Epigenetikai mintázatok biomarkerként történő felhasználási lehetőségei a toxikológiában

Epigenetikai mintázatok biomarkerként történő felhasználási lehetőségei a toxikológiában Czimmerer Zsolt, Csenki-Bakos Zsolt, Urbányi Béla TOX 2017 Tudományos Konferencia 2017.10.12. Bükfürdő

A sejtek sokféleségének alapja a génkifejeződés eltérő szabályozása zsírsejt neuron https://www.123rf.com Transzkripció Transzláció https://www.turbosquid.com DNS RNS protein

Az epigenetikai szabályozási mechanizmusok típusai kromoszóma Poszttranszlációs hiszton módosítás nukleoszóma mikrorns mirns mrns protein mrns DNS metiláció https://hu.pinterest.com

Nukleoszóma A kromatin szerveződésének alapja a nukleoszóma linker DNS core DNS 55Å Hiszton oktamer: 2 H2A, 2 H2B, 2H3, 2H4 linker DNS H1: összekötő funkció a nukleoszómák között 110Å

A kromatin szerkezete DNS dupla hélix kromatin gyöngysorszerű formája 30 nm szolenoid forma a kromoszóma kinyújtott szakasza eukromatin heterokromatin interfázis a metafázisos kromatin összetömörödött darabja metafázisos kromoszóma sejtosztódás metafázis

Hiszton fehérjék poszttranszlációs módosításai Acetiláció Metiláció Ubikvitináció Sumoiláció Foszforiláció

DNS metiláció A GC dinukleotidok (CpG szigetek) citozinjának metilációja. citozin 5 metil-citozin DNMT: DNS metiltranszferáz

DNS metiláció hatása az aktív transzkripcióra Aktív transzkripció lehetséges: promóter DNS metiláció által gátolt transzkripció: metilált CpG sziget metilálatlan CpG sziget

A mikrorns molekulákról általában mikrorns előalak érett mikrorns mrns molekulák lebontásának kiváltása fehérje szintézis gátlása Miska Current Opinion in Genetics & Development 2005 15: 563-568

A mikrorns-ek bioszintézise, érése és funkciója Yong Zhao és munkatársai: TRENDS in Biocemical Sciences, 2007 4:189-197

A mikrorns-mrns kölcsönhatás molekuláris alapjai Yong és munkatársai: TRENDS in Biocemical Sciences, 2007 4:189-197 www.microrna.org

Az epigenetikai szabályozás toxikológiai vonatkozásai Környezeti expozíció Oxidatív stressz Metil-csoport elérhetőség Klonális szelekció DNS metiláció Hiszton kód mikrorns Gyulladás Metiltranszferáz aktivitás Endokrin zavarok Kromatin szerkezeti átrendeződés, génkifejeződés Betegség kockázat

Az epigenetikai szabályozás toxikológiai vonatkozásai Környezeti expozíció Oxidatív stressz Metil-csoport elérhetőség Klonális szelekció DNS metiláció Hiszton kód mikrorns Kromatin szerkezeti átrendeződés, génkifejeződés Gyulladás Metiltranszferáz aktivitás Endokrin zavarok Biszfenol A viselkedési rendellenességek Formaldehid Alzheimer kór Cigaretta füst COPD, tüdő tumorok Arzén bőr károsodás, tumorok Betegség kockázat

Az epigenetikai szabályozás toxikológiai vonatkozásai Környezeti expozíció Oxidatív stressz Metil-csoport elérhetőség DNS metiláció Hiszton kód Gyulladás Metiltranszferáz aktivitás Arzén H3K9Ac, H3K16Ac, H3K27m3, H3K4m2 Klonális szelekció mikrorns Endokrin zavarok Kromatin szerkezeti átrendeződés, génkifejeződés Betegség kockázat

Az epigenetikai szabályozás toxikológiai vonatkozásai Környezeti expozíció Oxidatív stressz Metil-csoport elérhetőség Klonális szelekció DNS metiláció Hiszton kód mikrorns Gyulladás Metiltranszferáz aktivitás Endokrin zavarok Kromatin szerkezeti átrendeződés, génkifejeződés Betegség kockázat

Toxin-indukált mikrorns kifejeződés/funkció megváltozásának potenciális mechanizmusai Marrone és munkatársai: Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 10:10 1. Benzopirén: mir-34c (bronchiális epithél sejtek); korreláció a p53 mutációk megjelenésével 2. Formaldehid: módosult mir-26b, mir- 29a, mir-142-3p, mir-145, mir-152 and mir-203 kifejeződése (nazális epithélium); kapcsolat a nazális epitheliális karcinómával 3. Arzén: mir-134, mir-138, mir-155, mir-181d, mir-205, mir-373, and let-7 ; KRAS és RAS proto-onkogének 4. Aflatoxin B1: mir-33a (máj); ABCB11 és ATP8B1 (cholestatikus májkárosodás)

MikroRNS-ek biomarkerként történő alkalmazása lehetőségei a klinikumban/toxikológiában terápiás célpont azonosítás személyreszabott terápia diagnózis prognózis klinikai döntések klinikai biomarker mikrorns biogenezis mikrorns kvantitálás mikrorns kibocsátás mikrorns izolálás mikrovezikulák fehérje komplexek HDL lipoproteinek apoptotikus testek passzív kibocsájtás a testfolyadékokba szérumból, plazmából, vizeletből, nyálból, tejből történő kis RNS izolálás microarray Sundarbose és munkatársai: Diagnostics 2013, 3, 84-104

A mikrorns kifejeződés vizsgálati lehetőségei kis RNS szekvenálás segítségével RNS izolálás kis RNS-könyvtár készítés új-generációs szekvenálás http://www.genetica.hu Szekvencia illesztés és bioinformatikai analízis

A mikrorns kifejeződés vizsgálati lehetőségei stem-loop RT-qPCR alkalmazásával https://molecular.roche.com

Új kockázatkezelési modellrendszer fejlesztése a víz- és élelmiszerbiztonság növelése érdekében haltermékvonalon (NVKP16_08B40124) Konzorcium vezetője: Wessling Hungary Kft. Konzorciumi tagok: Szent István Egyetem SKC Consulting Kft. The Fishmarket Halkereskedelmi Kft.

MikroRNS-ek, mint potenciális élelmiszerbiztonsági markerek az édesvízi haltenyésztésben? Problémafelvetés: Felszíni vizek szennyezése Mikroszennyezők akkumulációja a halakban Potenciális humán egészségkárosító hatás

Ponty, mint modellszervezet Nagy gazdasági jelentőség. Elfogadott toxikológiai modellszervezet. Teljes genom szekvenciája ismert. (Fotó: Béres Tibor)

Az élelmiszerbiztonsági markerek azonosításának folyamata (1. év) 1. Mikroszennyezők jelenlétének meghatározása tógazdasági körülmények közt analitikai módszerekkel (víz, üledék, halhús). 2. "Biobank" létrehozása a vizsgált tógazdaságokból származó pontyokból (hús, máj és vér minták vétele; RNS izolálás és tárolás). 1. év 2. év 3. év A kiválasztott 15-25 mikroszennyező alap toxikológiai karakterizálása ponty modellszervezeten laboratóriumi körülmények között (letális dózis meghatározása, toxin akkumuláció vizsgálata).

Az élelmiszerbiztonsági markerek azonosításának folyamata (2. év) 1. év 2. év 3. év 1. Izom és máj minták gyűjtése 10-14 napos (laboratóriumi körülmények közt) xenobiotikum expozíción átesett pontyokból. 2. RNS izolálás. 3. A mikrosszennyező specifikus mikrorns profil meghatározása ponty izom és máj mintákban új-generációs szekvenálás alkalmazásával. 4. Bioinformatikai analízis.

Az élelmiszerbiztonsági markerek azonosításának folyamata (3. év) 1. A mikroszennező specifikus mikrorns-ek további vizsgálata laboratóriumi körülmények között ponty izomban, májban és teljes vérben stem-loop RT-qPCR alkalmazásával (validálás, koncentráció és idő függés vizsgálata). 2. A mikrorns expressziós eredmények alapján egy mikroszennyező specifikus mikrorns panel kiválasztása matematikai modellek alkalmazásával, melyek a potenciális élelmiszer biztonsági markerként szolgálhatnak. 1. év 2. év 3. év Az létrehozott mikrorns panel tesztelése tógazdasági körülmények közül származó ponty hús, máj és vér mintákon (az első évben letrehozott biobank RNS mintáit felhasználva).

Összefoglalás Az epigenetikai szabályozási mechanizmusok egyaránt kulcsszerepet játszanak a normál fiziológiás és patológiás folyamatok szabályozásában. A különböző környezeti mikroszennyezők és xenobiotikumok jelentős mértékben módosíthatják a sejtek epigenetikai mintázatát. Egyes epigenetikai mintázatok (pl. mikrorns profil) biomarkerként szolgálhatnak a klinikumban és a toxikológiában. A 2017-2019 időszakban a SZIE Halgazdálkodási Tanszék egyik kiemelt célja potenciális élelmiszerbiztonsági markerként alkalmazható mikrorns kifejeződési mintázatok azonosítása ponty húsban, májban és vérben.

Köszönöm a figyelmet!