Celluláris és molekuláris neurobiológia SzJDI őszi félév. Neuron-specifikus génműködés. Szabó Gábor MTA KOKI

Átírás

1 Celluláris és molekuláris neurobiológia SzJDI őszi félév Neuron-specifikus génműködés Szabó Gábor MTA KOKI

2 Génexpressziós szintek Génhez való hozzáférés kromatin DNS metiláció kromatin modifikáció epigentika Átírás cisz és transzelemek akivitás függő elemek RNS érés (processing) alternatív splicing mrns szabályozás mikrorns-ek editálás Transzláció lokális aktivitás függő epigentika

3 Génexpresszió kapcsolt lépései

4 Transzkripciós egység-génszerkezet 5 3 szabályozó régió kódoló régió

5 mrns képződés Transzkripció+ processing + transzport

6 Transzkripció szabályozásának elemei cisz elemek - DNS szabályozó elemek gének részei- promoterek, transzkripciós faktor kötőhelyek, enhancerek (silencerek) (elhelyezkedésük 5 -vég, 3 -vég, intronok, kódoló régió) - mrns leader szekvenciák transz elemek - az adott géntől független faktorok - fehérjék (más gének termékei) (lehetnek RNS-ek is microrns) - transzkripciós faktorok (aktivátorok, represszorok) cisz elemekhez kötődnek - kofatorok (ko-aktivátorok, ko-represszorok) transzkripciós faktorokhoz kötődnek

7 enhancers upstream promoter elements core promoter Promoter felépítése core promoter ( -40 to +40 a TSS-hez viszonyítva) promoter proximális régió - upstream regulációs elemeket tartalmaz promoter Promoter típusok house keeping - minden/legtöbb sejtben működnek (TATA nélküli CpG sziget) szövetspecifikus- TATA/CAAT szövetspecifikus elemek indukálható/fejlődés szabályozott Gének átírása polimeráz II- RNS szintetizáló enzim mrns-kódoló gének mikrorns-kódoló gének

8 Promoter elemek (RNS polimeráz II) BRE - TFIIB kötő elem DPE - downstream promoter elem Inr - iniciátor régió

9 Általános upstream promoter elemek Az iniciáció frekvenciáját növelik: elősegítik azt, hogy a bazális transzkripciós faktorok iniciációs komplex-szé szerveződjenek. upstream promoter elemek

10 Transzkripciós faktorok -transz ható elemek - regulációs fehérjék aktivátorok, vagy inhibitorok Funkcionális doménjeik - DNS kötő domén - promoter, vagy enhancer DNS elemekhez kötődik - Aktivációs domén - transzkripciós faktorokkal, ko-aktivátorokkal, ko-represszorokkal, vagy közvetlenül az RNS polimeráz II komplex-szel lép kapcsolatban - Dimerizációs domén: dimér formájában működnek Egyéb faktorokkal transzkripciós komplexet képeznek és serkentik, vagy gátolják az RNS polimeráz II kötődését a promoterhez.

11 Transzkripciós faktorok osztályozása 1. Általános transzkripciós faktorok TFIID, TFIIB, TFIIA, TFIIH, TFIIE, TFIIF Közvetlenül az RNS polimeráz II működéséhez kell. Minden sejtben megtalálható. 2. Minden sejtben jelenlévő konstitutív transzkripciós faktorok sok gén transzkripcióját aktiválja (SP1, CCAAT-box kötő fehérje ) 3. Szövetspecifikus transzkripciós faktorok Specifikus trasz-elemhez kötődik Adott sejttípusban fejeződik ki Szövetspecifikus géneket aktivál 4. Szignál függő/aktiválható transzkripciós faktorok

12

13 Transzkripciós faktorok kötődése a cisz DNS elemekhez

14 A humán genomban található transzkripciós faktor gének Venter et al al al (2001) Science 291, 1304-

15 Cisz regulációs elemek: enhancerek/silencerek enhancers upstream promoter elements core promoter Cis regulációs elemek: aktivátorok (enhancerek), gátlók ( silencerek ) Promoterektől a következőkben térnek el: 1. Enhancerek működéséhez szükségesek a promoterek (promoterek enhancerek nélkül is működnek, bár gyengén) 2. Az enhancerek a transzkripciós starthelytől távol is működnek, a promoterek nem 3. fordított orientációban is működnek 4. a transzkripciós kezdőhely mögött is működnek 5. enhancerek nagyon távoli helyekről is működnek A transzkripciót térben és időben szabályozottan fokozzák, vagy gátolják. Működésükhöz szükséges a transzkripciós alap-apparátus. A transzkripció iniciációját serkentik, vagy gátolják.

16 Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék a transzkripciós komplexhez kötődnek és növelik a transzkripció hatásfokát Lehetnek: szövet/sejttípus specifikusak fejlődés specifikusak aktiválhatók

17 Komplex enhancerek general transcription factors

18 Represszorok Represszorok a silencerekhez kötődnek gátolják az aktivátorok kötődését közvetlenül gátolják az aktivátort közvetlenül kötődnek az általános transzkripciós faktorokhoz

19 A transzkripció szabályozásában résztvevő transz-elemek

20 Tipikus emlős génregulációs régió Az emlős géneket a promotereken kívül több enhancer és silencer szabályozza. Egy tipikus enhancer 500 bp hosszú 10 kötőhelyet tartalmaz, amelyhez legalább háromféle transzkripciós faktor, valamint 2 különböző aktivátor és egy represszor kötődik.

21 Szövetspecfikus transzkripciós szabályozás: szövetspecifikus enhancerek-transzkipicós faktorok

22 Ligand-függő transzkripciós szabályozás

23 Nukleáris hormon receptorok: ligand függő transzkripciós faktorok szteroid hormonok tiroid hormonok retinidok D vitamin

24 Nukleáris hormon receptorok szerkezete

25 Nukleáris hormonreceptorok működési mechanizmusa 1: NR ligand nélkül inaktív komplexet képez a citoplzmában (hsp90) 2: Ligand kötés-nukleáris transzlokáció : DNS elemhez kapcsolódik koaktivátorokkal és más fehérjékkel 4: Gén transzkripció beindul 5: Más transzkripciós faktorokhoz is kapcsolódhat (NFkB, AP-1) Indirekt transzkripciós szabályozás

26 Aktivitás függő transzkripciós szabályozás az idegrendszerben

27 Szignál specifikus transzkripciós komplexek az idegsejtekben kinases Különböző stimulusok hatására CaMP és Ca ++ reszponzív elemekhez kapcsolódnak a foszforiláció után a faktorok. Beindítják a c-fos és Bdnf transzkripciót.

28 CREB függő gén expressziós kaszkád aktivitása szükséges a neuronális plaszticitáshoz és a memóriához szignálok neurotranszmittertek növekedési faktorok depolarizáció stress kinázok CREB foszforiláció C/EBP TF gén aktiváció késői gének aktivációja C/EBP=CAAT enhancer binding protein plaszticitás memória

29 Az aktivitás függő Bdnf transzkripció szerepe a GABAerg szinapszisok szabályozásában Bdhf gén IV. exon

30 RNS összeszerelődés (processing) 2 processing 1 transcription cap splicing polia

31 Alternatív splicing típusok

32 Mire jó az alternatív splicing? A gének exonjaiból a kódoló régiók több féle módon szerelődhetnek össze A genom kódoló kapacitását növeli Fehérjék funkcionális komplexitását növeli eltérő N-, vagy C-eltérő domén szerkezet funkcionális eltérés változik a szubcelluláris lokalizáció poszt-transzlációs modifikáció fehérje-fehérje kölcsönhatás ligand kötés mrns-ek nem-kódoló régióinak diverzitása RNS szintű szabályozás RNS szint, targetálás, stabilitás transzláció szabályozása (microrns kötődés) Lehet fejlődés és szövetspecifikus és aktivitás függő is

33 Splicing mechanizmus

34 Alternatív splicing mechanizmussal egy génről többféle mrns és fehérje képződik -tropomyosin gén

35 Splicing világbajnok a Drosophila Dscam1 (Down Syndrom cell adhesion molecule) gén 2 Alt. (38, 016) A DScam1 izoformák a dendrit arborizációt a dendrit típusok között átfedést szabályozzák.

36 Alternatív splicing az idegrendszerben Alternatív splicing eredményeképpen képződő receptor, ioncsatorna, enzim, jelátviteli fehérje strukturális fehérje (sejtváz, sejtadhézió) formáknak eltérőek lehetnek: funkcionális tulajdonságai lokalizációja, membrán kötődése interakciói Vannak idegsejt specifikus splicing faktorok. Az alternatív splicing-et a neuronális aktivitás is szabályozhatja.

37 A glutamáterg és GABAerg szinapszis képződést (gátló vagy serkentő szinaptikus specializáció) a preszinaptikus neurexin és a posztszinaptikus Neuroligin alternatív spilce -formái határozzák meg 3 neurxin génről összesen több mint 1000 izoforma képződhet (5 altenetív exon és 2 promoter) 4/5 neuroligin gén 2-2 splice formája 8-10 izoformát kódol. A kettő nagyszámú kombinációja sokféle gátló és serkentő szinaptikus kapcsolat kialakítását szabályozhatja.

38 AChE alternatív splicing: különböző szerkezetű és lokalizációjú enzimet eredményez intron retenció alternatív 3 exon alternatív 3 exon hidrifil monomér membrán-kötött dimér VVS membrán kapcsolt tetramer szinaptikus membrán kötött

39 AMPA receptor alternatív splicing: flip/flop variáns Q/R editing a Ca ++ permeábilitást szabályozza Flip/Flop AS és az R/G editing a deszenzitzácót szabályozza

40 Idegrendszerben működő splicing faktorok

41 A hippocampus CA1 régiójában az NMD receptor aktiváció által kiváltott LTP-hez szükséges a NOVA2 splicing faktor NOVA2 KO egér: sipsc, LTP NOVA2 alternatív splicing NMDAR GABABR2 GIRK2 sipsc (lassú gátló posztszinaptikus áram) LTP

42 Szinaptikus mrns-ek, amelyek alternatív splicing-jét a NOVA szabályozza

43 Génműködés epigenetikus szabályozása Olyan változások, amelyek a genom változtatása nélkül hatással vannak a fenotípusra. Egy sejt tulajdonságainak örökletes megváltozása, amely nem jár együtt a genetikai információ megváltozásával. Génműködés epigenetikus szabályozása: nem függ közvetlenül az adott gén regulációs DNS elemeitől: kromatin (hiszton) módosítás DNS metiláció RNS interferencia RNS editálás

44 Epigenetikus hatások: kapcsolat a környezet és a genom között Környezeti hatások eltérő egyedi következményei: egyedi epigenetikus variabilitás környezet (toxinok, gyógyszerek, táplálkozás, sport, szociális hatások) epigenetikus változás személyek közötti epigenetikus variabilitás génexpressziós programozás FENOTIPIKUS VARIABILITÁS

45

46 DNS-től a kromoszómákig: A DNS kromatin formájában található a sejtmagban

47 Kromatinszerkezet és szerveződés nucleosome

48

49 Nukleoszóma szerkezet

50 Hisztonok (H1, H2A, H2B, H3, H4) kis fehérjék arginin- vagy lizingazdag: pozitívan töltött kötődik a negatívan töltött DNS-hez poszt-transzlációs módosítás - csökkenti a pozitív töltést foszforiláció poli(adp) riboziálció metiláció acetiláció hiperacetiláció hiszton acetiláz laza nukleoszómák transzkripciós aktiváció hipoacetiláció hiszton deacetiláz szoros nukleoszóma transzkripciós gátlás

51 Hiszton kód: hiszton fehérjék poszt-transzlációs módosítása

52 Hiszton acetiláció a kromatin kondenzációt szabályozza Hiszton acetiláció aktiválja a transzkripciót

53 A transzkripciós aktivátorok és represszorok a kromatin szerkezetének módosításán keresztül is hatnak

54 DNS metiláció: citozin metiláció

55 A CpG dinukleotidok alulreprezentáltak a genomban A CpG előfordulása alacsonyabb a vártnál várt gyakoriság 1/16= 6.25% oka Met-citozin spontán deaminációja timidint eredményez- csökken a CpG aránya Lehetséges dinukleotid párok GG GA GT GC AG AA AT AC TG TA TT TC CG CA CT CC megfigyelt gyakoriság 1 % O NH 2 NH 2 N N CH 3 N O N deamination O O HN CH 3 HN O O N N C mc T U A genomban vannak olyan régiók ahol a CpG arány megtartott, illetve magas. Itt a CpG nem metilált. CpG szigetek. Ezek regulációs régiók.

56 A CpG szigetek kijelölik a promotereket CpG szigetek = DNS régió a várt CpG frekvenciával hossza = 200 bp -tól néhány kb-ig. CpG a szigeten belül döntően nem-metilált, míg a CpG szigeten kívül metilált. A humán genomban CpG sziget van (a genom 1-2%-a) CpG szigetek majdnem mindig promotereket és/vagy exonokat tartalmaznak. ( a gének 50-60% tartalmaz CpG szigetet. CpG szigetben található promoterek nem tartalmaznak TATA vagy DPE elemeket, de többszörös GC motívumokat tartalmaznak. - gyakran többszörös és gyenge transzkripciós starthellyel rendelkeznek (többszörös Sp1+Inr miatt ) Ez a metilációs mintázat a genomot transzkripciósan aktív és inaktív zónákra osztja.

57 A CpG szigetek kijelölik a promotereket A metilált és nem metilált CpG nem random található a genomban Metilált Nem-metilált TSS AGCGAGCGAGCGTGTATGTTCTCATTAGGGGACGATC TCGCTCGCTCGCACATACAAGAGTAATCCCCTGCTAG Hemimetilát legtöbb CpG metilált az emlős sejtekben CpG promóterekhez kapcsoltak

58 A konstitutívan működő háztartási gének promoterei CpG szigetben találhatók. Van olyan szövetspecifikus gén is, amelyiknek a promotere szintén CpG szigetben helyezkedik el. A CpG szigetben a CpG nem metilált- a promoter aktív. Metilációval a promoter inaktiválható.

59 Gének ki-be kapcsolása DNS metilációval BE: CpG sziget demetiláció KI: CPG sziget metiláció

60 DNA metiláció funkcionális következménye Metilált promoter inaktív A a CpG sziget mentes szövetspecifikus gének automatikusan metiláltak, ennek a következménye a globális inaktiváció, aminek a fenntartásához nem kellenek további elemek. Metilkötő fehérje A metilált CpG-ket a metilkötő fehérjék ismerik fel (MBP), amelyek különböző hisztonmódosító enzimeket vonzanak (HDAC-hiszton deacetiláz, HMT hiszton metil transzferáz)- következmény kromatin kondenzáció-inaktiváció. A DNS metilációnak direkt szerepe lehet a nukleoszómák pozicionálásában is.

61 DNS és hiszton modifikáció együttes szerepe a kromatin-szerkezet szabályozásában

62 CpG-ben gazdag promoterrel rendelkező idegrendszeri gének: epigenetikus szabályozás alatt állhatnak

63 Epigenetikus szabályozás az idegrendszerben egyedi gének sejtek: idegi őssejt differenciáció (fejlődés alatt felnőttben) jelátviteli folyamatok szinaptikus folyamatok plaszticitás memória hálózati aktivitás oszcilláció magatartás kóros idegi tevékenység

64 Szinaptikus plaszticitás epigenetikus szabályozása

65 Epigenetikus szabályozás zavara: idegrendszeri betegségek

66

67 Reelin és a GAD76 promoter hipermetilációja skizofréniás betegek preforntális cortexében DNMT promoter metiláció Reelin/GAD67 csökkent gátlás dendrit tüske változások oscillációs zavarok kognitív zavarok

68 Génműködés poszt-transcripciós szabályozása RNS interferenciával (géncsendesítés) RNS-RNS interakción alapszik poszt-transzkripciós szinten hat mrns-t inaktivál (transzlációt gátol) mrns-t szinetet csökkent (degradál) Szabályozó nem fehérjekódoló RNS-ek (npc) Eukarióta gén mrns + npc RNS Fehérje

69 A genomban fehérjét nem-kódoló RNS gének is találhatók, amelyek szabályozó RNS-eket kódolnak

70 Génműködés szabályozása genom kódolt mikro-rns-ekkel MicroRNS-ek Kisméretű nem-kódoló RNS család, amely szekvencia specifikusan szabályozza a génexpresszió különböző szintjeit.

71 Micro-RNS-ek képződés és hatásának mechanizmusa

72

73

74 A micro RNS-ek az idegrendszer fejlődésének minden lépést szabályozzák

75 Micro RNS-ek szerepe a szinaptikus tüske plaszticitás szabályozásában micrns-ek transzkripciós faktorokon, deacetilázokon, kinázokon és növekedési faktorokon keresztül szabályozzák az aktin citoszkeleton komponenseit serkentő gátló

76 Micro-RNS-ek és az Alzheimer kór mirns-ek szabályozzák az APP mrns és a BACE1 processzáló enzimet kódoló mrns szintjét.

77 An overview of selected mirnas associated with neurological disorders mirna Disease Dysregulation Target mir-9/9* Huntington disease Downregulated mir-29a AD Downregulated NAV3 REST (mir-9) CoREST (mir-9*) Consequence of mirna dysregulation Excessive amount of REST and CoREST in the nucleus Inactivation of neuron-specific genes NAV3 coexpressed tau neurofibrillary tangles in pyramidal neurons mir-29a,-29b-1 Sporadic AD Downregulated BACE1 Increase of amyloid-β mir-106b AD Downregulated APP Increase of amyloid-β mir-107 AD Downregulated BACE1 Increase of amyloid-β mir-124 FXS Downregulated Decreased neuronal maturation mir-133b PD Upregulated Pitx3 mir-146a/b Rett syndrome Downregulated Irak1 Repression of neuronal maturation An increase in the amount of Irak1 puts the brain into an inflammatory state Upregulated in GRIA2 mir-181b Schizophrenia Decrease in neuronal outgrowth prefrontal cortex VSNL1 mir-298 and -328 AD Unknown BACE1 Increase of amyloid-β mir-342-3p Prion disease Upregulated mir-485-5p AD Downregulated in entorhinal cortex and hippocampus BACE1 Increase of amyloid-β

78 Poszttranszkripciós szabályozás: RNS editálás (editing) RNS-ben a DNS által kódolt nukleotid (bázis) enzimatikus reakcióval történő megváltoztatása C-U A-I editing guanozin a kodon szempontjából adenozin dezaminálás inozin kodon változás adenozin dezamináz (ADAR) aminósav csere

79 A/I editálás az RNS különböző helyein történhet mrns kódoló régió- kodon változás- aminósav csere - fehérje funkció változás UTR megváltozik az mrns transzlációja, lokalizációja vagy stabilitás intron/splice brach site - megválozik az altertnative splicing - új fehérje izoforma STOP kodon eliminálódik- kódoló régió hosszabb Nem-kódoló RNS- mirns biogenezis (szint) szbályozása funkció szabályozása?

80

81 A/I RNS editálás hatása neuronális receptor és csatorna funkcióra K V 1.1 I/V csere kapcsolat a K V b1.1-el Ca v 1.3 IQ-MR csere calmodulin kötés 0 GluA2- Q/R csere Ca ++ permeábilitás ER exit 5-HT 2C I-N-I/ V-S(N)-V csere G-protein kötés GABA A 3 I/M csere membrán trafficing

82 editált genom kódolt

83 mrns anatómiája Az mrns a fehérje kódoláson kívül olyan szekvenciákat és struktúrákat tartalmaz, amelyekhez fehérjék kötődve szabályozzák a transzlációt, transzportot, lokalizációt és stabilitást. 5 -UTR+ faktorok transzláció hatásfoka 3 -UTR+ faktorok mrns transzport stabilitás transzláció

84 Lokális fehérjeszintézis az idegrendszer sejtjeinek nyúlványaiban Előfordul: dedritek axonok- növekedés, cél-megtatlás, sérülés glia-nyúlványok oligodendroglia- mielinizáció Asztrocita-GFAP Aktivitás függő transzláció a dendritekben lehetővé tesz szinapszisok morfológiájának és aktivitásának egyedi szabályozását

85 RNS transzport és lokális fehérjeszintézis szignál mrns inaktív aktív

86 Lokalizációs szignálok idegsejt-specifikus mrns-ek 3 - nem-transzlálódó (3 -UTR) régiójában

87 Transzláció szabályozása a dendritekben Neurotranszmitter receptor kapcsolt útvonalak serkentő szinapszisok esetében BDNF R szignál függő kinázok foszforiláció RNS kötő fehérjék mirns általános RNS specifikus

88 Hosszú 3 -UTR-t tartalmazó BDNF mrns a dendritekbe transzportálódik és itt transzlálódik. Dendritikus BDNF szabályozza a dendrit tüske morfológiáját és a szinaptikus plaszticitást.

89 A CamK2 mrna hosszú 3 -UTR-t eltávolítva megszűnik a dendritikus lokalizáció és zavart szenved a szinaptikus plaszticitás.

90 Szinaptikus aktivitás stimulálja az Arc transzkripcióját és a lokális transzlációját. Arc modulálja szinaptikus plaszticitást az AMPA receptorok endocitózisán keresztül.

91 CREB lokális transzlációja az axonban NGF hatására. Majd retrográd transzportálódik a sejtmagba és NGF reszponzív géneket aktivál.

92 A RanBP1 és importinb lokális szintézise az axonba hozzájárul a retrográd transzport jelátviteli komplex létrehozásában a sérülést követően.

93 A denritekben lokálisan szintetizálódott fehérjék szerepe a hippocampalis LTP-ben

94

95 A c-fos gén transzkripciójának Ca++-függő szabályozása

96 Neuronális aktivitás RNS kötő fehérjék Ca++ függő foszforilációján és hiszton modifikáción keresztül szabályozza az alternatív splicing-ot

97 Szövetspecifkus alternatív exon a fehérje-fehérje kölcsönhatást is szabályozza

98 Az RNS editálás megváltoztatja humán felszültségfüggő kálium csatorna tulajdonságait