = hepatitis B/C vírus; EBV = Epstein-Barr vírus; HTLV-1 = Human T-sejt lymphotrop vírus; HHV-8 = Human herpesvirus 8; HIV = Human immundeficiencia vírus) Fertõzõ ágens Rák lokalizáció/típus H. pylori Gyomor MALT lymphoma HPV Méhnyak, szájüreg, garat, gége, nyelõcsõ, cardia laphámrák HBV, HCV Máj EBV Lymphomák, nasopharingealis rák HTLV-1 T-sejtes Lyphoma/Leukaemia HHV-8 Kaposi sarcoma, primer effusio lymphoma, Castleman betegség HIV Kaposi sarcoma, Non-Hodgkin és Hodgkin lymphoma megbetegítõ HPV féleségek közül számosak csak a bõrön okoznak szemölcsöket, esetleg könnyen gyógyítható bõrrákot, míg legalább 60-féle vírus azokat a testrészeket fertõzi, amelyeket a többrétegû laphámmal fedett nyálkahártya borít, mint a méhnyak, hüvely, szeméremtest, szájüreg, garat, gége, nyelõcsõ, a húgycsõnyílás és végbélnyílás környéke. Ezek között kiemelt jelentõségû a méhnyakrák, amelyet minden esetben HPV fertõzés okoz. Magyarországon a méhnyakrák az emlõrák, a tüdõrák, a vastagbélrák után a nõk negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganata, amely a HPV fertõzést követõ 10-15 év múlva alakul ki fokozatosan súlyosbodó rákmegelõzõ állapotokon (CIN 1-2-3) keresztül. Az említett testrészeket megbetegítõ HPV-típusokat szokás alacsony és magas rizikójú csoportba sorolni azon az alapon, hogy nagyobb vagy kisebb valószínûséggel okoznak rosszindulatú daganatot. A juvenilis laryngealis papillomatosis csecsemõ, gyermek és fiatal felnõtt korban fordulnak elõ és többnyire HPV 6 fertõzés következtében alakulnak ki, eltávolítás után többször is kiújulnak és jelentõs fokban végzetes kimenetelûek. A fertõzést a csecsemõk és gyermekek szülés közben a HPV-vel fertõzött anyától kapják meg. A szájüregi-, garat és gége-, valamint a nyelõcsõ rákok egyharmadában a HPV jelenléte szintén kimutatható. Újabb adatok szerint HPV jelenlétét egyes emlõrák-féleségekben is megtalálták. Genetikai prognózisbecslés A sejtenkénti DNS tartalom meghatározás prognosztikai értéke Az 1990-es évektõl napjainkig számos kitûnõ tanulmány után elfogadottá vált, hogy a ploidia, az S-fázis arány és a hisztogram komplexitása hordoz prognosztikai információt. A gyermekkori és felnõtt solid tumorok, lymphomák és leukaemiák várható kórlefolyás becslése vált az eljárás egyik fõ alkalmazási területévé. Génamplifikáció meghatározásának prognosztikai és terápiás jelentõsége Néhány olyan génelváltozás található rosszindulatú daganatokban, amelyek nem kötõdnek szorosan valamely daganat-típushoz, ezért kimutatásuk inkább prognosztikai, mint diagnosztikai jelentõségû. Valamelyik onkogén amplifikációja egy adott tumorban az ugyanolyan szövettani szerkezetû de génamplifikációt nem tartalmazó másik tumorhoz képest általában kedvezõtlenebb kórlefolyásra utal. Az ilyen típusú patológiai vizsgálatokra jó példa az MYCN oncogén megsokszorozódás (amplifikáció) mértékének meghatározása 5
MOTESZ 3. ábra. A MYCN gén különbözõ mértékû amplifikációja neuroblastomákban. A zöld szignál a 2. kromoszómát, a piros szignál a MYCN gént jelzi. A gén amplifikáció mértéke a különbözõ daganatokban nagyon változó, 2 kópiától (nem amplifikált) a több száz kópiáig terjed (ilyenkor az egyes gén kópia szignálok már nem elkülöníthetõek, hanem nagy összefolyó vörös aggregátumok formájában láthatók). neuroblastomában és a c-erb-b2 más néven HER-2/neu onkogén amplifikáció vizsgálata emlõrákban. Ezek a vizsgálatok a megfelelõ daganatellenes kezelés kiválasztásához ma már elengedhetetlenek. A neuroblastoma differenciálatlan neuroectodermális sejtekbõl felépülõ malignus tumor, amelynek sejtjei szövettanilag nem különböztethetõk meg az embryonális neuroblastoktól. Gyermekkorban a leggyakrabban elõforduló szolid tumor (80-95%-ban 5 évesnél fiatalabb életkorban jelentkezik) és a daganatos halálesetek mintegy 15%-áért felelõs. Az adott tumorra legmegfelelõbb daganatellenes terápia megválasztása az MYCN amplifikáció mértékétõl függ. Az MYCN kópiaszám meghatározása valósidejû kvantitatív PCR eljárással vagy FISH technikával lehetséges (3. ábra). Az MYCN amplifikációt mutató eredetileg rossz prognózisú neuroblastomás betegek kórlefolyását mi is valamivel kedvezõtlenebbnek találtuk, mint az olyan betegek túlélését, akiknek a daganatában az MYCN nem volt amplifikált. A különbség azonban nem volt szignifikáns (4). Mindez azzal magyarázható, hogy Magyarországon a neuroblastoma választandó kezelése jelenleg már molekuláris patológiai diagnózison és a várható kórlefolyás elõrejelzésén alapul. A kezelõorvos a tumor ellenes kezelés megválasztásakor az MYCN kópiaszám adatot mindig figyelembe veszi és ezért a biológiailag eleve agresszívebb tumorokat is hatásos terápiában részesítheti. Az emlõrák világszerte a nõk leggyakoribb daganata és sok helyen, így Európában is ez az egyik legfontosabb daganatos halálok. Korábban a betegség mortalitási rátája keveset változott, legújabban azonban csökken, ami a kórkép prognózisának sokkal jobb megítélésére és ennek következtében egyénre szabott és hatásosabb terápiás modalitás kialakítására vezethetõ vissza. A legjobban jellemzett prognosztikai faktor a HER-2/neu onkogén amplifikáció. A HER-2/neu kórosan fokozott mûködése (aktivációja) csaknem mindig génamplifikáció következtében alakul ki. A HER-2/ neu egyfajta transzmembrán fehérjét kódol, ez egy sejtfelszíni receptor, amelynek citoplazmán belüli része tirozin kináz aktivitással rendelkezik. A gén fokozott expressziója, vagyis a fehérje tömeges megjelenése a sejtfelszínen állandó aktivitásban tartja a sejtnövekedést fokozó tirozin foszforilációs szignált. A kóros HER-2/neu szignál blokkolására neutralizáló antitesteket fejlesztettek ki, amelyek közül rákellenes gyógyszerként jelenleg a Herceptin került bevezetésre. A Herceptin terápia indikációjához hozzátartozik a HER-2/neu amplifikáció igazolása. Az Országos Onkológiai Intézet Daganatpatológiai Osztályán Udvarhelyi és munkatársai 2002-ben bevezették és ezt követõen részletesen vizsgálták a HER-2/neu amplifikációs tesztek alkalmazhatóságát (10). Az értékeléshez saját intézeti és más intézetekbõl konzíliumba kapott elsõdleges emlõrákok paraffinba ágyazott szövettani metszeteit dolgozták fel. Az azóta eltelt idõszakban 1163 immunhisztokémiai és 1044 FISH vizsgálatot végeztek. Azt találták, hogy a különbözõ ellenanyagokkal végzett immunhisztokémiai reakciók pozitivitás értékei a HercepTesthez viszonyítva 32-38%-os eltérést mutattak és nem volt tökéletes egyezés az immunhisztokémiai adatok és FISH eredmények között sem. Ennek következtében korábban csak immunhisztokémiával vizsgált emlõrákos betegek közül legalább húszan szükségtelen Herceptin kezelésben részesültek és legalább négyen a fals negatív reakciók miatt nem kapták meg az esetükben választandó Herceptin kezelést. Mikroszatellita instabilitás (MSI) és vastagbélrák Az összes vastagbélrákot a mikroszatellita státus alapján két fõ csoportra lehet osztani. A daganatok nagyobb csoportjában a heterozigozitás elvesztése (LOH), a kromoszómális instabilitás és a mikroszatellita stabilitás (MSS) mutatható ki, a másik kisebb csoportra pedig a magas fokú mikroszatellita instabilitás (MSI-H) jellemzõ. A két tumor csoport egymástól lényegesen különbözik. A kromoszómális instabilitást mutató daganatokban a TP53 gén rendszerint mutáns és durva kromoszómális rendellenességek is kialakulnak, amelyek aneuploidiában nyilvánulnak 6
meg, de nincs MSI. A mikroszatellita instabil tumorokra viszont valamelyik MRR génben a leolvasási keret mutációja vagy az MLH1 gén promoter metiláció okozta génmûködés gátlása lesz a jellemzõ, ami nem jár kromoszómális instabilitással. Az MSI-H rákok egy része sporadikus és az összes daganat mintegy 15%- át teszi ki, további kb. 5% a herediter nem-polyposis colorectalis carcinoma (HNPCC) szindrómával kapcsolatos. Ellentétes biológiai viselkedés tapasztalható az említett két fõ tumortípusnál. A kromoszómálisan instabil daganatok kórlefolyása rendszerint kedvezõtlen, az 5 éves túlélési arány 35%, ugyanakkor adjuváns fluorouracil kezelésre jól reagálnak. Ezzel szemben az MSI-H carcinomák kórlefolyása nagyon kedvezõ. A Dukes C-stádiumú MSI-H rákok adjuváns kemoterápia után, sõt azt elhagyva is 90%-os 5 éves túlélést mutatnak, de nem jól reagálnak fluorouracil terápiára, sõt az ilyen kezelés a betegség kimenetelét rontja (8). A klinikai gyakorlat számára tehát meg kell különböztetni ezt a kétféle vastagbélrákot. Az MSI státus PCR-rel történõ rutinszerû meghatározása fixálatlan, vagy paraffinba ágyazott tumorszövetbõl két szempontból is nagyon fontos. Elõször, mert nagymértékben segíti a kezelõ orvost a várható kórlefolyás és a legmegfelelõbb kezelés kiválasztásában; másodszor, mert nagyon jó módszer a HNCCP vagy a csaknem ugyanolyan jó prognózisú MSI-H rákok kiszûrésére. 7 A daganatellenes célzott kemoterápia alkalmazásának molekuláris diagnosztikai alapja Jelenleg a MYCN mellett három további olyan gént ismerünk, amelyek funkció-nyerõ mutációjának kimutatása fokozott terápiás jelentõséggel bír. Az egyik a c-kit gén, amely a gastrointestinalis stromális tumorok (GIST) 85%-ában mutáns. A GIST a leggyakoribb mesenchymalis tumor a gastrointestinalis traktusban és az interstitialis Cajal sejtekbõl ered, gyakran metasztatizál, de szövettani vizsgálattal azt nehéz eldönteni, hogy melyik tumor fog áttétet adni és melyik nem. A c- kit receptor tirozin kináz gén, amelyik normális körülmények között akkor aktiválódik, ha az általa kódolt fehérjéhez ú.n. õssejt faktor fehérje hozzákötõdik. GIST tumorban a c-kit gén 9, 11, 13 vagy 17. exonjában jöhet létre funkció-nyerõ mutáció, amelyek a kódolt fehérje extracellularis, juxtamembrán, tirozin kináz I vagy tirozin kináz II domainját érintik. A GIST tumorok egy kisebb hányadában a c-kit-tel rokon thrombocyta növekedési faktor receptor á tirozin kináz gén (PDGFRA) 12, 14, vagy 18. exonjában van mutáció. Ezen mutációk kimutatása alapvetõen fontos a választandó terápia meghatározásában. A c-kit és PDGFRA receptor tirozin kináz gátló imatinib mesylattal (Gleevec) az áttétet adó GIST-ek nagyon hatékonyan kezelhetõk. A hatékonyság azonban nagyban függ attól, hogy melyik funkcionális domain mutáns. A klinikai vizsgálatok igazolták, hogy a leghatékonyabb terápiás válasz és a leghoszszabb túlélés a c-kit gén exon 11 mutáció esetén várható, a többi mutációnál nagyobb dózisú imatinib kezelés szükséges a kevésbé jelentõs terápiás hatás eléréséhez. Az elmondottakhoz hasonlóan a különbözõ PDGFRA mutációkat tartalmazó tumorok is eltérõen reagálnak imatinib kezelésre. A 18. exon 842. bázisának mutációja (leggyakrabban elõforduló PDGFRA mutáció, D842V) eredendõen imatinib rezisztenciát jelent (6). A másik tirozin kináz gén az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) szintén aktivált lehet mutációk következtében. A tirozin kináz domain 19. vagy 21. exonjának mutációja gyakran fordul elõ nemdohányzók és nagyobb arányban nõk tüdõ adenocarcinomájában és kifejezetten érzékennyé teszi a tumort a tirozin kináz gátló gefitinib (Iressa) vagy elotinib (Tarceva) kezelésre (5). A 20. exon mutációja e kezelésekkel szembeni rezisztenciát okoz. Következésképpen az említett mutációk kimutatása a GIST vagy nem kissejtes tüdõrák rutin patológiai diagnosztikájának része kell, hogy legyen ahhoz, hogy a beteg megfelelõ terápiában részesülhessen. Irodalom 1. Byers P. H.: Molecular genetic pathology. Coming of age in the molecular world. J. Molec. Diagn., 1999, 1, 3-4. 2. El-Naggar A. K. and Vielh P.: Solid tumor DNA content analysis. Methods Mol. Biol., 2004, 263, 355-370. 3. Killeen A. A., Leung W.-C., Payne D. és mtsai: Certification in molecular pathology in the United States (Training and Education Committee, the Association for Molecular Pathology). J. Mol. Diag., 2002, 4, 181-184. 4. Melegh Zs., Csernák E., Tóth E. és mtsai., DNA content heterogeneity by image cytometry in neuroblastoma and its potential significance. Virchows Arch. 2005, 446, 517-524. 5. Paez J.G., Janne P. A., Lee J. C. és mtsai., EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science, 2004, 304, 1497-1500. 6. Pfeifer J. D., Molecular genetic testing in surgical pathology. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa, USA, 2006, 312-313. 7. Rampall J. B. (ed.) DNA arrays. Methods and protocols. Human Press Inc. Totowa, New Jersey, 2001 8. Ribic C. M., Sargent D. J., Moore M. J. és mtsai., Tumor microsatelliteinstability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N. Engl. J. Med., 2003, 349, 247-257. 9. Stewart B. W. és Kleihues P. (eds.) World cancer report. World Health Organization, International Agency for Research on Cancer. IARCPress, Lyon 2003, 56-61. 10. Udvarhelyi N. és Orosz Zs.: HER2 status of breast cancer. One year experience in Hungary. 2.nd Congress of the World Society of Breast Health. Budapest, Hungary. 2003 Jun 24-28. Levelezési cím: Dr. Szentirmay Zoltán osztályvezetõ fõorvos Országos Onkológiai Intézet 1122 Budapest, Ráth György u. 7-9. Tel: 224-8783 E-mail: szentirmay@oncol.hu