Celluláris és molekuláris neurobiológia SzJDI őszi félév. Neuron-specifikus génműködés. Szabó Gábor MTA KOKI

Átírás

1 Celluláris és molekuláris neurobiológia SzJDI őszi félév Neuron-specifikus génműködés Szabó Gábor MTA KOKI

2 Génexpressziós szintek Génhez való hozzáférés kromatin DNS metiláció kromatin mdifikáció Átírás epigentika cisz és transzelemek akivitás függő RNS érés (processing) alternatív splicing mrns szabályozás mikrorns-ek editálás epigentika Transzláció lokális aktivitás függő

3 Génexpresszió kapcsolt lépései

4 Transzkripciós egység-génszerkezet 5 3 szabályozó régió kódoló régió

5 mrns képződés transzkripció+ processing + transzport

6 Transzkripció szabályozásának elemei cisz elemek - DNS szabályozó elemek gének részei- promoterek, transzkripciós faktor kötőhelyek, enhancerek (silencerek) (elhelyezkedésük 5 -vég, 3 -vég, intronok, kódoló régió) - mrns leader szekvenciák transz elemek - az adott géntől független faktorok - fehérjék (más gének termékei) - transzkripciós faktorok (aktivátorok, represszorok) cisz elemekhez kötődnek - kofatorok (ko-aktivátorok, ko-represszorok) transzkripciós faktorokhoz kötődnek

7 polimeráz II- RNS szintetizáló enzim mrns-kódoló gének mikrorns-kódoló gének promoter Promoter felépítése core promoter ( -40 to +40 a TSS-hez viszonyítva) promoter proximális régió - upstream regulációs elemeket tartalmaz Promoter típusok house keeping - TATA nélküli CpG sziget szövetspecifikus- TATA/CAAT szövetspecifikus elemek indukálható/fejlődés szabályozott promoter

8 Promoter elemek (RNS polimeráz II) BRE - TFIIB kötő elem DPE - downstream promoter elem Inr - iniciátor régió

9 Az általános upstream elemek az iniciáció frekvenciáját növelik: elősegítik azt, hogy a bazális transzkripciós faktorok iniciációs komplex-szé szerveződjenek upstream promoter elemek

10 Transzkripciós faktorok -transz ható elemek - regulációs fehérjék aktivátorok, vagy inhibítorok Funkcionális doménjeik - DNS kötő domén - promoter, vagy enhancer DNS elemekhez kötődik - Aktivációs domén - transzkripciós faktorokkal, ko-aktivátorokkal, ko-represszorokkal, vagy közvetlenül az RNS polimeráz komplex-szel lép kapcsolatban - Dimerizációs domén: dimér formájában működnek Egyéb faktorokkal transzkripciós komplexet képeznek és serkentik, vagy gátolják az RNS polimeráz kötődését a promoterhez.

11 Transzkripciós faktorok osztályozása 1. Általános transzkripciós faktorok TFIID, TFIIB, TFIIA, TFIIH, TFIIE, TFIIF Közvetlenül az RNS polimeráz működéséhez kell. Minden sejtben megtalálható. 2. Minden sejtben jelenlévő transzkripciós faktorok sok gén transzkripcióját aktiválja (SP1, CCAAT-box kötő fehérje ) 3. Szövetspecifikus transzkripciós faktorok Specifikus trasz-elemhez kötődik Adott sejttípusban fejeződik ki Szövetspecifikus géneket aktivál

12 Transzkripciós faktorok kötődése a cisz DNS elemekhez

13 A humán genomban található transzkripciós faktor gének Venter et al al al (2001) Science 291, 1304-

14

15 Enhancerek (silencerek) Cis regulációs elemek: aktivátorok, gátlók ( silencerek ) Promoterektől a következőkben térnek el: 1. Enhancerek működéséhez szükségesek a promoterek (promoterek enhancerek nélkül is működnek, bár gyengén) 2. Az enhancerek a transzkripciós starthelytől távol is működnek, a promoterek nem 3. fordított orientációban is működnek 4. a transzkripciós kezdőhely mögött is működnek 5. enhancerek nagyon távoli helyekről is működnek A transzkripciót térben és időben szabályozottan fokozzák, vagy gátolják működésükhöz szükséges a transzkripciós alap-apparátus. A transzkripció iniciációját serkentik, vagy gátolják.

16 Az enhancerhez kötődő aktivátor fehérjék a transzkripciós komplexhez kötődnek és növelik a transzkripció hatásfokát

17 Komplex enhancerek

18 Represszorok Represzorok silencerekhez kötődnek gátolják az aktivátorok kötődését közvetlenül gátolják az aktivátort közvetlenül kötődnek az általános transzkripciós faktorokhoz

19 A transzkripció szabályozásában résztvevő transz elemek

20 Szövetspecfikus transzkripciós szabályozás: szövetspecifikus enhancerektranszkipicós faktorok

21 Tipikus emlős génregulációs régió Az emlős géneket a promotereken kívül több enhancer és silencer szabályozza. Egy tipikus enhancer 500 bp hosszú 10 Kötőhelyet tartalmaz, amelyhez legalább háromféle transzkripciós faktor, valamint 2 különböző aktivátor és egy represszor kötődik.

22 Nukleáris hormon receptorok: ligand függő transzkripciós faktorok szteroid hormonok tiroid hormonok retinidok D vitamin

23 Nukleáris hormon receptorok szerkezete

24 Nukleáris hormonreceptorok működési mechanizmusa NR ligand nélkül inaktív komplexet képez a citplzmában (hsp90) Ligand kötés-nukleáris transzlokáció DNS elemhez kapcsolódik koaktivátorokkal és más fehérjékkel Gén transzkripció beindul Más transzkripciós faktorokhoz is kapcsolódhat (NFkB, AP-1) Indirekt transzkripciós szabályozás

25 Aktivitás függő transzkripciós szabályozás az idegrendszerben

26 Szignál specifikus transzkripciós komplexek az idegsejtekben Különböző stimulusok hatására CaMP és Ca ++ reszponzív elemekhez kapcsolódnak a foszforiláció után a faktorok. Beindítják a c-fos és Bdnf transzkripciót.

27 CREB függő gén expressziós kaszkád aktivitása szükséges a neuronális plaszticitáshoz és a memóriához szignálok neurotranszmittertek növekedési faktorok depolarizáció stress kinázok CREB foszforiláció C/EBP TF gén aktiváció késői gének aktivációja plaszticitás memória

28 A c-fos gén transzkripciójának Ca++-függő szabályozása

29

30 RNS összeszerelődés (processing) cap splicing polia

31 Alternatív splicing A gének exonjaiból a kódoló régiók több féle módon szerelődhetnek össze A genom kódoló kapacitását növeli Fehérjék funkcionális komplexitását növeli eltérő N-, vagy C-terminális régió eltérő domén szerkezet funkcionális eltérés változik a szubcelluláris lokalizáció poszt-transzlációs modifikáció fehérje-fehérje kölcsönhatás mrns-ek nem-kódoló régióinak diverzitása RNS szintű szabályozás RNS szint,targetálás, stabilitás transzláció szabályozása (microrns kötődés) Lehet fejlődés és szövetspecifikus és aktivitás függő is

32 Alternatív splicing típusok

33 Splicing mechanizmus

34 Alternatív splicing mechanizmussal egy génről többféle mrns és fehérje képződik -tropomyosin gén

35 Splicing világbajnok a Drosophila Dscam1 (Down Syndrom cell adhesion molecule) gén A DScam1 izoformák a dendrit arborizációt a dendrit típusok között átfedést szabályozzák.

36 Alternatív splicing az idegrendszerben Alternatív splicing eredményeképpen képződő receptor, ioncsatorna, enzim, jelátviteli fehérje és strukturális fehérje (sejtváz, sejtadhézió) formák funkcionális tulajdonságai lokalizációja, membrán kötődése interakciói különbözőek lehetnek. Vannak idegsejt specifikus splicig faktorok. Az alternatív splicing-et a neuronális aktivitás is szabályozhatja.

37 A glutamáterg és GABAerg szinapszis képződést (gátló vagy serkentő szinaptikus specializáció) a preszinaptikus neurexin és a posztszinaptikus neuroligin alternatív spilce formái határozzák meg 3 neurxin génről összesen több mint 1000 izoforma képződhet (5 altenetív exon és 2 promoter) 4/5 neuroliging gén 2-2 splice formája 8-10 izoformát kódol. A kettő nagyszámú kombinációja sokféle gátló és serkentő szinaptikus kapcsolat kialakítását szabályozhatja

38 AChE alternatív splicing: különböző szerkezetű és lokalizációjú enzimet eredményez intron retenció alternatív 3 exon alternatív 3 exon hidrifil monomér membrán-kötött dimér VVS membrán kapcsolt tetramer szinaptikus membrán kötött

39 AMPA receptor alternatív splicing: flip/flop variánas Q/R editing a Ca ++ permeábilitást szabályozza Flip/Flop AS és az R/G editing a deszenzitzácót szabályozza

40 Kaninát receptor splice variánsok különböző C-terminális doménnel rendelkeznek Eltérő C-erminális határozza meg a membránba való beépülést

41 Szövetspcifkus alternatív exon a fehérje-fehérje kölcsönhatást is szabályozza

42 Neuronális aktivitás RNS kötő fehérjék Ca++ függő foszforilációján keresztül szabályozza az alternatív splicing-ot

43 Idegrendszerben működő splicing faktorok

44 A hippocampus CA1 régiójában az NMD receptor aktiváció által kiváltott LTP-hez szükséges a NOVA2 splicing faktor NOVA2 KO egér: sipsc, LTP NOVA2 alternatív splicing NMDAR GABABR2 GIRK2 sipsc (lassú gátló posztszinaptikus áram) LTP

45 Szinaptikus mrns-ek, amelyek alternatív splicing-jét a NOVA szabályozza

46 Génműködés epigenetikus szabályozása Olyan változások, amelyek a genom változtatása nélkül hatással vannak a fenotípusra. Egy sejt tulajdonságainak örökletes megváltozása, amely nem jár együtt a genetikai információ megváltozásával. Génműködés epigenetikus szabályozása: Nem függ közvetlenül az adott gén regulációs DNS elemeitől kromatin (hiszton) módosítás DNS metiláció RNS interferencia RNS editálás

47 Epigenetikus hatások: kapcsolat a környezet és a genom között Környezeti hatások eltérő egyedi következményei: egyedi epigenetikus variabilitás

48

49 DNS-től a kromoszómákig: A DNS kromatin formájában található a sejtmagban

50 Kromatinszerkezet és szerveződés nucleosome

51

52 Nukleoszóma szerkezet

53 Hisztonok (H1, H2A, H2B, H3, H4) kis fehérjék arginin- vagy lizingazdag: poztitíven töltött kötődik a negatívan töltött DNS-hez poszt-transzlációsan módosított - csökkenti a pozitív töltést foszforiláció poli(adp) riboziálció metiláció acetiláció hiperacetiláció hiszton acetiláz laza nukleoszómák transzkripciós aktiváció hipoacetiláció hiszton deacetiláz szoros nukleoszóma transzkripciós gátlás

54 Hiszton kód: hiszton fehérjék poszt-transzlációs módosítása

55 Hiszton acetiláció a kromatin kondenzációt szabályozza Hiszton acetiláció aktiválja a transzkripciót

56 A transzkripciós aktivátorok és represszorok a kromatin szerkezetének módosításán keresztül is hatnak

57 DNS metiláció: citozin metiláció

58 A CpG dinukleotidok alulreprezentáltak a genomban A CpG előfordulása alacsonyabb a vártnál várt gyakoriság 1/16= 6.25% oka Met-citozin spontán deaminációja timidint eredményez- csökken a CpG aránya Lehetséges dinukleotid párok GG GA GT GC AG AA AT AC TG TA TT TC CG CA CT CC megfigyelt gyakoriság 1 % deamination N NH 2 N NH 2 CH 3 O HN CH 3 HN O O N O N O N O N C mc T U

59 A CpG szigetek kijelölik a promotereket CpG szigetek = DNS régió a várt CpG frekvenciával hossza = 200 bp -tól néhány kb-ig. CpG a szigeten belül döntően nem-metilált, míg a CpG szigeten kívül metilált. A humán genomban CpG sziget van (a genom 1-2%-a) CpG szigetek majdnem mindíg promotereket és/vagy exonokat tartalmaznak. ( a gének 50-60% tartalmaz CpG szigetet. CpG szigetben található promoterek nem tartalmaznak TATA vagy DPE elemeket, de többszörös GC motívumokat tartalmaznak. - gyakran többszörös és gyenge transzkripciós starthellyel rendelkeznek (többszörös Sp1+Inr miatt ) Ez a metilációs mintázat a genomot transzkripciósan aktív és inaktív zónákra osztja.

60 A CpG szigetek kijelölik a promotereket A metilált és nem metilált CpG nem random található a genomban Metilált Nem-metilált TSS AGCGAGCGAGCGTGTATGTTCTCATTAGGGGACGATC TCGCTCGCTCGCACATACAAGAGTAATCCCCTGCTAG Hemimetilát legtöbb CpG are metilált az emlős sejtekben CpG promóterekhez kapcsoltak

61 A konstitutívan működő háztartási gének promoterei CpG szigetben találhatók. Van olyan szövetspecifikus gén is, amelyiknek a promotere szintén CpG szigetben helyezkedik el. A CpG szigetben a CpG nem metilált- a promoter aktív. Metilációval a promoter inaktiválható.

62 Gének ki-be kapcsolása DNS metilációval BE: CpG sziget metiláció KI: CPG sziget metiláció

63 DNA metiláció funkcionális következménye Metilált promoter inaktív A a CpG sziget mentes szövetspecifikus gének automatikusan metiláltak, aminek a következménye a globális inaktiváció, aminek a fenntartásához nem kellenek további elemek. Metilkötő fehérje A metilált CpG-ket a metilkötő fehérjék ismerik fel (MBP), amelyek különböző hisztonmódosító enzimeket vonzanak (HDAC-hiszton deacetiláz, HMT hiszton metil transzferáz)- következmény kromatin kondenzáció-inaktiváció. A DNS metilációnak direkt szerepe lehet a nukleoszómák pozicionálásában is.

64 DNS és hiszton modifikáció együttes szerepe a kromatinszerkezet szabályozásában

65 CpG-ben gazdag promoterrel rendelkező idegrendszeri gének: epigenetikus szabályozás alatt állhatnak

66 Epigenetikus szabályozás az idegrendszerben egyedi gének sejtek: idegi őssejt differenciáció (fejlődés alatt felnőttben) jelátviteli folyamatok szinaptikus folyamatok plaszticitás memória hálózati aktivitás oszcilláció magatartás kóros idegi tevékenység

67 Szinaptikus plaszticitás epigenetikus szabályozása

68

69 Reelin és a GAD76 promoter hipermetilációja skizofréniás beteg preforntális cortexében DNMT promoter metiláció Reelin/GAD67 csökkent gátlás dendrit tüske zavarok

70 Génműködés poszt-transcripciós szabályozása RNS interferenciával (géncsendesítés) RNS-RNS interakción alapszik poszt-transzkripciós szinten hat mrns-t inaktivál (transzlációt gátol) mrns-t szinetet csökkent Szabályozó nem fehérjekódoló RNS-ek (npc) Eukarióta gén mrns + npc RNS Fehérje

71 A genomban nem-kódoló RNS gének is találhatók, amelyek szabályozó RNS-eket kódolnak

72 Génműködés szabályozása genom kódolt mikro RNS-ekkel MicroRNS-ek Kisméretű nem-kódoló RNS család, amely szekvencia specifikusan szabályozza a génexpresszió különböző szintjeit.

73 Micro-RNS-ek képződés és hatásának mechanizmusa

74

75

76 A micro RNS-ek az idegrendszer fejlődésének minden lépést szabályozzák

77 Micro RNS-ek szerepe a szinaptikus tüske plaszticitás szabályozásában micrns-ek transzkripciós faktorokon, deacetilázokon, kinázokon és növekedési faktorokon keresztül szabályozzák az aktin citoszkeleton komponenseit serkentő gátló

78 Micro-RNS-ek és az Alzheimer kór mirns-ek szabályozzák az APP mrns és a BACE1 processzáló enzimet kódoló mrns szintjét

79 An overview of selected mirnas associated with neurological disorders mirna Disease Dysregulation Target mir-9/9* Huntington disease Downregulated mir-29a AD Downregulated NAV3 REST (mir-9) CoREST (mir-9*) Consequence of mirna dysregulation Excessive amount of REST and CoREST in the nucleus Inactivation of neuron-specific genes NAV3 coexpressed tau neurofibrillary tangles in pyramidal neurons mir-29a,-29b-1 Sporadic AD Downregulated BACE1 Increase of amyloid-β mir-106b AD Downregulated APP Increase of amyloid-β mir-107 AD Downregulated BACE1 Increase of amyloid-β mir-124 FXS Downregulated Decreased neuronal maturation mir-133b PD Upregulated Pitx3 mir-146a/b Rett syndrome Downregulated Irak1 Repression of neuronal maturation An increase in the amount of Irak1 puts the brain into an inflammatory state Upregulated in GRIA2 mir-181b Schizophrenia Decrease in neuronal outgrowth prefrontal cortex VSNL1 mir-298 and -328 AD Unknown BACE1 Increase of amyloid-β mir-342-3p Prion disease Upregulated mir-485-5p AD Downregulated in entorhinal cortex and hippocampus BACE1 Increase of amyloid-β

80 RNS editálás (editing) RNS-ben a DNS által kódolt nukleotid (bázis) enzimatikus reakcióval történő megváltoztatása C-U A-I editing guanozin a kodon szempontjából adenozin dezaminálás inozin kodon változás adenozin dezamináz (ADAR) aminósav csere

81 A/I editálás az RNS különböző helyein történhet mrns kódoló régió- kodon változás- aminósav csere - fehérje funkció változás UTR megváltozik az mrns transzlációja, lokalizációja vagy stabilitás intron/splice brach site - megválozik az altertnative splicing - új fehérje izoforma STOP kodon elominálódik- kódoló régió hosszabb Nem-kódoló RNS- mirns biogenezis (szint) szbályozása funkció szabályozása?

82

83 I/A RNS editálás hatása neuronális receptor és csatorna funkcióra K V 1.1 I-V csere kapcsolat a K V b1.1-el Ca v 1.3 IQ-MR csere calmodulin kötés 0 GluA2- Q/R csere Ca ++ permeábilitás ER exit 5-HT 2C I-N-I/ V-S(N)-V csere G-protein kötés GABA A 3 I/M csere membrán trafficing

84

85

86 Lokális fehérjeszintézis az idegrendszer sejtjeinek nyúlványaiban Előfordul: dedritek axonok- növekedés, cél-megtatlás, sérülés glia-nyúlványok oligodendroglia- mielinizáció Asztrocita-GFAP Aktivitás függő transzláció a dendritekben lehetővé tesz szinapszisok morfológiájának és aktivitásának egyedi szabályozását

87 mrns anatómiája Az mrns a fehérje kódoláson kívül olyan szekvenciákat és struktúrákat tartalmaz, amelyekhez fehérjék kötődve szabályozzák a transzlációt, transzportot, lokalizációt és stabilitást. 5 -UTR+ faktorok transzláció hatásfoka 3 -UTR+ faktorok mrns transzport stabilitás transzláció

88 RNS transzport és lokális fehérjeszintézis szignál mrns inaktív aktív

89 Lokalizációs szignálok idegsejt-specifikus mrns-ek 3 - nem-transzlálódó (3 -UTR) régiójában

90 Transzláció szabályozása a dendritekben Neurotranszmitter receptor kapcsolt útvonalak serkentő szinapszisok esetében BDNF R szignál függő kinázok foszforiláció RNS kötő fehérjék mirns általános RNS specifikus

91 Hosszú 3 -UTR-t tartalmazó BDNF mrns a dendritekbe transzportálódik és itt transzlálódik. Dendritikus BDNF szabályozza van a dendrit tüske morfológiáját és a szinaptikus plasztictást.

92 A CamK2 mrna hosszú 3 -UTR-t eltávolítva megszűnik a dendritikus lokalizáció és zavart szenved a szinaptikus plaszticitás.

93 Szinaptikus aktivitás stimulálja az Arc transzkripcióját és a lokális transzlációját. Arc modulálja szinaptikus plaszticitást az AMPA receptorok endocitózisán keresztül.

94 CREB lokális transzlációja az axonban NGF hatására. Majd retrográd transzportálódik a sejtmagba és NGF reszponzív géneket aktivál.

95 A RanBP1 és importinb lokális szintézise az axonba hozzájárul a retrográd transzport jelátviteli komplex létrehozásában a sérülést követően.

96 A denritekben lokálisan szintetizálódott fehérjék szerepe a hippocampalis LTP-ben

97